QUAN TÀI LIỆU
Cây ớt (Capsicum annuum)
Cây ớt là một loại gia vị được trồng rộng rãi trên thế giới và có tầm quan trọng trong thực phẩm của con người, có nguồn gốc từ Nam và Trung Mỹ (Dias GB, 2013); (Wahyuni Y, 2013) Đến nay ớt đã được trồng rộng rãi ở nhiều nơi trên thế giới bao gồm vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và các vùng có khí hậu ôn hòa (Momol, Ken Pernezny and Tim, 2006)
Cây ớt thuộc học Cà (Solanaceae) chi ớt (Capsicum) có hơn 25 loài trong đó chỉ có 5 loài C.annuum, C chinense, C baccatum, C frutescens và C pubescens được thuần hóa và trồng ở nhiều nới trên thế giới Trong
5 loài được trồng trên thì C.annuum là một trong những loài được trồng phổ biến nhất trên thế giới (Tong N, Bosland PW, 1999) tiếp theo đó là
C frutescens ( Bosland PW, Votava EJ, 2003)
Phân lớp: Magnoliidae Bộ: Solanales
Hình 1.1 Cây ớt (Capsicum annuum) Nguồn: Internet
1.1.3 Đặc điểm Ớt thuộc loài thân thảo mọc tại những nước ôn đới, sống lâu năm và thân phía dưới hóa gỗ ở những nước nhiệt đới Cây có nhiều cành Lá mọc so le, hình thuôn dài, đầu nhọn, phía cuống cũng thuôn hẹp, có cuống, phiến lá dài 2 - 4 cm, rộng 1,5 – 2 cm Quả mọc rũ xuống hoặc quay lên trời, hình dáng thay đổi, khi thì tròn, khi thì dài, đầu nhọn Quả chưa chín có màu xanh hoặc tím, quả chín màu vàng hoặc đỏ Có loại rất cay, có loại ít cay tùy theo giống và điều kiện canh tác (Đỗ Tất Lợi, 2004) Hạt ớt nhỏ dẹp, dạng thận, màu vàng rơm, chiều dài khoảng 3 – 5 mm Cây thường cao khoảng 0,5 – 1,5 m Ớt có rễ cọc với nhiều rễ phụ nhưng trong gieo trồng việc cấy chuyển cây làm rễ bị đứt và phát triển thành một hệ rễ chùm
Theo khóa phân loại của Paul G Smith Capsicum annuum có cánh hoa đồng màu, từ trắng đến xanh vàng sáp (không có đốm hay màu tương phản khác) Bao phấn xanh tái đến tím Hoa đơn độc (đôi khi 2 hoa trên mắt đầu tiên), tràng hoa trắng hoặc trắng lẫn tím, đài hoa tách biệt ở cuối, có răng nhỏ ở mép
1.1.4 Giá trị dinh dưỡng Ớt rất giàu protein, lipid, carbohydrate, chất xơ, muối khoáng (Ca, P, Fe) và các vitamin A, D3, E, C, K, B2 và B12 (El-Ghoraba et al 2013) Các hợp chất phytochemical trong ớt có quan hệ mật thiết đến sức khỏe chẳng hạn như acid ascorbic (Vitamin C), carotenoids (Provitamin A), tocopherols (Vitamin E), flavonoid và capsaicinoids rất quan trọng trong việc ngăn ngừa các bệnh mãn tính như ung thư, hen suyễn, ho, viêm họng, đau răng, tiểu đường và các bệnh tim mạch (El-Ghoraba AH, 2013) (Wahyuni Y, 2013)
Ngoài ra ớt còn có đặc tính chống oxy hóa, chống đột biến gen, giảm cholesterol trong máu ức chế miễn dịch (El-Ghoraba AH, 2013) đồng thời ức chế sự phát triển của vi khuẩn và kết tụ tiểu cầu (Wahyuni Y, 2013)
Bảng 1.1: Thành phần các chất có trong 100 gram phần ăn được của Ớt (Đặng
Thành phần Hàm lượng Thành phần Hàm lượng Ẩm độ 85,7 g P 80 mg
Riboflavin 0,39 mg Vitamin C 111 mg Acid oxalic 67 mg
Bệnh thán thư trên cây ớt
Bệnh thán thư (Anthracnose) có nguồn gốc từ tiếng Hy lạp có nghĩa
“coal”, biểu hiện đặc điểm vết bệnh có màu tối như than, vết bệnh lõm xuống xuất hiện các vòng đồng tâm, có chứa các khối bào tử (Isaac S, 1992)
Bệnh thán thư trên ớt lần đầu tiên được báo cáo tại New Jersey Hoa
Kỳ bởi (Halsted BD, 1890) đã mô tả các tác nhân gây bệnh là
Gloeopsorium piperatum và Colletotrichum nigrum Bệnh có thể gây hại trên diện rộng trước và sau khi thu hoạch chúng cũng có thể là mầm bệnh tiềm ẩn vì đôi khi chúng không phát triển cho đến khi quả chín Bệnh có thể gây hại trên lá, thân trái trước và sau thu hoạch (Isaac S, 1992) Bệnh thán thư trên ớt đã được nghiên cứu là do nấm Colletotrichum spp gây ra bao gồm nấm C acutatum (Simmonds), C capsici (Syd.) Butler và Bisby, C gloeosporioides (Penz.) (Momol, 2006)
Nhiệt độ và các yếu tố khác chẳng hạn như độ ẩm bề mặt lá, độ ẩm, ánh sáng hoặc hệ vi sinh vật cạnh tranh (Royle DJ, Butler DR, 1986) thưởng ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ sinh trưởng của nấm Bề mặt ẩm ướt ảnh hưởng trực tiếp nhất đến sự nảy mầm, lây nhiễm và phát triển của mầm bệnh trên vật chủ Nói chung sự xâm nhiễm xảy ra trong nhiệt độ ấm, ẩm ướt Nhiệt độ khoảng 27 °C và độ ẩm cao (trung bình là 80 %) là tối ưu cho sự phát triển của bệnh thán thư (Roberts PD, 2001)
Ngành phụ: Pezizomycotina Lớp: Sordariomycetes
Colletotrichum capsici Colletotrichum coccodes Colletotrichum gloeosporioides Colletotrichum nigrum
1.2.3 Triệu chứng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum sp gây ra
Bệnh thán thư có thể gây hại trên lá, thân và trái còn non hoặc trái trưởng thành
