Đánh giá khả năng kiểm soát nấm phytophthora spp gây bệnh chảy gôm trên cây cam bằng vi khuẩn bacillus siamensis

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT NẤM PHYTOPHTHORA SPP GÂY BỆNH CHẢY GÔM TRÊN CÂY CAM BẰNG VI KHUẨN BACILLUS SIAMENSIS HÀ NỘI - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT NẤM PHYTOPHTHORA SPP GÂY BỆNH CHẢY GÔM TRÊN CÂY CAM BẰNG VI KHUẨN BACILLUS SIAMENSIS Giáo viên hướng dẫn : TS Phạm Hồng Hiển : PGS.TS Nguyễn Văn Giang Sinh viên thực : Nguyễn Diệu Thùy Lớp : K63 CNSHA Mã sinh viên : 637078 HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến hai thầy hướng dẫn TS Phạm Hồng Hiển PGS.TS Nguyễn Văn Giang tận tình hướng dẫn giúp đỡ em q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến thầy, cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học tận tình truyền đạt kiến thức quan trọng bổ ích khơng tảng cho q trình thực khóa luận mà cịn hành trang cho chặng đường phía trước Ngồi ra, em xin cảm ơn cán Trung tâm đấu tranh Sinh học thuộc Viện Bảo vệ Thực vật tạo điều kiện, sở vật chất để giúp đỡ em q trình thực khóa luận tốt nghiệp Do kiến thức hạn chế khả lý luận cịn nhiều thiết sót nên em mong nhận đóng góp thầy giáo, giáo để khóa luận tốt nghiệp em hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Diệu Thùy i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC VIẾT TẮT iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC BẢNG vi TÓM TẮT vii MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây cam bệnh chảy gôm 1.1.1 Cây cam 1.1.2 Bệnh chảy gôm 1.2 Giới thiệu nấm Phytophthora 1.3 Giới thiệu vi khuẩn Bacillus 1.4 Tình hình nghiên cứu nước 12 1.4.1 Tình hình nghiên cứu nước 12 1.4.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 14 PHẦN II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liệu nghiên cứu .17 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 PHẦN III KẾT QUẢ 20 3.1 Đánh giá khả sinh trưởng Phytophthora môi trường nuôi cấy khác 20 3.2 Xác định điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus siamensis đối kháng điều kiện phịng thí nghiệm 24 3.2.1 Ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ đến khả sinh trưởng vi khuẩn 24 3.2.2 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng vi khuẩn 27 3.2.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng vi khuẩn .29 ii 3.3 Đánh giá khả kiểm soát nấm Phytophthora spp vi khuẩn Bacillus siamensis điều kiện phịng thí nghiệm 30 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 4.1 Kết luận 35 4.2 Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 iii DANH MỤC VIẾT TẮT BVTV Bảo vệ Thực vật PDA Potato Dextrose Agar (Môi trường nuôi cấy vi sinh vật từ bột khoai tây đường dextrose) PSM Phytophthora Selective Medium (Môi trường chọn lọc Phytophthora) PCA Plate Count Agar V-8 Juice Medium Czapek Czapek Dox Medium (Môi trường nuôi cấy nấm) NA Nutrient Agar (Môi trường nuôi cấy vi khuẩn) KB King’s B(Môi trường nuôi cấy phân lập vi khuẩn) iv DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1: Sự sinh trưởng nấm Phytopthora mơi trường 22 Hình 2: Túi du động bào tử nấm Phytophthora kính hiển vi 23 Hình 3: Hệ sợi nấm Phytophthora sau ngày nuôi cấy 23 Hình 4: Sự phát triển B siamensis qua ngưỡng nhiệt độ sau ngày .26 Hình 5: Sự sinh trưởng