Đang tải... (xem toàn văn)
Đề tài “Phân lập, định danh và xác định các đặc tính có lợi của chủng vi khuẩn Bacillus spp. từ đất và phân tại trại chăn nuôi gà trong tỉnh Trà Vinh” được thực hiện với mục đích phân lập chủng vi khuẩn Bacillus spp. có tiềm năng probiotic thích hợp cho gia cầm từ đất và phân của trại gà. Nghiên cứu này nhằm tìm biện pháp mới thay thế kháng sinh trong phòng và trị bệnh, nâng cao năng suất, hiệu quả trong chăn nuôi gà công nghiệp, giảm bớt nguy cơ lan rộng các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh trong tự nhiên.
TRẦN THỊ NGÂN TÚ – LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH THÚ Y ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH TRÀ VINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH ISO 9001:2015 TRẦN THỊ NGÂN TÚ PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH CÓ LỢI CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP TỪ ĐẤT VÀ PHÂN TẠI TRẠI CHĂN NUÔI GÀ TRONG TỈNH TRÀ VINH LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH THÚ Y NĂM BẢO VỆ: 2020 TRÀ VINH, NĂM 2020 ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH TRÀ VINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH TRẦN THỊ NGÂN TÚ PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH CĨ LỢI CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP TỪ ĐẤT VÀ PHÂN TẠI TRẠI CHĂN NUÔI GÀ TRONG TỈNH TRÀ VINH LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH THÚ Y MÃ NGÀNH: 8640101 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TIẾN SĨ NGUYỄN THỊ ĐẤU TRÀ VINH, NĂM 2020 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam kết cơng trình nghiên cứu “Phân lập, định danh xác định đặc tính có lợi chủng vi khuẩn Bacillus spp từ đất phân trại chăn ni gà tỉnh Trà Vinh” hồn thành dựa kết nghiên cứu kết nghiên cứu chưa dùng cho luận văn cấp khác Trà Vinh, Ngày 20 tháng 09 năm 2020 NGƯỜI THỰC HIỆN TRẦN THỊ NGÂN TÚ i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành nội dung luận văn tốt nghiệp, ngồi cố gắng học hỏi thân, tơi nhận giúp đỡ nhiều từ quý thầy cô, bạn bè Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến: TS Nguyễn Thị Đấu động viên, hỗ trợ chuyên môn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Q thầy Bộ mơn Thú y, khoa Nông nghiêp Thủy sản, trường Đại học Trà Vinh truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quí báu cho suốt thời gian học tập trường Tập thể kỹ thuật viên phịng xét nghiệm cơng ty trách nhiệm hữu hạn dịch vụ thương mại Nam Khoa tạo điều kiện thuận lợi để thực xét nghiệm vi sinh Các công tác viên thú y xã Nguyệt Hóa, Song Lộc thuộc huyện châu Thành xã Đại Phước thuộc huyện Càng Long hỗ trợ suốt trình lấy mẫu vi sinh trại gà địa bàn xã phụ trách Xin chân thành cảm ơn tất bạn bè, bạn đồng nghiệp, anh, chị, em phịng thí nghiệm vi sinh Khoa Nơng nghiệp Thủy sản hỗ trợ, chia sẻ cung cấp thơng tin giúp tơi hồn thành luận án Cảm ơn gia đình người thân động viên, chia sẻ sát cánh bên suốt trình học tập thực đề tài ii TÓM TẮT Đề tài “Phân lập, định danh xác định đặc tính có lợi chủng vi khuẩn Bacillus spp từ đất phân trại chăn nuôi gà tỉnh Trà Vinh” thực với mục đích phân lập chủng vi khuẩn Bacillus spp có tiềm probiotic thích hợp cho gia cầm từ đất phân trại gà Nghiên cứu nhằm tìm biện pháp thay kháng sinh phịng trị bệnh, nâng cao suất, hiệu chăn nuôi gà công nghiệp, giảm bớt nguy lan rộng chủng vi khuẩn kháng kháng sinh tự nhiên Đề tài phân lập 62 chủng vi khuẩn từ 35 mẫu đất 35 mẫu phân gà thu thập trại gà huyện tỉnh Trà Vinh Các chủng vi khuẩn chọn lọc qua kiểm định sinh lý, sinh hóa với tiêu như: âm tính với