NGUYỄN VĂN MINH Học viên thực hiện: TRẦN HỒNG NGỌC HUYỀN Lớp: NN71 Ngày sinh: 19/09/1999 Nơi sinh: Lâm Đồng Tên đề tài: PHÂN LẬP, SÀNG LỌC HOẠT TÍNH PROBIOTIC VÀ KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH
TỔNG QUAN
Tổng quan về ngành nuôi tôm
Trên thế giới, trước năm 2000, các nước ở khu vực Đông Nam Á nuôi tôm Thẻ Chân Trắng vẫn chưa phổ biến Năm 2003, các nước có sản lượng tôm nuôi lớn nhất thế giới (như Thái Lan, Trung Quốc, Inđônêxia, Ấn Độ) đã phát triển mạnh đối với tôm Thẻ Chân Trắng Năm 2003, sản lượng tôm Thẻ Chân Trắng của Trung Quốc đạt 600 nghìn tấn (chiếm 76 % tổng sản lượng tôm nuôi tại nước này); đến năm 2008 tôm Thẻ Chân Trắng đạt sản lượng 1,2 triệu tấn (trong tổng số 1,6 triệu tấn tôm nuôi) Năm
2004, tôm Thẻ Chân Trắng dẫn đầu về sản lượng tôm nuôi, đóng góp trên 50 % tổng sản lượng tôm nuôi trên thế giới Năm 2007, tôm Thẻ Chân Trắng chiếm 75 % tổng sản lượng tôm nuôi toàn cầu và là đối tượng nuôi chính ở 3 nước châu Á (Thái Lan, Trung Quốc, Inđônêxia) Ba nước này cũng chính là những quốc gia dẫn đầu thế giới về nuôi tôm (Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2013) Ở Việt Nam, theo Tổng cục thủy sản tháng 11 năm 2020 về nuôi trồng thuỷ sản, diện tích tôm thả nuôi ước đạt 725.900 ha (Đạt 99,43 % so với kế hoạch năm 2020) Trong đó tôm Thẻ Chân Trắng là 109.093 ha (Đạt 99,1 % so với kế hoạch năm 2020).Cùng với sự gia tăng diên tích nuôi trồng thì gia tôm nguyên liệu tại các vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long tiếp tục ở mức cao Gía tôm Thẻ Chân Trắng tăng cụ thể tôm có kích cỡ 20 và 30 con/kg có giá là 206.000 đồng/kg và 169.000 đồng/kg (Hiệp hội chế biến và xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam, 2020)
Tại Trà Vinh, Theo Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Trà Vinh, đến hết ngày 15/8/2018, toàn tỉnh đã thả nuôi 5,28 tỷ con tôm giống, tổng diện tích thả nuôi tôm mặn lợ trên toàn tỉnh Trà Vinh đạt 30.611 ha, tăng 4,9 % so với năm 2017 Sản lượng thu hoạch tôm nuôi mặn lợ ước đạt 36.010 tấn, tăng 23 % so với cùng kỳ Trong đó, sản lượng thu hoạch tôm Thẻ Chân Trắng đạt 28.075 tấn, tăng 30,4 % so với cùng kỳ Tuy nhiên trong tháng 7 và 8 năm 2018 do mưa nhiều dẫn đến môi trường ao nuôi biến động gây thiệt hại ở các xã nuôi tôm huyện Cầu Ngang, Duyên Hải, và thị xã
Duyên Hải ở giai đoạn 20 – 60 ngày tuổi tôm có dấu hiệu của bệnh đốm trắng, hoại tử gan tuỵ cấp (Tổng cục Thuỷ sản 2018)
1.1.2 Tình hình dịch bệnh tôm
Việc phát triển nghề nuôi tôm, nhất là các nước ở khu vực Đông Nam Á cho thấy vấn đề thiệt hại trong nghề nuôi tôm là điều không tránh khỏi Tùy theo điều kiện canh tác mà dịch bệnh sẽ xuất hiện Đến tháng 10/2019, diện tích tôm nuôi bị bệnh 56,45 ha, chiếm xấp xỉ 3% tổng diện tích thả nuôi tôm nước lợ, giảm hơn 10% so với diện tích tôm nuôi bị bệnh cùng kỳ năm 2018 Các loại bệnh xảy ra chủ yếu là hoại tử gan tụy cấp 29,3 ha đốm trắng 6,15 ha do môi trường 21 ha (Chi cục Thủy Sản, 2020) Hội chứng hoại tử gan tuỵ cấp tính gây chết tôm ở giai đoạn 15 - 40 ngày sau khi thả nuôi Tôm ngừng ăn, bơi chậm, vỏ mỏng, màu tôm nhợt nhạt Gan tuỵ có biểu hiện sưng, nhũn, teo (Bùi Quang Tề, 2006) Như vậy, về nuôi trồng thuỷ sản, tôm Thẻ Chân Trắng đang gặp khá nhiều khó khăn.
