Biện pháp kiểm soát sinh học nấm bệnhC.cassiicola trên cây cao su mang lại nhiều lợi ích tiềm năng về phòng ngừa, điều trị cũng như hạn chế khả năng gây hại cho môi trường, là một biện p
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
− Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh – Trường Đại học Mở Thành phố
Hồ Chí Minh (cơ sở 3), 68 Lê Thị Trung, Thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương.
VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.2.1 Chủng vi khuẩn thử nghiệm
Chủng vi khuẩn Bacillus sp T3 là chủng nội sinh được phân lập từ mẫu lá cây cao su tại huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dương được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh (cơ sở 3)
Chủng vi khuẩn Bacillus sp S29 phân lập từ vùng đất trồng cao su tại huyện Chơn Thành, tỉnh Bình Phước, được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh (cơ sở 3)
Chủng nấm Corynespora cassiicola BP5 gây bệnh trên cây cao su phân lập tại Thị xã Đồng Xoài, tỉnh Bình Phước, được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh.
THIẾT BỊ - DỤNG CỤ - MÔI TRƯỜNG
SVTH: LÊ THANH QUỲNH NHƯ 16
− Máy cô quay chân không
− Pipet (thủy tinh và pipetman)
2.3.3 Môi trường – hoá chất – thuốc nhuộm
− Nutrient broth (NB), Nutrient agar
− Thuốc nhuộm crystal violet, lugol, safanin O, lactophenol
− Nước cất, nước muối sinh lý 0,85%
− Các dung môi hữu cơ: acetone, n- hexan, dichloromethane, n- butanol, ethanol, methanol, diethyl ether
SVTH: LÊ THANH QUỲNH NHƯ 17
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dựa vào mục tiêu đề tài, tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ:
Sơ đồ 2.1 Quy trình thí nghiệm
2.4.2 Tái phân lập chủng vi sinh vật thử nghiệm
Tiến hành cấy ria Bacillus sp T3 và Bacillus sp S29 trên đĩa môi trường NA, ủ ở nhiệt độ 30 độ C trong 24 giờ Sau đó, kiểm tra hình thái đại thể của khuẩn lạc, thử nghiệm catalase và nhuộm Gram để quan sát hình thái vi thể của vi khuẩn.
Lên men chủng vi khuẩn
Phân tích tế bào xâm nhiễm
Tách chiết hợp chất kháng nấm
Khảo sát khả năng kháng C cassiicola của dịch chiết Khảo sát khả năng kháng C cassiicola của dịch nguyên
SVTH: LÊ THANH QUỲNH NHƯ 18
Sự khác nhau giữa vách tế bào Gram (+) và Gram (–) làm cho khả năng bắt màu màng tế bào với thuốc nhuộm khác nhau Dựa vào đặc điểm này người ta phân thành hai nhóm vi khuẩn (Nguyễn Đức Lượng và cs., 2003)
Thao tác nhuộm Gram gồm các bước sau:
− Nhỏ giọt nước lên một phiến kính sạch Tạo huyền phù với vi khuẩn cần nhuộm, hơ nóng nhẹ phiến kính cho đến khô
− Phủ hoàn toàn vết bôi với crystal violet Để yên 1 – 2 phút rồi nhẹ nhàng rửa trôi thuốc nhuộm dư bằng nước
− Nhỏ dung dịch lugol trong khoảng 30 giây rồi lại rửa nhẹ nhàng với nước
− Tẩy cồn 96 o từ 15 – 30 giây, sau đó rửa nước Phủ hoàn toàn vết bôi với safranin O và để yên trong 1 phút Rửa với nước
− Thấm khô phiến kính với giấy thấm Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 100 Đọc kết quả
− Tế bào vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím
− Tế bào vi khuẩn Gram (–) bắt màu hồng
− Vi khuẩn có bào tử, bào tử trong suốt không bắt màu
Các vi sinh vật hiếu khí hay kị khí tùy nghi chứa chuỗi điện tử có cytochrome đều có enzym catalase (trừ các Streptococcus spp.) Enzym này là một trong những enzym có vai trò bảo vệ tế bào khỏi những tổn thương bởi những dẫn xuất độc tính cao của oxi phân tử trong tế bào Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức theo với oxi là chất nhận điện tử cuối cùng