Triệu chứng điển hình trên quả là các vết bệnh lõm hình tròn hoặc hình thoi, với các vòng tròn đồng tâm trên quả thường ẩm ướt và tạo ra các khối bào tử màu hồng đến cam, ranh giới giữa các mô bệnh là một đường đen chạy dọc theo vết bệnh sau 2-3 ngày kích thước vết bệnh có thể lên đến 1 cm Trên bề mặt vết bệnh có những chấm nhỏ màu đen là đĩa cành của nấm bệnh Các vết bệnh có thể liên kết với nhau làm quả bị thối, vỏ khô có màu trắng vàng bần (QCVN 01 - 138:2013/BNNPTNT)
Triệu chứng bệnh trên lá ban đầu là các đốm tròn màu xám, sau đó dần lên thành các đốm màu nâu, khô, hình tròn hoặc bầu dục (QCVN 01- 138:2013/BNNPTNT)
1.2.4 Cơ chế gây bệnh thán thư do vi nấm Colletotrichum sp
1.2.4.1 Chu kì gây bệnh thán thư của vi nấm Colletotrichum sp
Colletotrichum sp có thể tồn tại ở dạng bào tử đính và quả thể của nấm Nấm có thể tồn tại qua mùa đông nhờ vào các cây kí chủ thuộc họ cà hoặc cây họ đậu khác nhau, các tàn dư sau thu hoạch, hay các cây nhiễm bệnh còn sót lại trên đồng ruộng khi ở trạng thái ngủ Các bào tử
B Hình 1.2 Colletotrichum sp gây bệnh trên quả (A), Colletotrichum sp gây bệnh trên lá (B) hoặc nước mưa sẽ làm bào tử nấm xâm nhiễm và lây lan từ cây này sang cây khác, người canh tác hay dụng cụ lao động cũng có thể lây mầm bệnh cho cây (Roberts PD, 2001)
1.2.4.2 Cơ chế gây bệnh của vi nấm Colletotrichum sp
Theo (Than PP, 2008) các loài Colletotrichum sp sử dụng các cách khác nhau cho sự xâm nhiễm các mô chủ, mà thay đổi từ bán ký sinh nội bào đến hoại dưỡng ở vách dưới biểu bì (Bailey JA, 1992) Loài
Colletotrichum sp sản xuất một loạt các cấu trúc xâm nhiễm chuyển hóa như đĩa áp và vòi xâm nhiễm, khuẩn ty nấm sơ cấp và khuẩn ty nấm hoại dưỡng thứ cấp (Perfect SE, 1999) Giai đoạn trước xâm nhiễm của cả hai rất giống nhau, trong đó bào tử bám chặt vào và nẩy mầm trên bề mặt cây trồng, tạo ra đĩa áp và hình thành vòi xâm nhiễm sau đó xâm nhiễm vào các lớp biểu bì (Bailey JA, 1992) Sau khi xâm nhiễm, các mầm bệnh ở trong vùng vách bên dưới lớp biểu bì sống hoại dưỡng và nhanh chóng
Hình 1.3 Chu kì gây bệnh của vi nấm Colletotrichum sp phát hiện trong hình thức hoại sinh Ngược lại, các mầm bệnh thán thư cho thấy sự xâm nhiễm dinh dưỡng hoại sinh và sống bằng cách ký sinh vào các màng sinh chất và thành tế bào trong tế bào Sau khi ký sinh, khuẩn ty nấm trong tế bào sống ở trong một hoặc hai tế bào và sau đó sản sinh khuẩn ty nấm hoại dưỡng thứ cấp (Bailey JA, 1992) Do đó, các tác nhân gây bệnh được coi là bán ký sinh hoặc hoại dưỡng (Kim KK, 2004) Chỉ có một vài nghiên cứu chi tiết về cơ chế xâm nhiễm của nhiều loài
Colletotrichum sp trên ớt (Kim KK, 2004) nhận thấy rằng nhiễm hoại sinh được tìm thấy trong quá trình lây nhiễm của C gloeosporioides trong ớt (C annuum cv Jejujaerae) Biểu bì tế bào chất của cấy chủ trở nên cô đặc và nhỏ không bào tăng lên và phá hủy tế bào đến các tế bào biểu bì của thực vật trong đó có thể bị phá hủy bởi các enzymee của mầm bệnh Ở các giai đoạn sau của bệnh, các mô đã bị xâm chiếm ở giữa và trong các tế bào bở các mầm bệnh Đặc điểm cấu trúc này chỉ ra rằng xâm nhiễm bị chi phối bởi sự tăng trưởng nấm hoại sinh
C: Bào tử E: Mô biểu bì
Hình 1.4 Cơ chế xâm nhiễm của vi nấm Colletotrichum sp.vào tế bào ớt
Cu: Biểu bì N: Hoại sinh PP: Hình thành vòi xâm nhiễm SH: Sợi nấm thứ cấp ILS: Đốm sáng (Internal Light Spot) ScH: Dưới lớp biểu bì PH: Sợi nấm sơ cấp
Bào tử (C) mọc mầm và hình thành đĩa áp (A), đĩa áp hình thành vòi xâm nhiễm (PP) xâm nhập qua lớp biểu bì (Cu) của tế bào chủ và trên đĩa áp xuất hiện đốm màu sáng (ILS) Ở hình 1.4 (A), với cách xâm nhiễm bán ký sinh, vòi xâm nhiễm xuyên qua tế bào biểu bì của tế bào chủ và phồng to lên tạo ra khoang xâm nhiễm với sợi nấm có kích thước lớn, được gọi là sợi nấm thứ cấp (PH) Sợi nấm này có thể định vị và lan sang các mô biểu bì (E) và tế bào thịt lá (M) kế bên Trong giai đoạn đầu của sự xâm nhiễm này, sự tương tác giữa ký chủ và mầm bệnh là ký sinh bắt buộc Tiếp theo là giai đoạn hoại sinh (N), sự tương tác được thể hiện qua sự hình thành sợi nấm thứ cấp (SH) Các sợi nấm thứ cấp này đâm xuyên vào trong tế bào và len lõi vào các ngã gian bào đồng thời tiết enzyme phân hủy vách tế bào và giết chết tế bào chủ Ở hình 1.4 (B), là cách xâm nhiễm hoại sinh, sự định cư bên dưới tế bào ký chủ bắt đầu ở bên dưới biểu bì (ScH) và thường không có giai đoạn ký sinh của sợi nấm bên trong vách hoặc nếu có thì giai đoạn này rất ngắn Nấm lây lan nhanh chóng qua các mô, đi vào trong tế bào và qua các gian bào (Dieguez-Uribeondo, 2004).