Sơ lược về tôm Thẻ Chân Trắng
1.2.1 Sơ lược về tôm Thẻ Chân Trắng
Tôm bạc Thái Bình Dương, tôm bạc bờ Tây châu Mỹ, Camaron blanco, Langostino
Tôm Thẻ Chân Trắng Ngành: (chân khớp) Arthropoda
Hình 1.1 Hình ảnh Tôm Thẻ Chân Trắng (Hình chụp ngày 26/2/2021)
Tôm Thẻ Chân Trắng (Litopenaeus vannamei) có nguồn gốc từ vùng biển xích đạo Ðông Thái Bình Dương (biển phía Tây Mỹ La tinh), chúng phân bố chủ yếu ở ven biển Tây Thái Bình Dương, châu Mỹ, từ ven biển Mexico đến miền trung Pêru, nhiều nhất ở biển gần Ecuador Tôm thẻ Chân Trắng hiện nay có mặt hầu hết ở các khu vực ôn và nhiệt đới bao gồm Đài Loan, Trung Quốc và các nước ven biển thuộc khu vực Đông Nam Á.Tôm Thẻ Chân Trắng có thể sống ở độ sâu 7,2 m đáy bùn, nhiệt độ nước ổn định từ 25 - 32°C, độ mặn từ 28- 34 ‰, pH từ 7,7 - 8,3 giai đoạn tôm con sống ở vùng cửa sông, giai đoạn trưởng thành sống ở biển sâu (Nguyễn Trọng Nho, 2006)
1.2.2 Bệnh hoại tử gan tụy trên tôm Thẻ Chân Trắng
Theo Lightner et al., (2012) bệnh hoại tử gan tụy trên tôm lần đầu tiên phát hiện vào năm 2009 gọi là “Hội chứng tôm chết sớm - EMS (Early Mortality Syndrome)” Năm 2011, một tên mới được đặt ra dựa trên mô tả bệnh tích cấp tính, gọi là “Hội chứng hoại tử cấp” (AHPNS – Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome) Năm
2013, tên gọi “Bệnh hoại tử gan tụy cấp” (AHPND - Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome) được dùng khi đã xác định rõ tác nhân gây bệnh Bệnh gây ra nhiều tác hại nguyên nhân song kể từ đầu năm 2013, phòng nghiên cứu Bệnh học Thủy sản Trường đại học Arizona (UAZ-APL) tìm ra nguyên nhân gây bệnh AHPND là Vibrio parahaemolyticus phân lập tại Việt Nam và Me-xi-co đều cho kết quả cùng một nhân tố gây bệnh Chủng vi khuẩn này xâm chiếm đường tiêu hóa của tôm và sinh ra độc tố gây phá hủy các mô và gây rối loạn chức năng của gan tụy, cơ quan tiêu hóa của tôm
(Lightner et al., 2012; FAO, 2013) Độc tố PirAB vp , tương đồng với độc tố tiêu diệt côn trùng (Pir) của Phorotorhabdus, được chứng minh là yếu tố độc lực chính gây nên hội chứng gan tụy cấp tính ở tôm Các gen tương ứng của chúng (được đặt tên là pirA vp và pirB vp ) nằm trên một plasmid có kích thước lớn hơn (69 - 70 kb) ở các chủng Vibrio parahaemolytius gây bệnh gan tụy cấp (Han JE et al., 2015)
Một số triệu chứng dễ nhận thấy bệnh hoại tử gan tụy cấp có thể quan sát bằng mắt thường như gan tụy teo, dai, có màu nhợt nhạt như trắng vàng hoặc vàng nhạt, có những đốm màu đen hoặc sọc đen Vỏ tôm mềm, ruột rỗng mất chức năng, có tế bào nhân lớn bất thường, biểu bì của ống thận bị bong tróc Bệnh chỉ lây nhiễm qua đường tiêu hóa của tôm (Loc Tran et al., 2013) Tôm mắc bệnh sẽ bỏ ăn, lờ đờ, tấp mé và tỉ lệ chết cao sau 10 ngày thả giống (Lightner et al., 2012)