SVTH: LÊ THANH QUỲNH NHƯ 19 trong chuỗi truyền điện tử, tạo H2O2 Catalase sẽ thủy phân hydrogen peroside (H2O2) thành H2O và O2 ngăn chặn sự tích tụ của các phân tử có độc tính cao này trong tế bào (Trần Linh Thước, 2010)
Nhỏ một giọt H2O2 3% vào phiến kính có sinh khối của vi khuẩn thử nghiệm Đọc kết quả
Thử nghiệm: (+) có bọt khí do O2 tạo ra
(–) không có sủi bọt khí
Thử nghiệm đối chứng: (+) Staphylococcus aureus
2.4.2.3 Giải trình tự hỗ trợ định danh
Việc giải trình tự 16S rDNA được tiến hành bởi dịch vụ của công ty Macrogen, Hàn Quốc
Loại bỏ những tín hiệu không chính xác ở hai đầu trình tự khảo sát: đối với các tín hiệu ở đầu gần mồi, tín hiệu thường lớn và biên độ không ổn định, các đỉnh tín hiệu không rõ ràng Với các tín hiệu gần cuối trình tự, cường độ thường rất thấp và không thể phân biệt rõ ràng các đỉnh Việc đọc base ở vùng này hoàn toàn không đảm bảo được độ tin cậy và cần được loại bỏ
Kiểm tra các sai lệch giữa hai kết quả giải trình tự với mồi xuôi và mồi ngược
So sánh với cơ sở dữ liệu GenBank:
Sau khi hiệu chỉnh các sai lệch, trình tự bảo tồn (consensus) được rút ra từ hai kết quả giải trình tự đã kiểm tra các sai lệch Trình tự consensus là trình tự tương đối chính xác cho đoạn DNA khảo sát Tuy nhiên, kết quả này cần được kiểm tra một lần nữa trên các cơ sở dữ liệu nucleotide như GenBank bằng BLASTn Các sai lệch nếu có giữa trình tự trên cơ cở dữ liệu và trình tự truy vấn cần được xem xét và kiểm tra tín hiệu huỳnh quang ở các vị trí này một lần nữa để xác nhận kết quả giải trình tự Ngoài ra, việc thực hiện BLAST còn giúp kiểm tra sự nhiễm mẫu và
SVTH: LÊ THANH QUỲNH NHƯ 20 đánh giá quá trình thu nhận và bảo quản mẫu
Xây dựng bộ dữ liệu DNA
Ngoài dữ liệu trình tự trực tiếp thu được, các trình tự của các chi khác thuộc họ Bacillus đã được lấy từ GenBank và được đưa vào phân tích phát sinh loài Các trình tự này được liệt kê chi tiết trong Phụ lục.
Xây dựng cây phát sinh loài
Theo phương pháp Maximum Likelihood: được tạo bằng phần mềm PhyML 3.1 và MEGA 6
− Hoạt hóa giống: sinh khối Bacillus sp T3 và Bacillus sp S29 từ ống giữ chủng 20% glycerol được cấy vào ống nghiệm chứa 5 mL môi trường NB Ủ
− Nhân giống: bổ sung 10% thể tích dịch khuẩn Bacillus sp T3 sau khi hoạt hóa vào 100ml môi trường tối ưu hóa tương ứng với chủng T3 (glucose: 19,49 g/L, NH4NO3: 6,35 g/L, MgSO4: 0,76 g/L, K2HPO4: 6,33 g/L (Nguyễn Văn Minh và cs., 2014)) Nuôi cấy lắc 200 vòng/ phút ở 30 o C trong 54 giờ
− Nhân giống: bổ sung 10% thể tích dịch khuẩn Bacillus sp S29 sau khi hoạt hóa vào 100ml môi trường tối ưu hóa tương ứng với chủng S29 (Tinh bột: 20,15 g/ L, Pepton 26,15 g/ L, KH2PO4 0,71 g/ L, MgSO4 1,05 g/ L (Đỗ Thị Thu
Hà, 2014)) Nuôi cấy lắc 200 vòng/ phút ở 30 o C trong 48 giờ
− Lên men: bổ sung 10% thể tích dịch khuẩn nhân giống cấp 2 vào môi trường tối ưu hóa tương ứng với chủng vi khuẩn Lên men bằng nồi lên men Bioflo 110 trong 54 giờ (tốc độ cánh khuấy: 200 vòng/phút, DO: 100%, pH: 7, nhiệt độ: 30 o C) Thể tích lên men: 3L (Shrivastava và cs., 2013)
2.4.4 Xác định hoạt tính chất kháng nấm Bacillus sp T3 và Bacillus sp S29
Chuẩn bị dịch nguyên thử nghiệm
− Sau quá trình lên men (mục 2.4.3) tiến hành ly tâm dịch khuẩn ở 13
000 vòng/ phút trong 10 phút Tiếp theo, dịch nổi được lọc qua màng lọc 0,45μm (Shrivastava và cs., 2013)
