Đồ án tốt nghiệp thử nghiệm các phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn bacillus spp và lactobacillus spp đối với một số nấm mốc sinh độc tố aflatoxin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH o H hi C h in M ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ity C THỬ NGHIỆM CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP VÀ LACTOBACILLUS SPP ĐỐI VỚI MỘT SỐ NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN rs ve ni U CÔNG NGHỆ SINH HỌC ity Ngành: Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC of ch Te Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HỒI HƯƠNG : LÊ NGƠ VŨ PHƯỢNG Lớp: 15HSH01 lo MSSV: 1515100007 no Sinh viên thực gy TP Hồ Chí Minh, 2016 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thân tơi hướng dẫn TS Nguyễn Hoài Hương khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- o H Môi Trường trường Đại Học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh Những kết đồ án hồn tồn khơng chép từ đồ án tốt nghiệp hi C người khác với hình thức Các số liệu trích dẫn đồ án tốt nghiệp hồn tồn trung thực Tơi xin chịu tồn trách nhiệm đồ án M TP.HCM, ngày 12 tháng năm 2016 h in Sinh viên thực ity C Lê Ngô Vũ Phượng ity rs ve ni U of lo no ch Te gy i Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, người nuôi nấng dạy dỗ khuyến khích tạo điều kiện cho học tập để có thành ngày hơm o H Trong suốt khoảng thời gian học trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM, em hi C thây, cô khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Mơi Trường hết lịng hướng dẫn, giúp đỡ em trình học tập trường M trình thực đồ án tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn đến quý Thầy, Cô nhờ h in có thầy, trang bị cho chúng em kiến thức cần thiết để tự tin bước vào đời Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hồi Hương, tận tình C hướng dẫn, bảo em suốt khoảng thời gian xây dựng đề cương thực ity hiện, hoàn thành đồ án Em xin cám ơn Thầy, Cơ phịng thí nghiệm bạn bè quan U ni tâm, giúp đỡ tạo điều kiện cho em hoàn thành đồ án tốt nghiệp ve Cuối cùng, em xin cảm ơn Thầy, Cô Hội Đồng Phản Biện dành thời gian đọc nhận xét đồ án Em xin gửi đến quý Thầy, Cô lời chúc sức ity rs khỏe of TP HCM, ngày 12 tháng năm 2016 Sinh viên thực Te Lê Ngô Vũ Phượng lo no ch gy ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC TRANG o H DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii hi C DANH MỤC HÌNH ix M MỞ ĐẦU h in CHƢƠNG I: TÔNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm: C 1.1.1 Giới thiệu chung ity 1.1.2 Độc tố nấm tiết .4 1.1.3 Tác hại nấm U ni 1.1.3.1 Tác hại nấm gây cho người động vật ve 1.1.3.2 Tác hại nấm gây cho thực vật 1.1.4 Một số chủng nấm gây hại thực phẩm rs 1.2 Tổng quan hợp chất kháng nấm: ity 1.2.1 Hợp chất kháng nấm hóa học 10 of 1.2.2 Tác hại hợp chất kháng nấm hóa học .10 1.2.3 Hợp chất kháng nấm sinh học 13 Te Hợp chất kháng nấm từ thực vật: 13 1.2.3.2 Hợp chất kháng nấm từ vi khuẩn: 17 ch 1.2.3.1 a Khả kháng nấm mốc Bacillus spp 17 no b Khả kháng nấm mốc Lactobacillus spp 19 lo 1.3 Các phương pháp sàng lọc chủngVSV kháng nấm mốc: 21 1.3.2 Phương pháp đối kháng trực tiếp (đặt thạch khuếch tán) 23 1.3.3 Phương pháp đối kháng che phủ (đổ dĩa lớp): 25 iii gy 1.3.1 Phương pháp đối kháng trực tiếp (cấy đường vi khuẩn) 21 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Địa điểm nghiên cứu: 26 2.2 Thời gian nghiên cứu: 26 o H 2.3 Vật liệu nghiên cứu: 26 2.3.1 Giống vi sinh vật: 26 hi C 2.3.1 Hóa chất mơi trường sử dụng 26 2.3.1.1 Hóa chất: 26 M 2.3.1.2 Môi trường nuôi cấy: 26 h in 2.4 Thiết bị dụng cụ: 27 2.4.1 Thiết bị: 27 C 2.4.2 Dụng cụ: 28 ity 2.5 Phương pháp luận: 28 2.6 Phương pháp nghiên