Hình 1.2 Dấu hiệu tôm bị bệnh hoại tử gan tụy (Bùi Quang Tề, 2016)
Hình 1.3 Bacillus subtilis spizenni tạo váng trên TSB (Hình chụp ngày
Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus
Chi Bacillus là một chi lớn rất phổ biến và đa dạng về loài Đặc điểm chung của chi này là những vi khuẩn có hình que, bắt màu tím khi nhuộm Gram, có bào tử, hình thái đa dạng (Trần Linh Thước, 2002) Chi Bacillus thường phân bố nhiều trong tự nhiên như đất, nước, nội sinh trong thực vật, cỏ khô hoặc rơm rạ Bacillus spp., thuộc vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi từ 5 - 50°C, tối ưu 35 - 40°C Tăng trưởng thích hợp ở pH từ 4,5 - 9,3 Bacillus spp., là một loài dễ mọc, thích nghi được trên các loại môi trường nuôi cấy có thành phần dinh dưỡng cơ bản trên môi trường LB agar, NA, TSA sau 24 giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì Trên canh LB, TSB đục, tạo váng, sau cặn lợn cợn Tạo dung huyết máu thạch (Trần Linh Thước, 2002)
Việc phân loại ban đầu dựa vào đặc điểm nuôi cấy, như phát triển trong điều kiện hiếu khí và khả năng hình thành nội bào tử trong điều kiện bất lợi, đã xếp ra nhiều vi khuẩn có các đặc tính sinh lý khác nhau Do tính không đồng nhất về sinh lý học, sinh thái học di truyền học làm cho việc phân loại Bacillus gặp khó khăn Bacillus có khả năng tồn tại và chịu đựng ở các điều kiện môi trường khắc nghiệt trong một thời gian dài nên đa số các chủng phổ biến và có thể phân lập được từ nhiều nguồn (Mai Nguyệt Thu Hồng, 2006), (Trần Linh Thước, 2002)
Một số loài Bacillus spp gây bệnh cho người và thủy sản như Bacillus anthracis và Bacillus cereus Bên cạnh đó vẫn có nhiều nhóm vi khuẩn có lợi, được sử dụng nhiều trong sản xuất các sản phẩm thương mại ứng dụng trong y học, nông nghiệp và công nghiệp Như là nhóm Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus megarium,… được ứng dụng rộng rãi
Bacillus subtilis là vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên, có đặc điểm hình que, Gram dương, kích thước 0,5 - 0,8 x 1,5 - 3 μm, sống đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn, có khả năng di động và tạo bào tử hình bầu dục nhỏ kích thước 0,8 - 1,8 μm Bào tử của Bacillus subtilis có khả năng chịu đựng pH thấp, nhiệt độ cao (100°C trong 180 phút), ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất và chất sát trùng, có thể tồn tại trong nhiều năm hoặc thậm chí vài chục năm (Ferdinand Cohn, 1872).