lecithinase, dương tính với catalase, amylase, cellulase, VP (Voges - Proskauer), chịu nhiệt cao (phát triển 500C); Kết phân tích cho thấy chọn chủng vi khuẩn đạt tiêu mặt sinh lý, sinh hóa theo yêu cầu Nhằm tuyển chọn chủng vi khuẩn có tiềm probiotic, chủng Bacillus spp tuyển chọn khảo sát đặc điểm đặc trưng cho vi khuẩn probiotic như: tính chịu nhiệt (phát triển nhiệt độ từ 500C), tính nhạy cảm kháng sinh (colistin, trimethoprim, streptomycin, ampicillin, tetracyclin, norfloxacin), khả sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease), khả ức chế vi khuẩn gây bệnh (Salmonella enterica), khả chịu pH thấp (pH 2,0), khả chịu muối mật 0,3%, khả bám dính (tự bám dính) Kết cho thấy chủng vi khuẩn khảo sát, có chủng P6.N P21.N thể tốt đặc tính probiotic Kết giải trình tự gen 16S rRNA (sử dụng phần mềm BLAST so sánh trình tự gen sở liệu NCBI) cho thấy chủng P6.N thuộc loài Bacillus coagulans chủng P21.N thuộc loài Bacillus subtilis với độ tương đồng 100% Từ khóa: B subtilis, gà, phân lập, định danh, probiotic, Trà Vinh iii ABSTRACT The dissertation “Isolation and identification of some Bacillus spp accessions with high biological from soil and fecal samples at intensive chicken farms in Trà Vinh province” was carried out to isolate the Bacillus spp strains with probiotic potential from soil and fecal samples at intensive chicken farms This study aimed to find out alternatives for antibiotics in the prevention and treatment of intestinal diseases as well as to increase productivity and effectiveness in poultry industry and also to reduce the risks of spreading antibiotic resistant bacteria in nature From 35 soil samples and 35 fecal samples of chicken farms from districts in Tra Vinh province, 62 similarly Bacillus spp bacteria were isolated These isolates were analyzed further for Bacillus spp characteristics by physiobiological tests with the following criteria such as: negative in lecithinase, positive in catalase, amylase, cellulase, VP (Voges-Proskauer) and temperature tolerance (being able to grow at 500C) The results showed that there were isolates which satisfied the required physiobiochemical criteria In order to select the B subtilis strain with probiotic capabilities, selected Bacillus spp isolates were investigated further on the susceptibility to antibiotics (colistin, trimethoprim, streptomycin, ampicillin, tetracyclin, norfloxacin), temperature tolerance (being able to grow at 500C), extracellular enzyme production (amylase, protease), bacterial pathogen inhibition properties (Salmonella enterica), tolerance to acidity of the gastric juice (pH 2,0) and 0.3% bile salts & adherence ability (autoaggregation) The results showed that among isolates observed, the strain isolates P6.N & P21.N exposed the best probiotic capabilities Identified by the bio-molecular technique namely partial sequencing of 16S rRNA (using BLAST alignment with the known sequences on the NCBI genbank), the P6.N strain is 100% similarity with Bacillus coagulans and the P21.N strain is 100% similarity with Bacillus subtilis Key words: B subtilis, chicken, isolation, identification, probiotic, Tra Vinh iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii ABSTRACT iv CHƯƠNG GIỚI THIỆU TỔNG QUAN 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.2.1 Mục tiêu chung 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 PHẠM VI GIỚI HẠN ĐỀ TÀI 1.3.1 Phạm vi nội dung 1.3.2 Phạm vi không gian 1.3.3 Phạm vi thời gian 1.4 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ ĐỐI TƯỢNG KHẢO SÁT 1.4.1 Đối tượng nghiên cứu 1.4.2 Đối