cứu: 29 U 2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu 29 ni 2.6.2 Khảo sát tăng trường nấm mốc: 30 ve 2.6.3 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng trực phương pháp ria rs đường vi khuẩn chủng VK Bacillus spp Lactobacillus spp với nấm mốc: ity 30 of 2.6.4 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng trực phương pháp đặt thạch khuếch tán chủng VK Bacillus spp.và Lactobacillus spp.với nấm mốc: Te 35 ch 2.6.5 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng che phủ theo phương pháp đỗ dĩa lớp chủng vi khuẩn Bacillus spp Lactobacillus spp với nấm mốc: no 39 lo 2.6.6 Một số phương pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa số 2.6.6.1 Nhuộm gram 43 2.6.6.2 Nhuộm bào tử 44 2.6.6.3 Một số thử nghiệm sinh hóa: 44 iv gy chủng vi khuẩn 43 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 45 3.1 Định danh sơ khảo sát sinh lý - sinh hóa số chủng vi khuẩn 45 o H 3.1.1 Nhuộm Gram: 45 3.1.2 Nhuộm bào tử: 46 hi C 3.1.3 Một số thử nghiệm sinh hóa: 47 3.2 Khảo sát tăng trưởng nấm mốc: 48 M 3.3 Khảo sát khả đối kháng trực phương pháp ria đường vi khuẩn h in chủng VK Bacillus spp Lactobacillus spp với chủng nấm mốc: 50 C 3.4 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng trực phương pháp đặt thạch ity khuếch tán chủng VK Bacillus spp Lactobacillus spp với chủng nấm U mốc: 66 ni 3.5 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng che phủ thep phương pháp đỗ dĩa ve lớp chủng VK Bacillus spp Lactobacillus spp với chủng nấm mốc 81 rs 3.6 So sánh khả đối kháng nấm mốc 20 chủng vi khuẩn thông qua cách ity chấm điểm LSD (Sai số khác biệt nhỏ nhất) 90 of KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO 96 Te PHỤ LỤC lo no ch gy v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT o H LAB Lactobacillus spp NA Nutrient Agar NB Nutrient Broth hi C MT Môi trường PDA Potato dextrose agar M VK h in VSV Vi khuẩn Vi sinh vật ity C ity rs ve ni U of lo no ch Te gy vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1.Một số hợp chất kháng nấm hóa học sử dụng để bảo quản hạt giống o H Bảng 1.2.Một số hợp chất xác định có tiềm kháng nấm mốc nấm men hi C (Corsetti cộng sự, 1998) 18 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái chủng Bacillus spp 45 Bảng 3.2 Một số phản ứng sinh hóa chủng Bacillus spp 47 M Bảng 3.3 Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế chủng nấm mốc chủng vi khuẩn h in Bacillus spp theo nhóm với phương pháp cấy đường vi khuẩn 53 C Bảng 3.4 So sánh sô liệu tỉ lệ ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Bacillus ity spp mạnh nhóm theo phương pháp cấy đường vi khuẩn U 54 ni Bảng 3.5 Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn ve Lactobacillus spp theo nhóm với phương pháp cấy đường vi khuẩn rs 62 ity Bảng 3.6 So sánh số liệu tỉ lệ ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Lactobacillus spp mạnh nhóm theo phương pháp cấy đường vi of khuẩn 63 Te Bảng 3.7 Thống kê số liệu vòng ức chế chủng nấm mốccủa chủng vi khuẩn Bacillus spp theo nhóm với phương pháp đặt thạch khuếch tán ch 68 no Bảng 3.8 So sánh sơ liệu vịng ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Bacillus spp mạnh nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán lo 69 gy Bảng 3.9 Thống kê số liệu vòng ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Lactobacillus spp theo nhóm với phương pháp đặt thạch khuếch tán 76 vii Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.10.So sánh số liệu vòng ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Lactobacillus spp mạnh nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 77 o H Bảng 3.11 Thống kê số liệu trung bình ức chế chủng nấm mốc chủng vi khuẩn