Phân lập và tuyển chọn một số vi sinh vật từ phân voi ứng dụng trong xử lí vỏ cây nha đam tạo thành phân compost

Bài viết tiến hành tuyển chọn các chủng vi sinh từ phân voi có tiềm năng phân giải phế phẩm nông nghiệp giàu cellulose nhằm tận dụng triệt để phân voi vào quá trình xử lí chất thải. Kết quả phân lập, làm thuần vi sinh từ mẫu phân voi tươi thu được 11 chủng vi khuẩn và 3 chủng nấm mốc.

TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Tập 19, Số (2022): 481-491 ISSN: 2734-9918 HO CHI MINH CITY UNIVERSITY OF EDUCATION JOURNAL OF SCIENCE Vol 19, No (2022): 481-491 Website: http://journal.hcmue.edu.vn https://doi.org/10.54607/hcmue.js.19.3.3395(2022) Bài báo nghiên cứu * PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ VI SINH VẬT TỪ PHÂN VOI ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÍ VỎ CÂY NHA ĐAM TẠO THÀNH PHÂN COMPOST Lê Hùng Anh1, Phạm Thị Thanh Hiền1, Phan Thị Phượng Trang2* Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam * Tác giả liên hệ: Phan Thị Phượng Trang – Email: ptptrang@hcmus.edu.vn Ngày nhận bài: 18-3-2022; ngày nhận sửa: 24-3-2022; ngày duyệt đăng: 25-3-2022 TÓM TẮT Tại Việt Nam, voi thường tìm thấy khu vực Tây Nguyên, đặc biệt Đắk Lắk Voi tiều thụ lên đến 300 kg thức ăn giàu chất xơ, cellulose giải phóng 100 đến 130 kg phân ngày Trong báo này, tiến hành tuyển chọn chủng vi sinh từ phân voi có tiềm phân giải phế phẩm nông nghiệp giàu cellulose nhằm tận dụng triệt để phân voi vào trình xử lí chất thải Kết phân lập, làm vi sinh từ mẫu phân voi tươi thu 11 chủng vi khuẩn chủng nấm mốc Các chủng kiểm tra hoạt tính phân giải cellulose định danh theo phương pháp MALDI TOF theo khóa phân loại Bergey Kết định danh cho thấy có chủng Staphyloccoccus aureus, chủng Bacillus subtilis chủng nấm mốc Aspergillus fumigatus Aspergillus niger Sau định danh, chủng tăng sinh phối trộn với chất mang gồm cám gạo, bột bắp với tỉ lệ 5:3 để tạo chế phẩm có mật độ 1x1010 CFU/g Đánh giá khả phân giải chế phẩm thu đối tượng vỏ nha đam với quy mơ phịng thí nghiệm đem lại kết khả quan Đây tiền đề việc ứng dụng chế phẩm có nguồn gốc từ phân voi vào thực tế giúp cải thiện tình trạng mơi trường Từ khóa: nha đam; vi sinh vật; compost; phân voi Giới thiệu Cây nha đam (lô hội) từ xưa xem nguồn dược liệu vô giá Đông y Tây y Cây nha đam có tên gốc tiếng Latin Aloe vera, thuộc họ Lillaceae có đến khoảng 240 loài khác toàn giới (FMI, 2016) Ở nước ta, vùng đất cát ven biển thành phố Phan Rang – Tháp Chàm (Ninh Thuận) trở thành vùng chuyên canh trồng nha đam với khoảng 140 Cây nha đam chế biến thành nhiều sản phẩm phục vụ sống thực phẩm, dược phẩm, mĩ phẩm Do vậy, lượng phế Cite this article as: Le Hung Anh, Pham Thi Thanh Hien, & Phan Thi Phuong Trang (2022) Isolation and selection of microorganisms from elephant dung for composting of aloe vera bark Ho Chi Minh City University of Education Journal of Science, 19(3), 481-491 481 Tập 19, Số (2022): 481-491 