B siamensis qua nồng độ pH sau ngày 28 Hình 6: Khuẩn lạc B siamensis hình thành sau ngày nồng độ pha loãng 10-5 .29 Hình 7: Khả đối kháng vi khuẩn B siamensis với nấm Phytophthora spp sau ngày 32 Hình 8: Khả đối kháng vi khuẩn B siamensis với nấm Phytophthora spp sau 12 ngày 34 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Sự phát triển Phytopthora môi trường 20 Bảng 2: Sự sinh triển vi khuẩn Bacillus siamensis sau ngày ngưỡng nhiệt độ, độ ẩm 24 Bảng 3: Sự phát triển vi khuẩn Bacillus siamensis qua nồng độ pH sau ngày 27 Bảng 4: Sự sinh trưởng vi khuẩn Bacillus siamensis ngày 29 Bảng 5: Các nguồn nấm Phytopthora sử dụng thí nghiệm 30 Bảng 6: Khả đối kháng vi khuẩn B siamensis với nấm Phytophthora 30 vi TĨM TẮT Cây cam trồng có giá trị kinh tế cao loại ăn chủ lực Việt Nam Nhưng cam thường gặp tình trạng vàng lá, thối rễ, chảy gôm nấm Phytotphthora gây hại phổ biến Người dân thường sử dụng thuốc hóa học để phịng chống bệnh, nhiên có hiệu lực tạm thời, khơng bền vững, bên cạnh cịn gây ảnh hưởng đến môi trường sức khỏe người dân Đề tài “Đánh giá khả kiểm soát nấm Phytophthora spp gây bệnh chảy gôm cam vi khuẩn Bacillus siamensis” thực nhằm tìm giải pháp phịng chống bệnh hiệu quả, an tồn, bền vững thân thiện với môi trường Bài nghiên cứu sử dụng phương pháp đồng nuôi cấy môi trường PDA Kết cho thấy hiệu lực phòng chống nấm Phytophthora spp gây bệnh chảy gôm cam vi khuẩn đối kháng Bacillus siamensis sau 12 ngày đạt 80,95% Phytophthora citrophthora; 73,81% Phytophthora palmivora Kết luận, vi khuẩn Bacillus siamensis có hiệu lực đối kháng cao với nấm Phytophthora spp vii MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây cam trồng có giá trị kinh tế cao, trồng hầu hết tỉnh thành nước loại ăn chủ lực Việt Nam Cam giàu chất chống oxy hóa phytochemicals, bình qn trái cam có chứa khoảng 170 mg phytochemicals bao gồm chất dưỡng da chống lão hóa Điều mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe như: hỗ trợ tiêu hóa, chống ung thư, tăng cường thị lực, tránh cảm cúm, giảm nguy mắc bệnh tim mạch, nhanh lành vết thương, tốt cho da, hỗ trợ giảm cân Theo số liệu thống kê Bộ Nông nghiệp Phát triển nơng thơn, diện tích cam có tăng trưởng nhanh mười năm trở lại đây, năm 2013 diện tích khoảng 53.800 ha, năm 2018 diện tích tăng lên 97.400 sản lượng khoảng 840.000 tấn, đến hết năm 2021 diện tích trồng cam chiếm khoảng 100.000ha, sản lượng đạt 1.545,9 nghìn Diện tích trồng cam gia tăng, tình trạng cam nhiễm bệnh khiến còi cọc, chất lượng giảm, non rụng hàng loạt, giá bán thấp làm người trồng cam thất thu khơng có lãi xảy ngày phổ biến Nhiều diện tích trồng vùng trồng cam nước như: Hà Giang, Hịa Bình, Nghệ An, Tiền Giang… phải hủy bỏ chuyển sang trồng trồng khác Khơng diện tích cam trồng mà diện tích cam lâu năm, thời kỳ kinh doanh khơng kiểm sốt tốt dịch hại đất dẫn đến tình trạng bị vàng lá, thối rễ dẫn đến bị suy yếu chết Một tác nhân gây tượng vàng lá, thối rễ phải kể đến nấm tuyến trùng đất gây hại, đặc biệt phải kể đến nấm Phytophthora gây hại phổ biến, chúng xuất hầu hết vùng trồng cam nước Ngoài gây tượng vàng lá, thối rễ chúng gây tượng chảy gơm (xì mủ) thân cây, khơng gây hại cam nấm Phytophthora phát sinh, gây hại nhiều đối tượng Hình 2: Túi du động bào tử nấm Phytophthora kính hiển