Ngoài ra, Bacillus subtilis còn có khả năng kiểm soát vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản Nghiên cứu của Vaseeharan et al., 2003 đã phân lập được chủng Bacillus subtilis
BT 23 có khả năng khống chế các loài Vibrio spp đối với tôm sú
⮚ Bacillus licheniformis Đây là loài vi khuẩn hiếu khí, hình que, Gram dương, kích thước tế bào 3,2 - 3,9 àm x 0,9 - 1 àm, tế bào đứng riờng lẻ hoặc nối dài thành sợi, cú khả năng sinh nội bào tử (Võ Hồng Phượng, 2018)
Theo nghiên cứu của Gopalarishnan et al., 2013, chủng Bacillus lichenformis
(DAB1) có sự đối kháng với Vibrio parahaemolyticus với vòng kháng khuẩn 14 – 16 mm sau 24 giờ ủ Tiếp đó, kết quả nghiên cứu của Võ Hồng Phượng (2018) đã phân lập được chủng Bacillus licheniformis có khả năng đối kháng với Vibrio parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch với đường kính vòng kháng khuẩn là 15 mm
Từ những kết quả đó cho thấy tìm năng ứng dụng của loài Bacillus spp rất lớn trong việc hỗ trợ phòng trừ bệnh cho thủy sản
⮚ Khả năng kháng khuẩn của Bacillus
Bacillus spp được phổ biến rộng là nhóm vi khuẩn được dụng nhiều do có các đặc tính tốt: Khả năng cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh qua cơ chế miễn dịch, cạnh tranh vị trí bám dính và sản sinh ra chất kháng khuẩn (bacteriocins) (Barbosa et al., 2005)
Có nhiều nghiên cứu đã cho thấy khả năng kiểm soát sinh học của chi Bacillus spp rất khả quang Theo Nguyễn Văn Phúc 2014, đã phân lập được hai chủng có khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus và sinh ra enzyme mạnh được định danh thuộc
Bacillus subtilis BT23 có thể kiểm soát vi khuẩn gây bệnh Vibrio spp đối với tôm sú
Vào năm 2019, nhóm nghiên cứu do Nguyễn Văn Minh đứng đầu đã thành công phân lập chủng vi khuẩn Bacillus polyfermenticus F27 từ giun quế Bacillus polyfermenticus F27 sở hữu khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn Vibrio parahemolyticus, tác nhân gây bệnh trên tôm Thẻ Chân Trắng Khả năng này đã được chứng minh qua các thử nghiệm lây nhiễm nhân tạo trên tôm.
Đặc điểm sinh học của Vibrio
Vibrio là vi sinh vật có hình que, ngắn, mảnh, bắt màu hồng khi nhuộm Gram
(Gram õm), kớch thước khoảng 0,5 x 3 àm, hai đầu khụng đều nhau tạo thành hỡnh dấu phẩy khi quan sát dưới kính hiển vi, qua nhiều lần cấy truyền thì dấu phẩy biến mất
Vibrio không sinh bào tử, không tạo giáp mô, di động nhờ một tiên mao ở đầu (Trần
Hình 1.4 Hình vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (nguồn Kozo Mkino et al., 2003)
Thuộc vi khuẩn hiếu khí tùy nghi, sống được ở nhiệt độ 16 – 42 °C, nhiệt độ tối ưu là 37 °C Là vi khuẩn ưa kiềm, tăng trưởng nhanh trong môi trường có tính kiềm pH từ 8,5 – 9 Ưa môi trường có muối, từng loài khác nhau thích nghi với nồng độ muối khác nhau Trên môi trường chuyên biệt TCBS (Thiosulfat Citrat Bile Saccarose) tạo khóm màu vàng nếu sử dụng được đường sucrose, nếu không thì khuẩn mọc tạo khóm màu xanh.Trên môi trường Chromagar khóm vi khuẩn tròn màu tím, biên đều, phẳng hoặc lồi Chết nhanh trong môi trường acid, dễ bị tiêu diệt bởi các chất tẩy uế, không bền với nhiệt chỉ tồn tại 10 phút ở 55 °C (Trần Linh Thước, 2002)
Vibrio Vibrio parahaemolyticus Vibrio parahaemolyticus có khả năng gây dịch bệnh trên người và động vật thủy sản như tôm, cua, nhuyễn thể đặc biệt là tôm rất nhạy cảm với vi khuẩn này trong tất cả các giai đoạn phát triển (Lightner et al., 2012) Trên tôm, Vibrio parahaemolyticus thường được phân lập trong máu và gan tụy của tôm (Lighner et al., 1996) Các chủng
Vibrio parahaemolyticus cùng với Vibrio harveyi, Vibrio vulnificus gây chết hàng loạt trên tôm nuôi ở Thái Lan (Nash et al., 1992) có liên quan đến một số bệnh nhiễm khuẩn cục bộ và nhiễm khuẩn trên gan tụy trên tôm sú (Lightner et al., 1996) Ở loài Vibrio parahaemolyticus tồn tại ba gen độc tố hemolysin chính gồm tdh và th mã hóa cho hemolysin không bền nhiệt, cả hai gen này đều nằm trên operon độc tố Vp – toxRS, được điều hòa bởi gen toxR có trình tự bảo tồn cao Độc tố hemolysin làm phân giải tế bào hồng cầu và giải phóng hemolysin (Hoàng Tấn Quảng, 2020).