Bacillus spp theo nhóm với phương pháp đỗ dĩa lớp hi C 84 Bảng 3.12 Sắp xếp sô liệu trung bình ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn M Bacillus spp nhóm theo phương pháp đõ dĩa lớp 85 h in Bảng 3.13 Sắp xếp số liệu trung bình ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Lactobacillus spp theo nhóm với phương pháp đỗ dĩa lớp C 89 ity Bảng 3.14 Sắp xếp sơ liệu trung bình ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Lactobacillus spp nhóm theo phương pháp đỗ dĩa lớp 90 U Bảng 3.15 Thống kê điểm chủng vi khuẩn Bacillus spp theo phương pháp ni dựa theo xếp hạng LSD 91 ve Bảng 3.16 Thống kê điểm chủng vi khuẩn Lactobacillus spp theo ity rs phương pháp dựa theo xếp hạng LSD 92 of lo no ch Te gy viii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học Metalaxyl 10 o H Hình 1.2 Cấu trúc hóa học Manocozeb 11 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học Hexacoconazole 11 hi C Hình 1.4 Cấu trúc hóa học Pyrones 14 h in M Hình 1.5 Cấu trúc hóa học Viridines 15 Hình 1.6 Phương pháp cấy ria đường thể đối kháng vi khuẩn LAB nấm mốc (trích từ Nora Laref, 2013) 20 C ity Hình 1.7 Sơ đồ nghiên cứu khả đối kháng vi khuẩn có lợi theo phương pháp ria đường vi khuẩn 21 U ni Hình 1.8 Phương pháp đặt thạch khuếch tán thể đối kháng vi khuẩn ve Bacillus spp với Calbicans (trích dẫn Mounyr Balouiri, 2015) rs 22 ity Hình 1.9 Sơ đồ nghiên cứu khả đối kháng vi khuẩn có lợi theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 23 of Hình 1.10 Phương pháp đối kháng che phủ Bacillus spp với loại nấm Te (trích từ Kumar cộng sự,2009) 24 ch Hình 1.11 Sơ đồ nghiên cứu khả đối kháng vi khuẩn có lợi theo phương no pháp đỗ dĩa .25 lo Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát nghiên cứu khả dối kháng chủng vi khuẩn gy có lợi nấm mốc 29 Hình 2.2 Sơ đồ chi tiết khảo sát khả đối kháng chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy ria đường 31 ix Error Mean Square 10.13419 Critical Value of t 2.07387 Least Significant Difference 5.3905 o H Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N DN2 hi C 52.743 (CS1b) B 43.500 (D9) B 39.387 DCNYSTAT D 35.280 (VK4) (Paenibacillus) (CS1a) h in M A B C C ity C D 32.197 E ve ni U C E D 30.657 E D ity rs D E E F E F 29.283 27.403 10 (NT1.3) Te F of E (NT 2.3) F no ch F (NT 1.4) F 25.007 (NT 3.3) G 16.787 3 (NT CS1+) F gy 17 lo 25.007 HCP2: o H TI LE UC CHE NAM HCP2 21:09 Thursday, July 23, 2016 24 The ANOVA Procedure hi C Class Level Information Class Levels 11 h in M HCP2 Values 10 DCNYSTAT Number of Observations Read 33 Number of Observations Used 33 21:09 Thursday, July 23, 2016 C TI LE UC CHE NAM HCP2 25 ity The ANOVA Procedure Dependent Variable: TILEKHANG U DF ni Source Sum of Squares Mean Square 10 6163.394539 ve 616.339454 Error 22 292.956067 13.316185 ity Corrected Total 32 rs Model F Value Pr > F 46.28 F HCP2 10 6163.394539 616.339454 46.28 F 1702.384685 170.238468 10.01 F CDP1 10 1702.384685 170.238468 10.01 F lo Error F Value no Source ch Sum of Te Dependent Variable: VONGUCCHE R-Square Coeff Var Root MSE VONGUCCHE Mean 0.685890 10.69751 2.612353 13.97167 DF Anova SS 22 Mean Square F Value Pr > F DN3 178.8207833 VONG UC CHE NAM DN3 35.7641567 5.24 21:52 Thursday, July 29, 2016 0.0088 23 The ANOVA Procedure o H t Tests (LSD) for VONGUCCHE hi C NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 M Error Degrees of Freedom 12 h in Error Mean Square 6.824389 Critical Value of t 2.17881 C Least Significant Difference 4.6474 t Grouping N DN3 A 20.723 1(L5) B 14.500 3(LN2-5) 4(LN2-7) 6(LN3-7) B ity rs ve ni U Mean of ity Means with the same letter are not significantly different B 12.723 B B 12.110 Te B 11.997 ch B 11.777 5(LN3-5) B