vi Hình 3: Hệ sợi nấm Phytophthora sau ngày nuôi cấy 23 3.2 Xác định điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus siamensis điều kiện phịng thí nghiệm 3.2.1 Ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ đến khả sinh trưởng vi khuẩn Bảng 2: Sự sinh trưởng vi khuẩn Bacillus siamensis sau ngày ngưỡng nhiệt độ, độ ẩm Cách cấy Cấy ria Cấy điểm Sự phát triển vi khuẩn theo nhiệt độ 25oC 32oC 45oC 55oC Hình thành Hình thành Hình thành Khơng hình khuẩn lạc khuẩn lạc khuẩn lạc thành khuẩn lạc 1±0,1 (cm) 0,4±0,1 (cm) 0,5±0,1 (cm) Thí nghiệm thực ngưỡng nhiệt độ 25oC, 32oC, 45oC, 55oC cách thức cấy ria cấy điểm Kết cho thấy sau ngày, phương thức cấy ria khuẩn lạc có hình thành ngưỡng nhiệt độ 25oC, 32oC, 45oC, nhiệt độ 55oC khuẩn lạc khơng hình thành đường cấy Bằng phương pháp cấy điểm, khuẩn phát triển mạnh ngưỡng nhiệt 45o với kích thước đường kính 1cm sau ngày ni cấy; ngưỡng nhiệt độ 55oC điểm cấy khuẩn giữ nguyên trạng thái ban đầu, khơng có phát triển kích thước Vậy khuẩn B siamensis khuẩn có khả chịu nhiệt cao, phù hợp phát triển khoảng nhiệt độ từ 25oC đến 45oC 24 A B 25 C D Hình 4: Sự phát triển B siamensis qua ngưỡng nhiệt độ sau ngày A: Sự phát triển B siamensis nhiệt độ 25oC sau ngày B: Sự phát triển B siamensis nhiệt độ 32oC sau ngày C: Sự phát triển B siamensis nhiệt độ 45oC sau ngày D: Sự phát triển B siamensis nhiệt độ 55oC sau ngày 26 3.2.2 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng vi khuẩn Bảng 3: Sự phát triển vi khuẩn Bacillus siamensis qua nồng độ pH sau ngày Cách cấy Cấy ria Cấy điểm Sự phát triển vi khuẩn theo pH pH = pH = pH = Hình thành Hình thành Hình thành khuẩn lạc khuẩn lạc khuẩn lạc 0,6±0,1 (cm) 0,7±0,1 (cm) 0,4±0,1 (cm) Thí nghiệm thực ngưỡng pH: pH = (môi trường axit), pH = (mơi trường trung tính), pH = (môi trường kiềm) Kết cho thấy khuẩn lạc hình thành nồng độ pH, phát triển mạnh mơi trường trung tính pH = với kích thước đường kính đạt 0,7cm sau ngày Vậy khuẩn B siamensis có khả phát triển mơi trường axit, trung tính kiềm với ngưỡng pH từ đến A 27 B C Hình 5: Sự sinh trưởng B siamensis qua nồng độ pH sau ngày A: Sự sinh trưởng B siamensis nồng độ pH = B: Sự sinh trưởng B siamensis nồng độ pH = C: Sự sinh trưởng B siamensis nồng độ pH = 28 3.2.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng vi khuẩn Bảng 4: Sự sinh trưởng vi khuẩn Bacillus siamensis ngày Thời gian nuôi cấy Mật độ vi khuẩn Bacillus siamensis (cfu/ml) Sau ngày 4,49x105 Sau ngày 6,75x105 Sau ngày 8,74x105 Sau ngày 7,42x105 Sau ngày 3,8x105 Thí nghiệm thực ngày thu kết bảng Kết cho thấy mật độ tế bào B siamensis cao vào ngày thứ đạt 8,74x105 cfu/ml Mật độ tế bào tăng dần từ ngày đến ngày (4,49x105 cfu/ml đến 8,74x105 cfu/ml) bắt đầu giảm từ ngày thứ đến ngày thứ mật độ vi khuẩn 3,8x105 cfu/ml Vậy thời gian thích hợp để nhân sinh khối vi khuẩn B siamensis môi trường lỏng ngày Hình 6: Khuẩn lạc B siamensis hình thành sau ngày nồng độ pha loãng 10-5 29 3.3 Đánh giá khả kiểm soát nấm Phytophthora spp vi khuẩn Bacillus siamensis điều kiện phịng thí nghiệm Bảng 5: Các nguồn nấm Phytopthora sử dụng thí nghiệm STT Kí hiệu mẫu Tên khoa học Thơng tin Phy1 Phytophthora Phân lập cam LV, V2 citrophthora Hịa Bình Phytophthora Phân lập bưởi Hịa palmivora Bình Phytophthora Phân