Vi khuẩn Bacillus sp
Theo khóa phân loại của Bergey, Bacillus sp được phân loại như sau:
1.3.2 Hình dạng và kích thước
Phần lớn Bacillus sp là vi khuẩn hình que hay hình trực, đầu tròn hoặc vuụng, kớch thước từ 0,5-1,2 x 2,5 – 10 àm, ở dạng đơn lẻ hay chuỗi ngắn hoặc dài Đối với Bacillus sp có nội bào tử thì bào tử hình trụ, oval, tròn hoặc bầu dục Tùy loài, bào tử có thể nằm ở giữa, gần cuối hoặc cuối, túi bào tử phồng hoặc không phồng Sự tạo thành nội bào tử được chấp nhận như là một đặc tính cơ bản để phân loại và xác định các thành viên của chi, nhờ các nghiên cứu về B subtilis của Cohn, trong các nghiên cứu về các loài gây bệnh như B anthracis năm 1976 của Knok
Hầu hết các loài Bacillus sp đều di động ngoại trừ B anthracis và B mycoides mặc dù có sự khác biệt về khả năng di động của mỗi loài nhưng đa số các loài đều có phản ứng catalase dương tính
Bacillus sp là vi khuẩn hiếu khí và sinh vật hóa dị dưỡng linh hoạt có khả năng hô hấp trong khi sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ đơn giản (đường, amino acid, acid hữu cơ) Ngoài ra, còn có một số loài vi khuẩn Bacillus sp là dị dưỡng nitơ, khử nitơ, cố định nitơ, kết tủa sắt, oxy hóa selenium, chất khuẩn lạc đặc trưng sau khi nuôi cấy 37 0 C/ 24h Tuy nhiên, cũng có những loài ưa nhiệt chỉ có thể phát triển ở nhiệt độ từ 55 0 C- 70 0 C (B stearothermophilus) B.coagulans là loài ưa nhiệt trung bình, phát triển tốt tại 45 - 55 0 C B.larvae, B.popilliae phát triển ở 25 - 30 0 C, có pH rộng từ 2-
1.3.4 Ứng dụng của Bacillus sp
Bacillus sp được ứng dụng nhiều trong y khoa, dược phẩm, nông nghiệp, công nghiệp môi trường nhờ tận dụng các lợi thế về đặc điểm sinh lý của chúng để sản xuất các kháng sinh như: Bacitracin và polymycin là hai kháng sinh nổi tiếng thu được từ vi khuẩn Bacillus sp., surfactin vừa có hoạt tính kháng khuẩn vừa có tính diện hoạt mạnh, subtilin có hoạt tính kháng khuẩn, kháng khối u, (Hong H A., 2005)
Trong nghiên cứu của (Sung-Jin Park, 2012), báo cáo sự lắng đọng sinh học của Bacillus subtilis 168 và khả năng tăng cường độ bền của vật liệu xi măng B subtilis 168 đã được áp dụng trên bề mặt của các mẫu xi măng Kết quả cho thấy một lớp hỗn hợp hữu cơ-vô cơ mới lắng đọng trên bề mặt của hồ xi măng Ngoài ra, độ thấm nước của hồ xi măng được xử lý bằng B subtilis 168 thấp hơn so với các mẫu không được xử lý Hơn nữa, các vết nứt nhân tạo trên hồ xi măng đã được khắc phục hoàn toàn nhờ sự lắng đọng sinh học của B subtilis 168 Cường độ nén của vữa xi măng được xử lý bằng B subtilis 168 tăng khoảng 19,5 % khi so sánh với các mẫu hoàn thành chỉ với môi trường B4 Tổng hợp lại, những phát hiện này cho thấy rằng sự lắng đọng sinh học của B subtilis 168 có thể được sử dụng như một chất làm kín và phủ để cải thiện cường độ và khả năng chống thấm nước của bê tông Đây là bài báo đầu tiên báo cáo ứng dụng của Bacillus subtilis 168 về khả năng cải thiện độ bền của vữa xi măng thông qua kết tủa canxi cacbonat
Bacillus megaterium có họat tính kháng nấm bệnh Phytophthora capsici, Pythium, Rhizotocnia mạnh do sản sinh một số hoạt chất kháng phần của thuốc trừ sâu Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis sp làm chế phẩm Israelensisserotype H14 diệt lăng quăng Các bào tử của
B.stearothermophilus được sử dụng để kiểm tra khử trùng nhiệt và B. subtilis sp với khả năng chịu nhiệt, hóa chất và bức xạ được sử dụng rộng rãi để xác nhận việc khử trùng và khử trùng thay thế
Nghiên cứu và sản xuất chế phẩm sinh học từ Bacillus có tiềm năng trong việc đóng góp vào sự phát triển của việc nuôi cá bằng cách duy trì sức khỏe của cá nuôi giúp cá tăng trưởng, phân giải thức ăn, đáp ứng miễn dịch, bảo vệ chống lại các bệnh nhiễm trùng, đặc biệt là chống lại các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn cũng như cải thiện chất lượng nước (Kuebutornye, 2019)
Van Frankenhuyzem đã nghiên cứu về việc sử dụng Bacillus thuringiensis để kiếm soát sâu chồi vân sam một loài sâu làm rụng lá của cây Kim tại Bắc Mỹ Sau khi sử dụng chế phẩm sinh học từ Bacillus thuringiensis đã kiểm soát sinh học được sâu chồi vân sam (Van Frankenhuyzen, 2000)
Năm 2015, Mujal và cộng sự công bố chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ rễ hồ tiêu Bacillus megaterium có hoạt tính kháng nấm bệnh
Phytophthora capsici, Pythium, Rhizotocnia mạnh do sản sinh một số hợp chất kháng nấm Aravildet al., (2009, 2010), đã phân lập 71 chủng vi khuẩn nội sinh trong rễ và thân cây hồ tiêu và tuyển chọn được 3 chủng có khả năng ức chế nấm thối rễ hồ tiêu Phytophthora capsici tới 70 % trong điều kiện phòng thí nghiệm và mô hình trong nhà lưới (Munjal, 2015)
Nguyễn Ngọc Mỹ (2012) đã phân lập được 30 chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ và tuyển chọn được chủng B cereus M15 là chủng có hoạt tính cố định N và phân giải P cao nhất Hàm lượng N và P trong lá cây của cây cà phê chè giai đoạn vườn ươm như: chiều cao cây, đường kính gốc, chiều dài lá và diện tích lá cũng đều tăng so với đối chứng (Mỹ, 2012).
Bacillus sp và chất chuyển hóa kháng nấm của Bacillus sp
Hiện nay, có rất nhiều chất kháng nấm là các sản phẩm chuyển hóa của
Bacillus Các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm đã được khai thác trong y học và ngành công nghiệp Đồng thời các chất kháng nấm này thường sử dụng để phòng chống và kiểm soát bệnh trên cây như một tác nhân kiểm soát sinh học Các hợp chấtt này thường là enzyme thủy phân hay là các peptid có hoạt tính sinh học, hoặc các hợp chất polyketide (Zhang
T và cs, 2008; Kumar A và cs, 2009)
Enzyme: Bacillus có khả năng sản xuất nhiều loại enzyme phân hủy thành tế bào nấm như chitinase, protease, glucanase… Các enzyme này phá hủy thành tế bào của nấm, đặc biệt là chitinase Nhiều chủng Bacillus có thể sản xuất enzyme chitinase ở mức cao do đó làm gia tăng khả năng kháng nấm
Các peptide: dựa vào đặc điểm cấu trúc của peptid, nó có thể được phân thành 3 loại: cyclic lipopeptide (CLP), phosphono-oligopeptide và dipeptide
+ Fengycin là lipopeptide vòng có hoạt tính đối kháng mạnh với nấm
Fengycin được tổng hợp nhiều trong pha tăng trưởng và đạt nồng độ cực đại ở cuối pha tăng trưởng, fengycin vẫn được duy trì ở nồng độ thấp với hàm lượng ổn định trong pha cân bằng (Tsuey-Pin Lin,1999)
+ Mycosubtilin là lipopeptide có tính kháng sinh thuộc họ iturin Các lipopeptide thuộc họ iturin có tính đối kháng mạnh với nấm nhưng có tác động rất hạn chế với vi khuẩn (Erwin H Duitman,1999)
+ Bacilysocin là phospholipid có tính kháng khuẩn mạnh đối với nấm, được tổng hợp khi bắt đầu pha cân bằng sau đó thì giảm dần Bacilysocin là kháng sinh có bản chất phospholipid được phát hiện đầu tiên trên Bacillus subtilis Cấu trúc của bacilysocin là 1-(12- hợp từ tiền chất là phosphatidylglycerol, là một phospholipid chủ yếu của
Bacillus subtilis Quá trình chuyển phosphatidylglycerol thành bacilysocin được thực hiện bởi enzymee lysophospholypase được mã hóa bởi gene ytpA (Norimasa Tamehiro, 2002).
Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước của Bacillus sp kháng nấm bệnh thán thư
1.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước
Trần Thùy Trang đã tiến hành phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis có khả năng đối kháng tốt với nấm Colletotrichum scovillei gây bệnh thán thư trên ớt ở Thành phố Hồ Chí
Minh Sau khi thu thập được 5 mẫu đất, nghiên cứu này đã phân lập được
22 chủng nghi ngờ thuộc nhóm Bacillus subtilis Trong đó, chủng vi khuẩn BHCM8.3 có khả năng đối kháng mạnh nhất với nấm Colletotrichum scovillei trên đĩa Petri (hiệu quả đối kháng là 81,58 % sau 15 ngày khảo sát)
Bệnh khô cành cây cà phê là một trong những bệnh hại quan trọng tại Đắk Nông Nghiên cứu này cho thấy kết quả phân lập 55 mẫu cà phê ở tỉnh Đắk Nông có 3 nhóm nấm chính gây bệnh khô cành khô quả, trong đó nhóm
Colletotrichum CC1.5 có khả năng gây bệnh nhanh và mạnh Trong 21 chủng Bacillus sp phân lập ở đất rừng nguyên sinh và đất vườn cà phê khỏe mạnh tại Đắk-Nông, chủng Bacillus subtilis ĐR2B1 có khả năng đối kháng tốt với Colletotrichum CC1.5 ở phương pháp đối kháng trực tiếp 67,41 % và đối kháng khuếch tán qua lỗ thạch 24,67 mm sau 6 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA Nghiên cứu này góp phần cung cấp thêm thông tin về sử dụng vi khuẩn đối kháng trong phòng chống nấm Colletotrichum gây bệnh khô cành khô quả cây cà phê (Nguyễn Bá Thọ, 2020)
1.5.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước thấy trong xét nghiệm đối kháng Quan sát bằng kính hiển vi cho thấy sự phân giải sợi nấm rõ ràng và sự thoái hóa của thành tế bào nấm Trong nuôi cấy đối kháng dạng lỏng, chủng B subtilis ức chế C Gloeosporioides lên đến 100 % (N Ashwini, 2013)
Bacillus subtilis YJH-051 được phân lập từ ruộng trồng tiêu được thử nghiệm để kiểm soát sinh học cho thấy có khả năng ức chế đối với nấm C gloeosporioides và ngăn chặn bệnh thán thư trên ớt Rất nhiều Bacillus subtilis có thể kiểm soát sinh học đã được xác định và sử dụng trên thế giới, Bacillus subtilis YJH-051 có tiềm năng phát triển như một chất kiểm soát sinh học có sẵn trên thị trường để bảo vệ ớt đối với bệnh thán thư do C gloeosporioides gây ra (Yoo, 2009)
Phân lập Bacillus subtilis từ quả và hạt ớt đã ức chế sự phát triển in vitro và sự nảy mầm của bào tử nấm Colletotrichum capsici và Colletotrichum gloeosporioides, tác nhân gây bệnh thán thư trên ớt Trên môi trường thạch khoai tây, vi khuẩn gây ra sự ức chế 64,6 % và 67,2 % đối với sự phát triển sợi nấm của C capsici và C gloeosporioides tương ứng Sự ức chế hoàn toàn trong sự nảy mầm của bào tử đã được ghi nhận đối với cả hai loại nấm khi có sự hiện diện của vi khuẩn trong 24 giờ sau khi nuối cấy Dịch lọc nuôi cấy trong nước của B subtilis cũng ức chế sự phát triển và nảy mầm của Colletotrichum spp., (Meon, 1994)
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Phân lập các chủng vi nấm
Colletotrichum sp từ ớt bệnh thán thư
Hoạt hóa bộ sưu tập chủng vi khuẩn
Bacillus sp Định danh truyền thống và sinh học phân tử vi nấm
Kiểm tra đại thể và vi thể bộ sưu tập chủng vi khuẩn
Sàng lọc khả năng đối kháng của bộ sưu tập chủng vi khuẩn Bacillus sp với vi nấm
Gây bệnh nhân tạo vi nấm
Colletotrichum sp lên quả ớt
Quan sát hình thái vi nấm
Colletotrichum sp đã phân lập Đánh giá phần trăm ức chế vi nấm Colletotrichum sp của bộ sưu tập vi khuẩn Bacillus sp
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Vật liệu nghiên cứu
- Bộ sưu tập 7 chủng vi khuẩn Bacillus sp KT2, Bacillus polyfermenticus F27,
Bacillus sp TS3, Bacillus amyloliquefaciens T3, Bacillus subtilis Q111, Bacillus sp PH3, Bacillus subtilis S29 có tiềm năng được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh, Khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
- Mẫu ớt bệnh được thu thập tại thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng.
Thiết bị, dụng cụ, môi trường
2.3.3 Môi trường, hóa chất và thuốc nhuộm
- TSA, TSB, PDA, PDB, PDA 2X
- NaCl, cồn 96 0 , cồn 70 0 , Glycerol, Tween 80
- Thuốc nhuộm Crystal violet, Safranin O, Lugol, Lactophenol.