lo no B 2(L6) gy 23 DN2: VONG UC CHE NAM DN2 21:52 Thursday, July 29, 2016 25 The ANOVA Procedure o H Class Level Information Levels hi C Class Values DN2 h in M ONG UC CHE NAM DN2 6 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 21:52 Thursday, July 29, 2016 26 The ANOVA Procedure C ity Dependent Variable: VONGUCCHE Sum of Model F Value 122.1141611 24.4228322 2.59 Error 12 Corrected Total 17 113.3172000 Pr > F 0.0824 9.4431000 rs 235.4313611 ity R-Square Coeff Var Root MSE VONGUCCHE Mean 0.518683 10.00231 3.072963 12.80278 DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F 122.1141611 24.4228322 Te of DN2 Mean Square ve Source Squares ni DF U Source 0.0824 21:52 Thursday, July 29, 2016 27 no ch VONG UC CHE NAM DN2 2.59 The ANOVA Procedure lo t Tests (LSD) for VONGUCCHE Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 24 12 9.4431 gy NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 5.4668 Means with the same letter are not significantly different o H t Grouping Mean N DN2 hi C A 18.223 1(L5) 13.557 3(LN2-5) 12.110 5(LN3-5) 11.390 6(LN3-7) 10.777 2(L6) 10.760 4(LN2-7) A M B A h in B B C B ity B B ve ni U B B ity rs B of lo no ch Te gy 25 CDP1: VONG UC CHE NAM CDP1 21:52 Thursday, July 29, 2016 33 o H The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels hi C CDP1 Values 6 h in M Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 VONG UC CHE NAM CDP1 21:52 Thursday, July 29, 2016 34 The ANOVA Procedure C Dependent Variable: VONGUCCHE ity Source Pr > F 292.3496444 58.4699289 18.24 F 18.24 F 66.6432444 13.3286489 0.78 0.5830 205.1190000 17.0932500 271.7622444 rs R-Square Coeff Var Root MSE VONGUCCHE Mean 0.245226 10.88958 4.134398 13.38444 DF ity Anova SS Mean Square 66.64324444 13.32864889 Pr > F 0.78 0.5830 21:52 Thursday, July 29, 2016 Te VONG UC CHE NAM CDP2 F Value of CDP2 Mean Square ve Error Squares ni U Model Source Sum of 39 The ANOVA Procedure ch t Tests (LSD) for VONGUCCHE Alpha 0.05 Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference 28 12 17.09325 2.17881 7.355 gy Error Degrees of Freedom lo no NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Means with the same letter are not significantly different Mean N CDP2 A 17.277 1(L5) 13.943 3(LN2-5) 13.090 6(LN3-7) 12.720 4(LN2-7) 11.890 5(LN3-5) 11.387 2(L6) o H t Grouping A hi C A A M A h in A A A C A ity A ity rs ve ni U A of lo no ch Te gy 29 HCP2: VONG UC CHE NAM HCP2 22:53 Thursday, July 29, 2016 o H The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels hi C HCP2 Values 6 h in M Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 VONG UC CHE NAM HCP2 22:53 Thursday, July 29, 2016 The ANOVA Procedure C Dependent Variable: VONGUCCHE ity Source DF Mean Square Corrected Total 17 F Value 8.10699222 44.08193333 Pr > F 2.21 0.1213 3.67349444 ve 12 40.53496111 ni Error 84.61689444 rs R-Square Coeff Var Root MSE VONGUCCHE Mean 0.479041 10.49861 1.916636 13.21944 Anova SS 40.53496111 F Value Pr > F 2.21 0.1213 8.10699222 22:53 Thursday, July 29, 2016 Te VONG UC CHE NAM HCP2 Mean Square of DF ity HCP2 Squares U Model Source Sum of The ANOVA Procedure ch t Tests (LSD) for VONGUCCHE Alpha 0.05 Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference 30 12 3.673494 2.17881 3.409 gy Error Degrees of Freedom lo no NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Means with the same letter are not significantly different Mean N HCP2 A 15.947 1(L5) 13.613 4(LN2-7) 13.590 3(LN2-5) 13.113 5(LN3-5) 11.667 2(L6) 11.387 6(LN3-7) o H t Grouping A hi C h in M A B A B A B A B A B C B ity B B ni U Chạy tương tự với nhóm cơm mẻ cảu chủng Lactobacillus spp nhóm Bacillus spp với nấm khác ity rs ve  B of lo no ch Te gy 31