Sơ lược về probiotic
1.5.1 Khái niệm và định nghĩa
Probiotic là những vi khuẩn có lợi có khả năng tăng cường sức khỏe và bảo vệ vật chủ và ổn định chức năng hệ tiêu hoá Những vi sinh vật này hiện diện tự nhiên trong ống tiêu hoá giúp tiêu hoá thức ăn thành những chất cơ thể dễ hấp thu như các acid amin,chất béo, hydrocacbon, vitamin,…
Các chế phẩm sinh học gọi chung là probiotic, là các vi sinh vật sống hữu dụng gồm một số loài trong các chi (giống) Lactobacillus, Bacillus, Streptococcus, Saccharomyces và Bacillus subtilis mang lại nhiều lợi ích cho vật chủ bởi chúng có khả năng bám vào tế bào biểu mô ruột, tồn tại và tăng trưởng với vật chủ; đồng thời ngăn chặn hoặc giảm sự bám vào của các tác nhân gây bệnh, cạnh tranh dinh dưỡng với vi khuẩn gây bệnh, kích thích hệ miễn dịch cho vật chủ và ức chế sự tăng trưởng của các tác nhân gây bệnh (Reid, 1999)
1.5.2 Chọn lọc vi sinh vật làm probiotic cho tôm
Khi chọn lọc chủng vi khuẩn làm probiotic cho tôm ngoài những lợi ích mà chúng mang lại cho sức khoẻ vật chủ phải đáp ứng được các tiêu chí như: Vi sinh vật phải đảm bảo an toàn, không có khả năng gây bệnh, gây độc đối với kí chủ, cây trồng và con người Chúng phải là những vi sinh vật tồn tại và phát triển được ở nơi sử dụng, chẳng hạn như các probiotic dùng làm chế phẩm sinh học ở dạng phun xử lý phải sống được trong đất và nước ao nuôi, còn ở dạng thức ăn bổ sung thì bắt buộc phải sống được trong hệ tiêu hoá của vật chủ Các sinh vật probiotic phải gắn kết được với tế bào biểu mô của ruột hay màng nhầy ruột, có khả năng gắn vị trí mạnh hơn vi khuẩn gây bệnh, sinh các chất kháng khuẩn Chúng không bị biến đổi chức năng khi đưa vào sản phẩm, tồn tại và đi đến nơi tác động để thực hiện được chức năng của mình và phải có tính di truyền ổn định không mang các gen đề kháng kháng sinh (Klaenhammer T.R al et., 1999), (Lee Yuan – Kun et al., 1999)
Sử dụng chế phẩm probiotic mang lại rất nhiều lợi ích cho vật nuôi như hỗ trợ tiêu hóa thức ăn, cân bằng hệ vi sinh đường ruột bằng cách cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh (Kabir, 2009), do đó giảm chi phí trong phòng bệnh và tăng năng suất cho vật nuôi (Reuter, 2001).