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phân lập nấm gây bệnh thán thư Colletotrichum sp
Bệnh có thể hại thân, lá, quả và hạt, nhưng hại chủ yếu trên quả vào giai đoạn chín Triệu chứng bệnh trên lá ban đầu là các đốm tròn màu xám, sau đó lớn dần lên thành các đốm màu nâu, khô, hình tròn hoặc bầu dục Vết bệnh phát triển lớn lên và liên kết nhau làm khô cháy một mảng lá làm lá úa vàng và rụng Triệu chứng trên trái ban đầu là một đốm nhỏ, hơi lõm, ướt trên bề mặt vỏ quả, sau 2-3 ngày kích thước vết bệnh có thể lên tới 1cm đường kính Vết bệnh thường có hình thoi, lõm, phân bệnh Trên bề mặt vết bệnh có những chấm nhỏ là đĩa cành của nấm bệnh Các vết bệnh có thể liên kết với nhau làm quả bị thối, vỏ khô có màu trắng vàng bần (Lester W Burgess, 2009)
Xử lí mẫu và phân lập:
- Thu mẫu ớt có có biểu hiện bệnh thán thư
- Rửa sạch với nước để loại bỏ đất bụi và các tạp chất khác
- Khử trùng bề mặt quả bằng ethanol 70 % bằng cách nhúng nhanh quả ớt vào ethanol 70 % trong 5 giây
- Rửa lại bằng nước vô trùng và để khô trên giấy thấm vô trùng
- Dùng dao đã khử trùng cắt những mẫu nhỏ (2 x 2 mm) từ phần ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh
- Đặt mẫu lên môi trường PDA
- Ủ đĩa cấy ở nhiệt độ 28 o C trong 7 ngày
- Sau 2-5 ngày, các tản nấm phát triển từ những mẫu ớt Lựa chọn những khuẩn lạc có hình thái đặc trưng của chủng Colletotrichum sp ở giai đoạn đầu là khuẩn lạc có màu ửng hồng ở tâm, sợi nấm phát triển sát dưới thạch agar, không bung sợi tơ lên như các dòng nấm khác
- Cấy truyền những khuẩn lạc đặc trưng (cắt ở mép ngoài tản nấm) sang môi trường PDA để tạo dòng thuần
- Khi nuôi từ ngày thứ 4 trở lên, khuẩn lạc nấm ban đầu có màu trắng, sẽ xuất hiện một số vết đen ở mặt dưới thạch, đây là dấu hiệu đặc trưng của các loài Colletotrichum sp (Lester W Burgess, 2009)
2.4.2 Làm thuần Để làm thuần nấm mốc tiến hành phương pháp cấy đơn bào tử trên môi trường PDA, ủ đĩa cấy ở nhiệt độ 28 o C trong vòng 7 ngày
2.4.3 Quan sát đại thể và vi thể các mẫu nấm bệnh thán thư phân lập được
- Quan sát vi thể: để quan sát tiến hành làm tiêu bản nấm mốc, rồi quan sát hình thái học dưới kính hiển vi ở vật kính 10X, 40X
2.4.4 Gây bệnh nhân tạo các chủng vi nấm Colletotrichum sp lên quả ớt
- Trái ớt xanh và chín khỏe, không bệnh
- Quả ớt thuộc giống ớt sừng ở giai đoạn còn xanh được ngâm trong nước Javen (NaClO) 1 % (w/v) trong 5 phút để khử trùng và trung hòa các loại hóa chất và vi sinh vật trên bề mặt vỏ quả Sau đó rửa nhẹ bằng nước cất vô trùng hai lần
- Dựng phương phỏp tạo vết thương trờn vỏ quả hoặc tiờm trực tiếp 20 àl huyền phù bào tử nấm bệnh vào quả ớt Đặt mẫu ớt vào hộp nhựa, kích thước (20 x 30 x 10 cm) bên trong có lót giấy ẩm, sau đó được ủ ở 28 o C Biểu hiện bệnh thán thư được khảo sát sau 3, 5, 7, 9 ngày từ lúc tiêm chủng Chỉ tiêu đo là phần trăm (%) kích thước vết bệnh so với kích thước toàn bộ quả (P Montri, 2009)
- Đặt những quả ớt đã chuẩn bị sẳn lên khay nhựa, phun ẩm
- Hòa dịch bào tử nấm đạt mật độ 10 6 bào tử/ mL, sau đó dùng micropipet nhỏ vài giọt dịch bào tử lên quả để gây bệnh
- Phủ nilon lên trên để cách li và giữ ẩm Theo dõi sự biểu hiện triệu chứng bệnh hàng ngày (Trần Thị Miên, 2008) (Phạm Đình Quân, 2009)
2.4.5 Định danh chủng nấm gây bệnh thán thư Colletotrichum sp
2.4.5.1 Định danh bằng phương pháp truyền thống
Làm tiêu bản nấm mốc:
- Cách 1: lấy một lam kính sạch, trong, đã sấy khô Nhỏ 1 giọt lactophenol lên giữa lam kính Dùng que cấy nhọn đầu lấy một phần khóm nấm mọc trên đĩa thạch môi trường PDA (cả phần mọc trên và hay que cấy nhọn dìm nấm vào giọt dung dịch lactophenol để thấm ướt Khi nấm bị thấm ướt hoàn toàn thì đậy lá kính lamen lên trên và ép nhẹ (Nguyễn Đức Lượng, 2011)
- Cách 2: lấy một lam kính sạch, trong, đã sấy khô Cắt một khung giấy lọc hình vuông cạnh 2 cm và có độ dày của cạnh khung là 0,3 cm Đặt khung giấy lên giữa lam kính rồi bơm dịch môi trường PDA bán lỏng (cỡ 10 μL) lên lam kính vào giữa khung giấy Tiếp đến cấy nấm lên trên môi trường vừa mới bơm vào (cấy đơn bào tử hay cấy đỉnh sợi nấm) Đậy lamen lên và đặt lên thanh chữ U trong buồng ẩm (ở đây sử dụng đĩa petri bên trong có chứa bông gòn ướt bên trên có đặt thanh chữ U bằng thủy tinh) Để trong 2 ngày, lấy lam kính ra bỏ khung giấy lọc, tiến hành nhuộm bằng lactophenol và quan sát (Nguyễn Đức Lượng, 2011)
2.4.5.2 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử
Sau khi đã được định danh đến chi Colletotrichum sp bằng phương pháp truyền thống, chủng nấm Colletotrichum sp tiếp tục được định danh đến loài bằng phương pháp giải trình tự tiến hành gửi mẫu ở công ty TNHH DV và
TM NAM KHOA để định danh sinh học phân tử
Bảng 2.1 Mồi được sử dụng trong định danh phân tử nấm Colletotrichum sp
Vùng gen Mồi Trình tự mồi theo chiều 5’ – 3’