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM phẩm nha đam chủ yếu phần vỏ giàu cellulose thải môi trường lớn chủ yếu xử lí phương pháp chơn lấp vốn khơng hiệu tốn kém, gây mùi khó chịu độ ẩm cao Vì vậy, việc nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học chứa vi sinh vật phân giải cellulose quan tâm, đặc biệt chủng vi sinh vật có nguồn gốc từ đường tiêu hóa động vật ăn cỏ Các chủng vi sinh vật thường có khả sinh cellulase phức hệ enzyme có khả thủy phân cellulose thành đường thơng qua thủy phân liên kết β-1,4-glucoside từ ứng dụng phân giải hiệu phụ phẩm cellulose rác thải hữu Trên thực tế, Việt Nam có số nghiên cứu vi sinh vật phân giải cellulose ứng dụng xử lí chất thải làm phân bón hữu (Vo & Cao, 2011), (Nguyen, 2018) hay tạo chế phẩm với mật độ tế bào vi sinh đạt 108 CFU/g đưa quy trình xử lí chế biến phế thải chăn ni làm phân bón hữu sinh học quy mô nông hộ (Vu, 2011) Trên giới, việc phân lập nghiên cứu chủng vi sinh vật phân giải cellulose có nguồn gốc từ mơi trường nhận nhiều quan tâm nghiên cứu Mohd Lokman Che Jusoh cộng (2013) đánh giá hiệu việc ủ rơm ảnh hưởng vi sinh đến chất lượng phân hữu (Jusoh, Manaf, & Latiff, 2013) Hay nghiên cứu năm 2014, Ấn Độ, Behera cộng phân lập vi khuẩn phân giải cellulose từ đất rừng đước xác định lồi Micrococcus, Baccilus, Pseudomonas (Behera, Arora, Nandhagopal, & Kumar, 2014) Đặc biệt, năm 2015, Rajarshi Saha phân lập VSV phân giải cellulose từ phân voi châu Á cho thấy tiềm sử dụng loại phân để xử lí chất thải hữu từ môi trường (Saha, 2015) Voi loài động vật ăn cỏ với nguồn thức ăn đa dạng Tại Việt Nam, voi thường tìm thấy khu vực Tây Nguyên, đặc biệt Đắk Lắk Voi tiêu thụ đến gần 300 kg thức ăn giải phóng đến 130 kg phân ngày Phân voi chứa lượng lớn chất xơ bao gồm cành cây, sợi hạt chưa tiêu hóa khác với trâu bị, voi có cấu trúc dày đơn (Sannigrahi, 2015) Hiện nay, nước chưa có nhiều nghiên cứu liên quan đến lồi voi vấn đề sinh học, môi trường liên quan đến loài động vật quý Các nghiên cứu nước dừng lại việc khẳng định phân voi nguồn nguyên liệu tốt để ủ compost phân voi tồn số chủng phân giải cellulose tốt, mà chưa tiến hành định danh sử dụng chủng vi sinh vật vào chế phẩm sinh học Chính vậy, nghiên cứu tiến hành phân lập tuyển chọn số vi sinh vật từ phân voi ứng dụng xử lí vỏ nha đam tạo thành phân compost Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Phân lập làm vi sinh vật Ba mẫu phân voi thu nhận từ đàn voi trại voi Buôn Đôn, tỉnh Đắk Lắk bảo quản lạnh trước vận chuyển đến Trung tâm Khoa học Cơng nghệ Sinh 482 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Lê Hùng Anh tgk học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh để phân lập vi sinh vật cách pha lỗng trải mơi trường đặc trưng: mơi trường LB dành cho vi khuẩn, môi trường Czapek Dox dành cho nấm mốc, phân lập nấm men môi trường Hansen xạ khuẩn môi trường Gause Sau 1-2 ngày khuẩn lạc khác mọc, đánh dấu khuẩn lạc cấy truyền liên tục sang môi trường