lập cam LV, V2 palmivora Hưng Yên Phy2 Phy3 (Nguồn nấm bệnh Viện BVTV) Bảng 6: Khả đối kháng vi khuẩn B siamensis với nấm Phytophthora Khả đối kháng vi khuẩn Bacillus siamensis với nấm Phytophthora spp gây bệnh cam Phy1 Phy2 Phy3 Thời Đối Đối Hiệu Đối Đối Hiệu Đối Đối Hiệu gian chứng kháng lực chứng kháng lực chứng kháng lực (cm) (cm) phòng (cm) (cm) phòng (cm) (cm) phòng trừ trừ trừ (%) (%) (%) Ngày 2,1 0,8 61,90 2,4 1,1 54,17 2,1 1,9 9,52 Ngày 2,8 0,8 71,43 1,1 63,33 1,9 36,67 Ngày 10 3,7 0,8 78,38 3,7 1,1 70,27 3,7 1,9 48,65 Ngày 12 4,2 0,8 80,95 4,2 1,1 73,81 4,2 1,9 54,76 30 Sau nuôi cấy ngày, sinh trưởng nấm Phytophthora bị giới hạn gặp vi khuẩn B siamensis, bán kính tản nấm đĩa có cấy khuẩn nhỏ bán kính đĩa đối chứng Sau 12 ngày, đĩa đối chứng không cấy khuẩn B siamensis nấm Phytophthora sinh trưởng phát tốt đạt đường kính tối đa đĩa cấy khuẩn bán kính nấm Phytophthora không phát triển thêm Hiệu ức chế vi khuẩn B siamensis với nấm Phytophthora gây bệnh cam đạt từ 54,76 – 80,95% sau 12 ngày Vi khuẩn B siamensis có hiệu ức chế nấm bệnh Phytophthora từ 36,67 – 71,43% sau ngày; 54,76 – 80,95% sau 12 ngày Trong B siamensis có khả ức chế nấm bệnh cao với Phy1, đạt 61,90% sau ngày; 71,43% sau ngày; 78,38% sau 10 ngày; 80,95% sau 12 ngày Hiệu úc chế thấp với Phy3 đạt 9,52 sau ngày; 36,67 sau ngày; 48,65 sau 10 ngày; 54,76 sau 12 ngày Vậy vi khuẩn B siamensis có khả ức chế nấm bệnh cao Phy1 Phy2 với 80,95% 73,81% sau 12 ngày A 31 B C Hình 7: Khả đối kháng vi khuẩn B siamensis với nấm Phytophthora spp sau ngày A: Khả đối kháng B siamensis với Phy1 sau ngày B: Khả đối kháng B siamensis với Phy2 sau ngày C: Khả đối kháng B siamensis với Phy3 sau ngày 32 A B 33 C Hình 8: Khả đối kháng vi khuẩn B siamensis với nấm Phytophthora spp sau 12 ngày A: Khả đối kháng B siamensis với Phy1 sau 12 ngày B: Khả đối kháng B siamensis với Phy2 sau 12 ngày C: Khả đối kháng B siamensis với Phy3 sau 12 ngày 34 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Mơi trường thích hợp để nuôi cấy nấm Phytophthora PSM, PCA, V-8 - Vi khuẩn B siamensis khuẩn có khả chịu nhiệt cao khoảng nhiệt độ từ 25oC đến 45oC; chúng có khả phát triển mơi trường axit, trung tính kiềm với ngưỡng pH từ đến 9; thời gian tối ưu để nhân sinh khối vi khuẩn B siamensis môi trường lỏng ngày - Hiệu lực phòng chống nấm Phytophthora spp gây bệnh chảy gôm cam vi khuẩn đối kháng Bacillus siamensis sau 12 ngày cao đạt 80,95% Phytophthora citrophthora; 73,81% Phytophthora palmivora 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu thử nghiệm đánh giá đối kháng vi khuẩn B siamensis dòng nấm Phytophthora spp khác gây bệnh chảy gôm cam - Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng để sản xuất chế phẩm sinh học phòng chống nấm Phytophthora gây bệnh cam loại trồng khác 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO TRONG NƯỚC Hoàn N T (2019) Nghiên cứu vi sinh vật nội sinh đối kháng nấm gây bệnh thực vật hồ tiêu Đắk Lắk Luận văn Thạc sĩ học thực nghiệm Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Hồng T T., Cúc N T K., Cường P V & Hoài P T T (2014) Phân lập vi sinh vật đối kháng số nguồn bệnh nấm thực vật đánh giá hoạt tính chúng in vitro in vivo Vietnam Journal of Science and Technology 52(4) - 419 Hiền T M, Cúc T T K, Trúc