2.4.6 Sàng lọc khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus sp thí nghiệm Công nghệ vi sinh, tiến hành hoạt hóa chủng trên môi trường TSB, ủ 37 0 C/ 24 giờ Sau đó, tiến hành cấy ria trên môi trường TSA, ủ 37 0 C/ 24 giờ và kiểm tra hình thái đại thể, vi thể
2.4.6.2 Hoạt hóa chủng vi nấm Colletotrichum sp
- Chủng vi nấm Colletotrichum sp được cấy vào đĩa thạch PDA, ủ 4 - 5 ngày ở 30 ℃
- Đem hòa bào tử vào nước muối NaCl 0,85 % có bổ sung 0,05 % Tween 80 sao cho đạt mật độ bào tử 1 - 2 × 10 6 CFU/ mL (xác định bằng buồng đếm hồng cầu)
- Công thức xác định mật độ bào tử vi nấm bằng buồng đếm hồng cầu:
Số tế bào / 1 mL mẫu = (a×4000×1000)/H
Trong đó: a: Số tế bào trung bình có trong 1 ô nhỏ (V = 1/ 4000 mm 3 ) 4000: Số qui đổi từ 1 ⁄ 4000 mm 3 thành 1 mm 3 1000: Số qui đổi từ 1 mm 3 thành 1 mL (1 mL = 1000 mm 3 ) H: Hệ loãng pha loãng
Tiến hành sàng lọc khả năng đối kháng giữa vi nấm Colletotrichum sp và vi khuẩn Bacillus sp
- Hỳt 10 àL dịch nấm Colletotrichum sp gõy bệnh và vi khuẩn Bacillus sp đối kháng được cấy cách nhau 3 cm trên đĩa môi trường PDA (đường kính 90 mm), cách mép đĩa từ 1-1,5 cm và ủ ở 27 0 C trong 6 ngày
- Hỳt 10 àL dịch nấm Colletotrichum sp gõy bệnh cấy ở tõm trờn đĩa môi trường PDA (đường kính 90 mm), không cấy vi khuẩn Bacillus sp đối kháng (đĩa đối chứng và ủ ở 27 0 C trong 6 ngày) (Jayasuriya
(+) Đối Kháng: Nếu vi khuẩn Bacillus sp có khả năng kháng vi nấm
Colletotrichum sp sẽ thấy vùng xung quanh khuẩn lạc của vi khuẩn
Bacillus sp sợi nấm của vi nấm Colletotrichum sp sẽ không sinh trưởng được hoặc sinh trưởng yếu
( - ) Không đối kháng: Nếu vi khuẩn Bacillus sp không có khả năng kháng vi nấm Colletotrichum sp sẽ thấy vùng xung quanh khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus sp sợi nấm của vi nấm Colletotrichum sp vẫn phát triển bình thường
Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại
2.4.7 Đáng giá phần trăm ức chế của chủng vi khuẩn Bacillus sp đối với chủng vi nấm Colletotrichum sp
Nếu vi khuẩn Bacillus sp có khả năng ức chế nấm bệnh sẽ thấy nấm
Collectotrichum sp không sinh trưởng hoặc sinh trưởng yếu, và nếu vi khuẩn Bacillus sp không có khả năng ức chế sự phát triển của nấm bệnh sẽ thấy nấm bệnh phát triển bình thường
- Tăng sinh vi khuẩn Bacillus sp trong 50 mL TSB (lắc 200 vòng/ phút trong 48 giờ) cho đến khi đạt nồng độ 10 8 tế bào/ mL
- Ly tâm 9000 vòng/ phút, trong 15 phút ở 4 o C
- Lọc dịch nổi sau ly tâm, sử dụng màng lọc 0,45 μm
- Môi trường PDA sau khi hấp vô trùng, đặt ở bể ổn nhiệt 50 o C
- Chuẩn bị môi trường PDA với nồng độ 2X
- Dịch khuẩn Bacillus sp đã được chuẩn bị pha với môi trường PDA với tỷ lệ là 1:1 (7 mL dịch lọc trộn đều với 7 mL PDA (2X)), vortex đều hỗn hợp tiến hành đổ đĩa (đường kính đĩa 90 mm) giữa đĩa petri chứa dịch lọc vi khuẩn Bacillus sp giữ ở nhiệt độ phòng trong 6 ngày
- Thực hiện tương tự với đĩa đối chứng, thay dịch vi khuẩn Bacillus sp bằng nước cất vô trùng
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần
- Để ở nhiệt độ phòng trong 6 ngày và xác định phần trăm ức chế nấm Đọc kết quả xác định phần trăm ức chế theo công thức sau:
Trong đó : I: phần trăm ức chế (%) C: đường kính nấm mốc trên đĩa đối chứng (mm) E: đường kính nấm mốc trên đĩa chứa dịch lọc vi khuẩn (mm) (Gong M., 2006), (Paul N.C, 2013)
Vi khuẩn được xem như có khả năng ức chế nấm khi I > 20 % Nếu I < 20
%, vi khuẩn không có giá trị trong khả năng kháng nấm (Chang W T., 2007).
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Kết quả phân lập, định danh sơ bộ và làm thuần chủng vi nấm
3.1.1 Mô tả vết bệnh thán thư do chủng vi nấm Colletotrichum sp.C79
Trên quả ban đầu xuất hiện những đóm tròn nhỏ màu xanh đậm lõm xuống hơi ướt vết bệnh lớn dần sẽ có hình thoi đến bầu dục, vết bệnh có màu vàng nhạt đến màu xám hoặc đen, trong vết bệnh xuất hiện các vòng tròn đồng tâm trên đó có những chấm nhỏ li ti màu vàng hoặc đen, viền ngoài cùng có màu đen (hình 3.1.)
Hình 3.1 Mẫu ớt có biểu hiện của vi nấm Colletotrichum sp C79 xâm nhiễm
3.1.2 Kết quả phân lập, định danh sơ bộ và làm thuần chủng vi nấm
- Từ 3 mẫu ớt bệnh được lấy từ thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng chọn lựa những mẫu ớt có các dấu hiệu nghi ngờ bị bệnh thán thư do nấm
Colletotrichum sp C79 tiến hành phân lập trên môi trường PDA, ủ ở 28 0 C trong 7 ngày
- Tiến hành định danh sơ bộ kết quả cho thấy các bào tử nấm có hình dạng đặc trưng của vi nấm Colletotrichum gloeosporioides hình trụ một đầu hẹp cùn, vùng giữa có dạng “thắt eo” Theo khóa phân loại của (Sutton, 1980)
- Sau 2 – 5 ngày đặt mẫu bệnh, lựa chọn khuẩn lạc có hình thái đặc trưng của chủng vi nấm Colletotrichum sp C79 ở giai đoạn đầu khuẩn lạc của vi nấm có màu ửng hồng ở tâm, sợi nấm phát triển sát trên bề mặc thạch, không bung sợi tơ lên trên như những loài nấm khác Tiến hành cấy truyền khuẩn lạc sang đĩa môi trường PDA
Sau khi nuôi cấy 4 ngày trở lên khuẩn lạc sẽ có màu trắng đặc trưng, có dạng tơi xốp, mặt dưới sẽ xuất hiện các vết chấm đen (hình 3.2.)