thạch nghiêng thu giống (khi quan sát kính hiển vi có loại tế bào) 2.2 Khảo sát khả phân giải cellulose Chấm chủng vi sinh phân lập mơi trường CMC Sau 24-48 giờ, dùng thước kẻ có chia mm đo đường kính khuẩn lạc (kí hiệu d) sau nhỏ dung dịch lugol lên mơi trường xung quanh khuẩn lạc Enzym cellulase từ vi sinh vật tiết môi trường phân giải CMC xung quanh khuẩn lạc tạo thành vịng thủy phân khơng màu thử với thuốc nhuộm lugol Dùng thước đo đường kính vịng thủy phân (kí hiệu D) Căn tỉ lệ vịng thủy phân đường kính khuẩn lạc để đánh giá khả phân giải cellulose chủng phân lập theo công thức = D/d 2.3 Định danh chủng vi sinh vật Định danh vi khuẩn hệ thống MALDI Biotyper sử dụng khối phổ MALDI – TOF để xác định dấu ấn protein đặc trưng sinh vật nhằm định danh vi khuẩn cụ thể cách so sánh với thư viện phổ dòng vi khuẩn/ vi nấm sẵn có Định danh nấm mốc dựa vào hình thái, màu sắc khuẩn lạc đặc điểm vi thể loài theo “Bảng phân loại định danh nấm” Đặng Vũ Hồng Miên (Dang, 2015) phương pháp Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (Bergey, 1994) 2.4 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học phân giải cellulose dạng bột Đối với vi khuẩn Bacillus: tăng sinh cấp với 100 ml cao thịt pepton lắc 24 30-37oC, tăng sinh cấp với 3000 ml cao thịt pepton lắc 2-3 ngày Đối với nấm mốc Aspergillus: cấy sinh khối nấm vào lúa xử lí (vớt lép, luộc nứt vỏ + 5% cám + 0,1% MgSO4, cho vào túi 500 g) để 15 ngày để nấm tăng sinh khối Thu sinh khối vi sinh vật sau trình tăng sinh cấp tạo bào tử, phối trộn với 10 kg chất mang gồm cám gạo bột bắp theo tỉ lệ: 3:5, ủ hổn hợp 60oC 4-5 ngày để hỗn hợp khô hồn tồn Nghiền mịn, trộn đóng gói bảo quản Chế phẩm bột kí hiệu PV Chế phẩm PV phân tích thành phần lí hóa tiêu vi sinh Trung tâm Khoa học Công nghệ Sinh học 2.5 Đánh giá hiệu chế phẩm sinh học thu ủ compost đối tượng vỏ nha đam với quy mơ phịng thí nghiệm Thí nghiệm thực xơ nhựa lít, khoan lỗ có nắp đậy, bố trí thí nghiệm theo cơng thức (CT) với thành phần khối lượng sau: CT1.1: kg nha đam + kg xơ dừa + chế phẩm PV CT1.2: kg nha đam + kg xơ dừa + chế phẩm EM FERT1 (đối chứng) CT1.3: kg nha đam + kg xơ dừa 483 Tập 19, Số (2022): 481-491 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Trong đó, 12 kg vỏ nha đam cắt nhỏ với kích thước khoảng cm chia thành phần nhau, hòa trộn xơ dừa theo công thức Liều lượng chế phẩm sử dụng g/1 kg nguyên liệu ủ (sử dụng 30 g chế phẩm cho xô) Trộn nguyên liệu với chế phẩm theo công thức định sẵn, kiểm tra độ ẩm, sau đậy nắp, để nơi thống mát Theo dõi ghi chép thông số tuần ủ bao gồm: độ ẩm, màu sắc, mùi, độ hoai, độ sụt giảm thể tích, khối lượng Sau kết thúc thí nghiệm: phân tích đánh giá chất lượng phân qua thông số hàm lượng N, P, K, tổng hữu cơ, mật độ vi sinh vật Kết thảo luận 3.1 Phân lập làm vi sinh vật Mẫu phân voi pha loãng cấy trải môi trường thạch LB để phân lập vi khuẩn, ủ nhiệt độ 37oC 24 Kết thu 11 khuẩn lạc đặc trưng để làm mơi trường LB, vị trí hình