M T., Ngọc N T B & Bình D T Ứng dụng công nghệ vi sinh sản xuất chế phẩm vi sinh phân hữu vi sinh (2013) Tiên H T C & Thế H V (2019) Phân lập định danh số chủng Bacillus spp có hoạt tính cao tầng đất mặt thu thập từ tỉnh Bình Thuận Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Thực phẩm 18 (2): 48-62 Thủy L T T., Kiều L N & Tuyên H (2017) Tuyển chọn vi sinh vật đối kháng cao với nấm Phytophthora sp gây bệnh chết nhanh, Fusarium sp gây bệnh chết chậm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư hồ tiêu Trang L V K, Mai L T, Nhi V L Y & Lan H T N (2021) Đanh giá hiệu lực ức chế vi khuẩn Bacillus velezensis nấm Phytophthora sp gây bệnh sương mai cà chua Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam Số 01(122) Trung T T., Dũng P L., Quyên T T L., Hợp D V & Lương D T (2013) Đặc điểm sinh học tiềm ứng dụng chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum sp 1901 phân lập Rừng Quốc gia Hoàng Liên Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ Tập 29, Số 3: 59-70 Tuyên N H., Dung P N., Thao L D & Hạnh N T Nghiên cứu số đặc điểm sinh học nấm Phythophthora palmivora gây bệnh thối đen ca cao Việt Nam Tạp chí khoa học cơng nghệ Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO NƯỚC NGOÀI Andrić S., Meyer T & Ongena M (2020) Bacillus Responses to PlantAssociated Fungal and Bacterial Communities Front Microbiol 11: 1350 10 Bourke P M A (1964) Emergence of Potato Blight, 1843–46 Nature volume 203, pages 805–808 11 Caulier S., Gillis A., Colau G., Licciardi F., Liépin M., Desoignies N., Modrie P., Legrève A., Mahillon J., & Bragard C (2018) Versatile Antagonistic Activities of Soil - Borne Bacillus spp and Pseudomonas spp against Phytophthora infestans and Other Potato Pathogens Front Microbiol 9: 143 36 12 Han X , Shen D., Xiong Q., Bao B., Zhang W., Dai T., Zhao Y., Borriss R & Fan B (2021) The Plant-Beneficial Rhizobacterium Bacillus velezensis FZB42 Controls the Soybean Pathogen Phytophthora sojae Due to Bacilysin Production Appl Environ Microbiol 10;87(23) 13 Nikea U., Veronica K., Rebecca D., Justin R.W , Christopher J M., Terry C H., Maria F C., Christopher J G., Regina L (2018) Response of Aquatic Bacterial Communities to Hydraulic Fracturing in Northwestern Pennsylvania: A Five-Year Study Sci Rep 9;8(1):5683 14 Jinal N H & Amaresan N (2020) Evaluation of biocontrol Bacillus species on plant growth promotion and systemic-induced resistant potential against bacterial and fungal wilt-causing pathogens Arch Microbiol 202(7):1785-1794 15 Simon C., Annika G., Gil C., Florent L., Maxime L., Nicolas D., Pauline M., Anne L., Jacques M., Claude B (2018) Versatile Antagonistic Activities of SoilBorne Bacillus spp and Pseudomonas spp against Phytophthora infestans and Other Potato Pathogens Front Microbiol 13;9:143 16 Syed-Ab-Rahman S F., Carvalhais L C., Chua E., Xiao Y., Wass T J & Schenk P M (2018) Identification of Soil Bacterial Isolates Suppressing Different Phytophthora spp and Promoting Plant Growth Front Plant Sci 18;9:1502 17 Wang Y., Liang J., Zhang C., Wang L., Gao W & Jiang J (2020) Bacillus megaterium WL-3 Lipopeptides Collaborate Against Phytophthora infestans to Control Potato Late Blight and Promote Potato Plant Growth Front Microbiol 9;11:1602 37