SVTH: LÊ THANH QUỲNH NHƯ 21
− Dịch lọc cần được sử dụng trong vòng 15 phút
Chuẩn bị dịch tách chiết thử nghiệm
Dịch tách chiết thử nghiệm được chuẩn bị theo quy trình sau
Sơ đồ 2.2 Quy trình tách chiết dịch thử nghiệm
− Sau quá trình lên men (mục 2.4.3) tiến hành ly tâm dịch khuẩn ở 13 000 vòng/ phút trong 10 phút Tiếp theo, dịch nổi được lọc qua màng lọc 0,45μm (Shrivastava và cs., 2013)
− Dịch nổi sau khi lọc được bổ sung với dung môi theo tỷ lệ 1:2, V:V
SVTH: LÊ THANH QUỲNH NHƯ 22
− Đối với dung môi dichloromethane phải tiến hành lóng mẫu để tách nước ra khỏi dung dịch Dung dịch được lắc đều trong bình lóng, để yên đến khi 2 pha dung môi và nước trở về trạng thái cân bằng thu dung môi kèm với các thành phần kháng nấm có trong nó
− Cô quay chân không phần dung môi thu được Nhiệt độ cô quay phụ thuộc vào nhiệt độ sôi của dung môi
− Sau khi đuổi hết dung môi bổ sung methanol vào chất kháng nấm thô thu được (tỉ lệ 1:1, V:V)
Chuẩn bị nấm Corynespora cassiicola thử nghiệm
− Nấm được cấy trên môi trường PDA ủ ở 30 o C trong 72 giờ
− Bổ sung một ít nước muối 0,85% có chứa 0,05% Tween 80 vào ống nấm, dùng que cấy cạo nhẹ trên mặt khóm nấm để nhận bào tử
− Điều chỉnh mật độ bào tử đạt 1 x 10 6 CFU/ mL bằng cách điều chỉnh OD
− Dịch nấm đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút
− Dùng que bông vô trùng nhúng vào dịch nấm đã chuẩn bị, ép que vào thành ống cho ráo nước, sau đó trải đều trên mặt thạch Lặp lại 3 lần, mỗi lần xoay đĩa 60 o
− Đục lỗ đường kính 6 mm trong bản thạch bằng dụng cụ tiệt trùng
− Dịch nguyên và dịch tách chiết đã chuẩn bị được nhỏ vào trong lỗ khoảng 70 μL
− Để yên khoảng 15 phút cho dịch khuếch tán vào lớp thạch
− Ủ 4 – 5 ngày ở 28 o C rồi xem Đọc kết quả vòng kháng nấm
− Thí nghiệm được thực hiện với 6 lần lặp lại Xử lý thống kê ANOVA một yếu tố bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0 Đọc kết quả
− Vi khuẩn có khả năng kháng nấm khi xung quanh lỗ có vòng kháng nấm
− Ghi nhận Đọc kết quả đạt được
SVTH: LÊ THANH QUỲNH NHƯ 23
Hinh 2.1 Đọc kết quả kháng nấm của vi khuẩn
2.4.5 Đánh giá khả năng gây bệnh của nấm Corynespora cassiicola trên lá cắt rời và hiệu quả kiểm soát
Tạo môi trường tương tự như tự nhiên khi nấm bệnh tương tác trực tiếp với lá cây cao su để khảo sát khả năng gây bệnh của nấm C cassiicola cũng như khả năng kháng bệnh của vi khuẩn Bacillus sp T3 và Bacillus sp S29
Để duy trì độ ẩm trong phòng thí nghiệm, chuẩn bị hộp nhựa, lót bông thấm nước cất vào đáy hộp, sau đó đặt một lớp thanh chữ U lên trên Thanh chữ U có nhiệm vụ nâng đỡ lá, tránh tiếp xúc trực tiếp với bông ẩm.
Chuẩn bị dịch kháng nấm và nấm thử nghiệm
− Dịch kháng nấm sau khi tách chiết bằng dung môi được chỉnh pH = 7
− Cho vào ống nấm một ít nước muối 0,85% có chứa 0,05% Tween 80, dùng que cấy cạo nhẹ trên khóm lấm để lấy bào tử, đo OD 530 nm điều chỉnh sao cho đạt trong khoảng 0,08 – 0,12 tương đương với mật độ tế bào 1 x 10 6 CFU/ mL
Chuẩn bị lá cao su thử nghiệm
− Giống cao su được sử dụng là giống IAN 873, chọn lá 10 – 15 ngày tuổi, không bị nhiễm bệnh
− Lau sạch bằng bông và bông thấm cồn 70 o
SVTH: LÊ THANH QUỲNH NHƯ 24
− Sau đó rửa với thuốc chống mốc sodium benzoate trong 30 giây và rửa lại
3 lần với nước cất Thấm khô rồi đặt úp lá vào hộp nhựa đã được chuẩn bị
− 20 μL dịch bào tử nấm được nhỏ lên hai bên gân chính của lá, mỗi bên 2 giọt
− Theo dõi mẫu lá ở nhiệt độ phòng