thái khuẩn lạc mơ tả Hình Hình Kết phân lập vi khuẩn mơi trường LB Hình Kết phân lập nấm mốc môi trường Czapek Dox Tương tự, mẫu pha lỗng cấy trải mơi trường thạch Czapek Dox để phân lập nấm mốc, ủ nhiệt độ 30oC ngày Kết thu khuẩn lạc đặc trưng nấm mốc môi trường Czapek Dox (Hình 2) Các khuẩn lạc thu vi khuẩn, nấm mốc; khơng có xuất nấm men xạ khuẩn Kết cho thấy chủng vi sinh vật từ dày voi mơi trường qua đường phân khơng đa dạng lồi Để xác định cụ thể chủng vi sinh vật thu từ khuẩn lạc nhằm tuyển chọn cho sản phẩm chế phẩm, cần tiến hành thí nghiệm kiểm tra hoạt tính phân giải cellulose 3.2 Khảo sát khả phân giải cellulose ngoại bào vi sinh vật phân lập Khả phân giải cellulose cellulase ngoại bào chủng phân lập thực môi trường CMC với nguồn carbon cellulose Hiệu phân giải CMC xác định cách đo vòng phân giải đĩa petri với thuốc thử lugol Các chủng vi sinh vật thử nghiệm cho khả tiết cellulase ngoại bào Một số chủng có vịng phân giải lớn bao gồm chủng vi khuẩn chủng nấm mốc tuyển chọn cho bước định danh Kết thí nghiệm mơ tả Hình 484 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Lê Hùng Anh tgk A B Hình Kết khảo sát hoạt tính cellulase chủng vi sinh vật tuyển chọn Các dòng vi khuẩn (A) vi nấm (B) 3.3 Định danh chủng vi sinh vật tuyển chọn 3.3.1 Định danh vi khuẩn Sử dụng hệ thống MALDI Biotyper định danh vi khuẩn cách sử dụng khối phổ MALDI – TOF Kết cho thấy khuẩn lạc 11 vi khuẩn Staphyloccoccus aureus khuẩn lạc 1, 6, 7, vi khuẩn Bacillus subtilis 3.3.2 Định danh vi nấm Dựa vào hình thái, màu sắc khuẩn lạc (Hình 4), dựa vào đặc điểm vi thể loài theo “Bảng phân loại định danh nấm” Đặng Vũ Hồng Miên kết hợp phương pháp định danh theo Bergey cho kết M1 nấm mốc Aspergillus fumigatus M2 Nấm mốc Aspergillus niger Hình Hình thái nấm mốc phân lập M1: Aspergillus fumigatus (trái) M2: Aspergillus niger (phải) 485 Tập 19, Số (2022): 481-491 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Từ kết thí nghiệm, chọn chủng vi khuẩn số Bacillus subtilis chủng nấm mốc M1 M2 Aspergillus fumigatus Aspergillus niger để tiếp tục sử dụng làm chế phẩm; Staphyloccoccus aureus vi khuẩn gây bệnh cho người động vật, có khả kháng lại nhiều loại kháng sinh nên không lựa chọn để sản xuất chế phẩm Ngồi ra, chúng tơi bổ sung thêm chủng Bacillus amyloliquefaciens từ ngân hàng chủng để tăng hiệu phân giải cellulose chế phẩm sinh học 3.4 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học phân giải cellulose dạng bột Chế phẩm phân giải cellulose thu sau q trình sản xuất có dạng bột, màu vàng kem, có mùi thơm cám gạo bột bắp Chế phẩm bột dạng mịn, độ ẩm < 20% kí hiệu PV Kết kiểm tra mật độ vi sinh vật tuyển chọn chế phẩm trình bày Bảng Bảng Kết kiểm tra mật độ vi sinh vật tuyển chọn chế phẩm Vi sinh vật tuyển chọn Mật độ VSV Aspergillus fumigatus 4,7x1012 Aspergillus niger 8,2x1011 Bacillus subtilis 5,0x1010 Bacillus amyloliquefaciens 2,5x1011 Tiêu chuẩn TCVN 6168 : 2002: Chế phẩm vi sinh vật phân giải