Hình 3.2 Kết quả làm thuần nấm Colletotrichum sp C79 bằng phương pháp cấy đơn bào tử trên môi trường PDA (A) Vi nấm
Colletotrichum sp C79 trên ớt, (B) Vi nấm Colletotrichum sp
Kết quả quan sát đại thể và vi thể vi nấm Colletotrichum sp C79
3.2.1 Kết quả quan sát đại thể vi nấm Colletotrichum sp C79
Sau khi đã làm thuần chủng vi nấm Colletotrichum sp C79 tiến hành quan sát đại thể sau 6 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA
Kết quả ghi nhận mặt trên khuẩn lạc vi nấm Colletotrichum sp C79 có màu trắng, xung quanh xuất hiện vòng đồng tâm có màu xám nhạt, rìa màu trắng Mặt dưới màu trắng ngà, tâm vàng nhạt hơi xám, xuất hiện các vòng tròn đồng tâm màu xám, rìa màu trắng
Bề mặt khuẩn lạc vi nấm Colletotrichum sp C79 có màu trắng, tơi xốp
Rìa khuẩn lạc vi nấm Colletotrichum sp C79 là dạng rìa sợi, dày, màu trắng, vòng tròn đồng tâm 5- 7 vòng, có sắc tố hòa tan là vàng nhạt
Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của (Weir, 2012) về hình thái học theo miêu tả về đại thể của vi nấm Colletotrichum sp C79 Kết quả quan sát được thể hiện dưới hình 3.3
Hình 3.3 Kết quả quan sát đại thể vi nấm Colletotrichum sp C79:
(A) Mặt trên đĩa nấm, (B) Mặt dưới đĩa nấm
3.2.2 Kết quả quan sát vi thể vi nấm Colletotrichum sp C79
Từ kết quả quan sát và kiểm tra đại thể vi nấm Colletotrichum sp C79 tiến hành nhuộm tiêu bản nấm mốc chủng vi nấm Colletotrichum sp C79 để quan sát vi thể của vi nấm Colletotrichum sp.C79
Sau khi quan sát kết quả cho thấy bào tử vi nấm Colletotrichum sp C79 có hình trụ, hai đầu tù, hơi tròn, thắt eo Khuẩn ty mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, có nhiều hạt giàu trong khuẩn ty
Theo như mô tả của (Lê Hoàng Lệ Thủy, 2008) bào tử hình trụ một đầu hẹp một đầu cùn hoặc hình trụ hai đầu cùn hoặc tròn nhẹ vùng giữa có thắt eo từ đây có sự tương đồng với mô tả của (Lê Hoàng Lệ Thủy, 2008) Kết quả quan sát được trình bày ở hình 3.4
Hình 3.4 Kết quả quan sát vi thể vi nấm Colletotrichum sp C79: (A) Quan sát ở vật kính 10X, (B) Quan sát ở vật kính 40X.
Gây bệnh nhân tạo vi nấm Colletotrichum sp C79 lên ớt
Sau khi đã xác định được hình thái đại thể và vi thể của vi nấm
Colletotrichum sp C79 đã phân lập được tiến hành gây bệnh trên các mẫu ớt khỏe Sử dụng mẫu ớt chín, khỏe, không bệnh để gây bệnh: tiến hành đặt những quả ớt được chuẩn bị và xử lí vào khay nhựa đã được phun ẩm sau đó nhỏ vài giọt dịch bào tử nấm đạt mật độ 10 6 bào tử/ mL lên mẫu ớt
Sau 4 ngày gây bệnh trên quả ớt đã xuất hiện các tơ nấm và khuẩn lạc đặc trưng của vi nấm Colletotrichum sp C79 có màu trắng và đang xâm nhiễm vào vỏ quả ớt, vỏ ớt đã xuất hiện vết bệnh có dạng hình thoi và hơi lõm xuống, giống với miêu tả của (Hồng, 2015) sau khi gây bệnh nhân tạo lên ớt Sau 10 ngày vết bệnh có dạng hình thoi, vết bệnh ẩm ướt, lõm xuống và nhũn ra vết bệnh sẽ có màu cam hoặc nâu khi vết bệnh lớn hơn (hình 3.8)
Hình 3.5 Kết quả gây bệnh nhân tạo nấm Colletotrichum sp
C79 lên ớt: (A) Mẫu ớt khỏe mạnh, (B) Mẫu ớt sau 4 ngày gây bệnh, (C) mẫu ớt sau 10 ngày gây bệnh
Định danh sinh học phân tử vi nấm Colletotrichum sp C79
Từ kết quả định danh sinh học phân tử của chủng Colletotrichum sp C79 tại Công ty TNHH DV và TM Nam Khoa tiến hành xây dựng cây phả hệ Sau khi gây bệnh nhân tạo chủng vi nấm Colletotrichum sp C79 lên ớt khỏe mạnh và định danh truyền thống chủng vi nấm Colletotrichum sp C79 Tiến hành sử dụng chủng vi nấm Colletotrichum sp C79 để định danh sinh học phân tử bằng cách giải trình tự vùng gen ITS1 - 5,8S - ITS2
Kết quả BLAST cho thấy trình tự vùng gene ITS1 - 5,8S - ITS2 của chủng
Colletotrichum sp C79 có mức độ tương đồng cao (Ident0 %) với trình tự của loài Colletotrichum gloeosporioides (chỉ số E-value = 0,0 thể hiện độ tin cậy cao) Từ đó tiến hành xây dựng cây phát sinh loài để xác định loài
Colletotrichum gloeosporioides Để xây dựng cây phả hệ phân tử cần thu thập bộ cơ sở dữ liệu các loài
Colletotrichum sp C79 từ NCBI, loài Colletotrichum boninense được lựa chọn làm nhóm ngoại, đồng thời tham khảo địa hình học cây phả hệ phân tử Hình 3.6 Kết quả BLAST trên NCBI chủng vi nấm Colletotrichum sp C79
C79 có mức độ gần gũi với loài Colletotrichum gloeosporioides và có độ tương đồng đến 100 % Ngoài ra ở nhóm ngoại Colletotrichum boninense đã được tách ra riêng biệt và có khảng cách tiến hóa xa so với loài
Colletotrichum gloeosporioides Đồng thời trên cả 3 phả hệ đều có giá trị bootstrap 1000 trên 95 % cụ thể ở cây phả hệ ML (Maximum Likelihood method) 97 %, NJ (Neighbor-Joining method) 96 %, MP (Maximum Parsimony method) 98 % Từ đó, có thể kết luận Colletotrichum sp.C79 là loài Colletotrichum gloeosporioides
Hình 3.7 Kết quả xây dựng cây phả hệ Maximum Likelihood method
Hình 3.8 Kết quả xây dựng cây phả hệ Neighbor-Joining method
Sau khi tiến hành phân lập vi nấm Colletotrichum sp kết quả đã phân lập và tiến hành định danh truyền thống, định danh phân tử xác định được mẫu
Colletotrichum sp.C79 có độ tương đồng cao với loài Colletotrichum gloeosporioides.