tượng khảo sát CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC 2.1.1 Lịch sử probiotic 2.1.2 Các định nghĩa probiotic 2.1.3 Vai trò chế tác động probiotic 2.1.4 Cơ chế tác động probiotic gia cầm 2.1.5 Các chủng vi khuẩn thường dùng làm probiotic chăn nuôi 2.1.6 Các tiêu để chọn vi sinh vật làm probiotic 10 2.1.6.1 Về mặt sản xuất 10 2.1.6.2 Về mặt sử dụng cho vật nuôi 10 2.2 TỔNG QUAN VỀ BACILLUS SPP 11 2.2.1 Đặc điểm chung giống Bacillus 11 2.2.2 Các vi khuẩn Bacillus spp có tiềm probiotic 13 2.2.2.1 Bacillus subtilis 13 2.2.2.2 Bacillus clausii 17 v 2.2.2.3 Bacillus coagulans 18 2.2.2.4 Bacillus licheniformis 19 2.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ PROBIOTIC TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 20 2.3.1 Một số nghiên cứu probiotic giới 20 2.3.2 Một số nghiên cứu probiotic nước 21 2.4 MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƯỜNG TIÊU HÓA THƯỜNG GẶP TRÊN GÀ 23 2.4.1 Salmonella 23 2.4.2 E coli 27 2.4.3 Clostridium perfringens 28 CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 29 3.1.1 Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu 29 3.1.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất sử dụng 29 3.1.3 Môi trường sử dụng 29 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 30 3.2.1 Mục đích 30 3.2.2 Phương pháp thực 30 3.2.2.1 Phương pháp lấy mẫu 30 3.2.2.2 Số lượng mẫu 30 3.2.2.3 Phân lập Bacillus spp phương pháp truyền thống 31 3.3 NỘI DUNG 2: TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACLLUS SPP CĨ ĐẶC TÍNH PROBIOTIC 33 3.3.1 Khả kháng kháng sinh 34 3.3.2 Khả sinh enzyme tiêu hóa (amylase, protease) 34 3.3.3 Khả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh 34 3.3.4 Khả chịu đựng tác động dịch tiêu hóa (pH thấp muối mật) 35 3.3.4.1 Khả chịu pH thấp 35 3.3.4.2 Đánh giá khả chịu muối mật 36 3.3.5 Khả bám 37 3.4 NỘI DUNG 3: ĐỊNH DANH DÒNG VI KHUẨN BACILLUS SPP CÓ TIỀM NĂNG PROBIOTIC 37 vi 3.4.1 Quy trình tách chiết 37 3.4.2 Quy trình PCR 37 (Nguồn: Cty TNHH DV & TM Nam Khoa) 38 3.4.3 Phương pháp điện di 38 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 4.1 PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SPP 39 4.2 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH BẰNG CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA 40 4.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH PROBIOTIC 43 4.3.1 Kết khảo sát khả nhạy/kháng kháng sinh 43 4.3.2 Kết khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào amylase protease 45 4.3.3 Kết khảo sát khả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh 46 4.3.4 Kết khảo sát khả chịu tác động dịch tiêu hóa (pH thấp muối mật) 48 4.3.5 Kết khảo sát khả bám dính chủng Bacillus spp 52 4.5 ĐỊNH DANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN 53 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 55 5.1 KẾT LUẬN 55 5.2 ĐỀ XUẤT 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 vii ... TẮT Đề tài ? ?Phân lập, định danh xác định đặc tính có lợi chủng vi khuẩn Bacillus spp từ đất phân trại chăn nuôi gà tỉnh Trà Vinh” thực với mục đích phân lập chủng vi khuẩn Bacillus spp có tiềm probiotic... TRÀ VINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH TRẦN THỊ NGÂN TÚ PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH CĨ LỢI CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP TỪ ĐẤT VÀ PHÂN TẠI TRẠI CHĂN NUÔI GÀ TRONG TỈNH TRÀ VINH... ? ?phân lập, định danh xác định đặc tính có lợi chủng vi khuẩn bacillus spp từ đất phân trại chăn nuôi gà tỉnh Trà Vinh” thực từ khâu lấy mẫu phân đất trại gà Sau đưa phịng thí nghiệm phân lập, thử