cellulose > 1,0 x 108 Đơn vị tính CFU/g Từ kết Bảng cho thấy, chủng vi sinh vật phối trộn chế phầm PV đạt mật độ cao 1010 CFU/ml vượt mức quy định TCVN 6168: 2002: Chế phẩm vi sinh vật phân giải cellulose > 1,0 x 108 3.5 Kết đánh giá hiệu chế phẩm sinh học thu ủ compost đối tượng vỏ nha đam với quy mơ phịng thí nghiệm 3.5.1 Diễn biến tiêu đánh giá cảm quan Thí nghiệm thực tuần, kết kiểm tra đánh giá cảm quan, cuối tuần thể Bảng Sau tuần ủ, CT1.3 không bổ sung vi sinh vật nên trình phân hủy diễn chậm, sau tuần độ ẩm cao có mùi hơi, khơng hình thành compost Các xơ ủ theo CT1.1 CT1.2 q trình composting diễn tốt, vỏ nha đam phân hủy nhanh chóng, độ ẩm ln trì mức thích hợp, sản phẩm hết mùi hôi, chuyển sang màu nâu đen, chiều cao sụt giảm cịn ½ so với ban đầu 486 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Lê Hùng Anh tgk Bảng Diễn biến màu, mùi, độ ẩm cơng thức thí nghiệm Tuần Cơng thức CT1.1 CT1.2 CT1.3 CT1.1 CT1.2 CT1.3 CT1.1 Màu Mùi Độ ẩm Mùi vỏ nha đam Độ ẩm Màu xanh đen vỏ phân hủy có thích hợp nha đam úa lẫn màu mùi hôi so vơi nâu đỏ xơ dừa Độ ẩm cao loại thực vật khác Màu xanh đen vỏ nha đam phân hủy Độ ẩm thích hợp Mùi rác phân hủy Độ ẩm cao Sụt giảm chiều cao Giảm 2cm Giảm 7cm Giảm 5cm Giảm 12cm Màu nâu đen Mùi hôi giảm đáng kể Độ ẩm thích hợp Giảm 15cm CT1.3 Màu xanh đen Mùi hôi Độ ẩm cao Giảm 8cm CT1.1 Màu nâu đen Khơng cịn mùi Độ ẩm thích hợp Giảm 15cm Màu xanh đen Mùi Độ ẩm cao Giảm 9cm CT1.2 CT1.2 CT1.3 3.5.2 Diễn biến tiêu phân tích độ ẩm, độ tro hữu bay Sau tuần, tiến hành lấy mẫu phân tích tiêu độ ẩm, hữu bay hơi, độ tro xô ủ, kết phân tích thể Hình 5, Hình Diễn biến tiêu hữu bay cơng thức thí nghiệm Hình Diễn biến độ ẩm cơng thức thí nghiệm 487 Tập 19, Số (2022): 481-491 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Hình Diễn biến tiêu độ tro cơng thức thí nghiệm Vì khối lượng xơ ủ nhỏ yếu tố độ ẩm khơng biến đổi nhiều, độ ẩm công thức ổn định thích hợp ủ compost có trộn với 40% xơ dừa giúp cân độ ẩm, nhiên công thức không bổ sung chế phẩm sinh học độ ẩm cao cơng thức cịn lại q trình phân giải diễn chậm Các cơng thức ủ có thay đổi hàm lượng hữu bay Thể tích hữu giảm cho thấy có phân hủy hợp chất hữu diễn Các cơng thức có sử dụng chế phẩm sinh học đem lại hiệu tốt Ở công thức không dùng chế phẩm, phân hủy diễn chậm Độ tro tăng dần qua tuần ủ, công thức sử dụng chế phẩm sinh học độ tro có cách biệt rõ rệt so với không dùng chế phẩm Từ diễn biến thấy vi sinh vật chế phẩm PV đóng vai trị quan trọng trình phân hủy hợp chất hữu 3.5.3 Kết phân tích tiêu hàm lượng dinh dưỡng compost thu Sau kết thúc thí nghiệm, lấy mẫu compost thu CT1.1 CT1.2 phân tích hàm lượng tiêu dinh dưỡng so sánh với tiêu chuẩn phân hữu vi sinh Khơng tiến hành phân tích hàm lượng dinh dưỡng CT1.3 chưa hình thành compost Kết phân tích thể Bảng Bảng Kết phân tích tiêu hàm lượng dinh dưỡng compost STT Chỉ tiêu N CT1.1 0,42 CT1.2 0,43 P K Độ ẩm 0,15 0,44 50,25 0,14 0,39 50,69 pH 7 Coliform