Kết quả sàng lọc khả năng đối kháng sinh học của các chủng vi khuẩn
khuẩn Bacillus sp với vi nấm Colletotrichum gloeosporioides C79
3.5.1 Hoạt hóa các chủng vi khuẩn Bacillus sp
Kết quả quan sát hình thái đại thể và vi thể của 7 chủng vi khuẩn Bacillus tiềm năng được trình bày ở bảng 3.1, hình 3.10, bảng 3.2, hình 3.11
Bảng 3.1 Kết quả quan sát hình thái đại thể các chủng vi khuẩn
STT Mã chủng Hình dạng Màu sắc Bề mặt
1 Bacillus sp KT2 Bờ răng cưa Trắng Tâm nhăn
Bờ răng cưa Trắng hơi đục Tâm nhăn
3 Bacillus sp TS3 Bờ răng cưa Trắng ngà Tâm nhăn
4 Bacillus sp PH3 Bờ răng cưa Trắng ngà Tâm nhăn, vòng
Q111 Tròn Trắng ngà Tâm không nhăn
Tròn, bờ răng cưa Trắng ngà Tâm nhăn
Bờ răng cưa Trắng hơi đục Tâm nhăn
Bảng 3.2 Kết quả quan sát hình thái vi thể các chủng vi khuẩn Bacillus sp
STT Mã chủng Gram Hình dạng Cách sắp xếp Bào tử
1 Bacillus sp KT2 + Trực mảnh Kép Có
2 Bacillus polyfermenticus F27 + Trực Đơn, kép Có
3 Bacillus sp TS3 + Trực Đơn Có
4 Bacillus sp PH3 + Trực Đơn Có
5 Bacillus subtilis Q111 + Trực ngắn Đơn, đôi Có
Hình 3.10 Kết quả quan sát đại thể của mốt số vi khuẩn (A) chủng
Bacillus polyfermenticus F27, (B) chủng Bacillus sp KT2
3.5.2 Kết quả sàng lọc khả năng đối kháng của chủng vi khuẩn Bacillus sp với vi nấm Colletotrichum gloeosporioides C79
Kết quả sàng lọc khả năng đối kháng của 7 chủng vi khuẩn tiềm năng đối với vi nấm Colletotrichum gloeosporioides C79 gây bệnh thán thư trên ớt được trình bày ở bảng 3.3
Bảng 3.3 Kết quả sàng lọc khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn
Bacillus sp với vi nấm Colletotrichum gloeosporioides C79
Chủng vi khuẩn Bacillus sp
Kết quả thí nghiệm được lặp lại 3 lần
(+): Đối kháng ; ( - ): Khống đối kháng
Từ kết quả của bảng 3.3 và hình 3.14 cho thấy cả 7 chủng vi khuẩn
Hình 3.11 Kết quả quan sát vi thể một số vi khuẩn Bacillus (A) chủng Bacillus polyfermenticus F27, (B) chủng Bacillus sp PH3
Bacillus amyloliquefaciens T3, Bacillus subtilis Q111, Bacillus sp PH3,
Bacillus subtilis S29 đều có khả năng kháng vi nấm Colletotrichum gloeosporioides C79
Hình 3.12 Kết quá sàng lọc khả năng đối kháng của chủng vi khuẩn Bacillus sp đối kháng sinh học vi nấm Colletotrichum gloeosporioides C79: (A) Bacillus sp KT2, (B) Bacillus polyfermenticus F27
3.5.3 Kết quả đánh giá phần trăm ức chế vi nấm Colletotrichum gloeosporioides C79của các chủng vi khuẩn Bacillus sp
Kết quả đánh giá phần trăm ức chế bộ sưu tập 7 chủng vi khuẩn Bacillus sp có khả năng ức chế chủng vi nấm Colletotrichum gloeosporioides C79 được trình bày tại bảng 3.4, biểu đồ 3.1 và bảng 3.5
Bảng 3.4.Kết quả đánh giá phần trăm ức chế sinh học vi nấm Colletotrichum gloeosporioides C79của 7 chủng vi khuẩn Bacillus sp
Trong cùng một cột, các trị số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5 % qua phép thử Duncan
Phần trăm ức chế sinh học vi nấm
Biểu đồ thể hiện phần trăm ức chế vi nấm
Colletotrichum gloeosporioides C79của các chủng vi khuẩn
Chủng vi khuẩn kháng vi nấm Colletotrichum gloeosporioides C79
Biểu đồ 3.1 Biểu đồ thể hiện phần trăm ức chế vi nấm Colletotrichum gloeosporioides C79 của các chủng vi khuẩn Bacillus sp
Phần trăm ức chế vi nấmColletotrichum(%)
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát phần trăm ức chế sinh học vi nấm Colletotrichum gloeosporioides C79 của các chủng vi khuẩn Bacillus
Chủng Khả năng ức chế vi nấm
Colletotrichum gloeosporioides C79 của các chủng vi khuẩn Bacillus Đối chứng
Từ bảng 3.4 và biểu đồ 3.1, cho thấy kết quả phần trăm ức chế vi nấm
Colletotrichum gloeosporioides C79 của bộ sưu tập 7 chủng vi khuẩn Bacillus
: Bacillus sp KT2, Bacillus polyfermenticus F27, Bacillus sp TS3, Bacillus amyloliquefaciens T3, Bacillus subtilis Q111, Bacillus sp PH3, Bacillus subtilis S29 cho thấy tất cả 7 chủng Bacillus đều có khả năng ức chế chủng vi nấm Colletotrichum nhưng ở các mức độ khác nhau Trong đó 2 chủng
Bacillus polyfermenticus F27 và Bacillus subtilis S29 ức chế cao nhất với giá trị phần trăm là 100 % chủng nấm Colletotrichum gloeosporioides C79, 3 chủng tiếp theo Bacillus sp KT2, Bacillus sp TS3 và Bacillus sp PH3 có giá trị phần trăm ức chế lần lượt là 46.19 %, 22.11 %, 25.55 % Trong khi đó 2 chủng có phần trăm thấp nhất là Bacillus subtilis Q111 18.5 % và Bacillus amyloliquefaciens T3 18.4 % Ở nghiên cứu của Nguyễn Bá Thọ và cộng sự
(2020) kết quả đã đánh giá khả năng ức chế của 21 chủng Bacillus trong đó chủng Bacillus ĐR2B1 được xác định là chủng có phần trăm ức chế đối với
Colletotrichum CC1.5 đối kháng trực tiếp bằng phương pháp cấy kép trên đĩa là 67,41 % sau 6 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA Có thể thấy 2 chủng vi khuẩn Bacillus polyfermenticus F27 và Bacillus subtilis S29 có tiềm năng để sử dụng trong chế phẩm sinh học ức chế vi nấm gây bệnh thán thư ở cây ớt
Theo Chang (2007) cho rằng vi khuẩn được xem như có khả năng ức chế nấm khi I > 20 % và Nếu I < 20 %, vi khuẩn không có giá trị trong khả năng kháng nấm (Trong đó I là Phần trăm ức chế nấm) Vì vậy có thể kết luận rằng
2 chủng Bacillus subtilis Q111 và Bacillus amyloliquefaciens T3 không có khả năng kháng vi nấm Colletotrichum gloeosporioides C79 có đường kính dưới
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
Sau thời gian thực hiện đề tài tôi đã hoàn thành được các nội dung sau:
- Đã phân lập và định danh bằng phương pháp truyền thống và giải trình tự sinh học phân tử được 1 chủng vi nấm Colletotrichum gloeosporioides C79 từ 3 mẫu ớt bệnh tại thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng
- Trong 7 chủng vi khuẩn Bacillus sp KT2, Bacillus polyfermenticus F27,
Bacillus sp TS3, Bacillus sp PH3, Bacillus subtilis S29 có khả năng ức chế chủng vi nấm Colletotrichum sp C79 Có 2 chủng ức chế vi nấm Colletotrichum sp C79 mạnh nhất là Bacillus polyfermenticus F27 và
Kiến nghị
- Đánh giá khả năng ức chế và tiêu diệt nấm Colletotrichum sp C79 trên mô hình đĩa petri, ex vivo và quy mô nhà lưới của 2 chủng Bacillus polyfermenticus F27 và Bacillus subtilis S29