Tình hình nghiên cứu
1.6.1 Tình hình nghiên cứu trong nước
Theo Nguyễn Văn Phúc 2014, đã phân lập được hai chủng có khả năng kháng
Vibrio parahaemolyticus và sinh ra enzyme mạnh được định danh thuộc Bacillus subtilis BT23 có thể kiểm soát vi khuẩn gây bệnh Vibrio spp đối với tôm sú Kết quả nghiên cứu Võ Hồng Phượng (2018) đã phân lập được chủng Bacillus licheniformis có khả năng đối kháng với Vibrio parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch với đường kính vòng kháng khuẩn là 15 mm
Năm 2019, Nguyễn Văn Minh cùng với cộng sự đã phân lập được chủng
Vi khuẩn Bacillus polyfermenticus F27 phân lập từ giun quế có tác dụng ức chế Vibrio parahemolyticus bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch với đường kính vô hiệu lực lớn nhất là 18,50 mm Ngoài ra, vi khuẩn Bacillus polyfermenticus F27 còn có khả năng bảo vệ tôm thẻ chân trắng khi lây nhiễm nhân tạo Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng to lớn của chủng vi khuẩn này Hiện nay, hầu hết các sản phẩm lợi khuẩn được sử dụng đều ở dạng bào tử thuộc chi Bacillus (Hong et al., 2005).
Tuy nhiên, kết quả kháng sinh đồ 47 chủng V parahaemolyticus (AHPND) trên kháng sinh và 70% số chủng có hiện tượng đa kháng thuốc (Lê Hồng Phước et al., 2017)
1.6.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Kết quả nghiên cứu của Balcázar et al (2007), đã phân lập được B subtilis
UTM 126 có hoạt động ức chế chống lại ba chủng Vibrio harveyi, Vibrio alginolyticus và Vibrio parahaemolyticus phân lập từ tôm bị bệnh với vòng kháng khuẩn khoảng 10
Bên cạnh đó, B subtilis BT23 có thể kiểm soát vi khuẩn gây bệnh Vibrio spp đối với tôm sú (Verschuere et al., 2003) Trong số 80 chủng vi khuẩn phân lập từ tôm hoang dã, Vibrio P62, Vibrio P63 và Bacillus P64 cho thấy tác dụng ức chế chống lại
V harveyi (S2) lần lượt là 54 %, 19 % và 34 % Hơn nữa, Bacillus P64 thể hiện đặc tính của một probiotic và hoạt tính kích thích miễn dịch, trong khi Vibrio P62 chỉ cho thấy tính chất probiotic tốt (Gullian et al., 2004) Bào tử Bacillus đã được sử dụng như là tác nhân sinh học để giảm sự phát triển của Vibrio trong các cơ sở nuôi tôm (Skjermo and Vadstein et al., 1999).
Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật giải trình tự
1.7.1 Nguyên lý chung của PCR
Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA trên mạch khuôn từ một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của một đoạn DNA thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer): mồi xuôi (sense primer hay forward primer) và mồi ngược (antisense primer hay reverse primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này DNA polymerase xúc tác phản ứng tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn với sự hiện diện của mồi chuyên biệt Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase
PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ (cycle) kế tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:
Giai đoạn biến tính: ở nhiệt độ cao 90 – 95 °C làm đứt các liên kết hydro của phân tử DNA, hai mạch phân tử DNA tách rời nhau và toàn bộ phản ứng enzyme dừng lại Đoạn DNA khuôn có các đoạn dài gồm nhiều nucleotide giống nhau, hoặc tỷ lệ G - C càng cao, có nhiệt độ biến tính (Tm) cao hơn Do vậy cần căn cứ đặc điểm của DNA khuôn để lựa chọn nhiệt độ biến tính phù hợp Thời gian biến tính kéo dài trong khoảng 15 giây đến 1 phút
Giai đoạn gắn mồi: bắt cặp ở nhiệt độ khoảng 40 – 70 °C, thấp hơn nhiệt độ Tm của mồi Nhiệt độ tối ưu thường nằm khoảng 50 – 65 °C Các mồi bắt cặp với các mạch đơn DNA khuôn ở các đầu 3’ theo nguyên lí Chargaff Thời gian bắt cặp trong một phản ứng PCR thường kéo dài trong khoảng 15 giây – 1 phút
Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ 72 °C thích hợp với điều kiện hoạt động của enzyme DNA polymerase Enzyme DNA polymerase xúc tác hoạt động tổng hợp gắn thêm các nucleotide vào cuối đoạn mồi, các đoạn mồi được kéo dài trên cơ sở bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên lí Chargaff, tạo nên các mạch đơn DNA mới, giai đoạn này còn gọi là giai đoạn polymer hóa (polymerization) Thời gian giai đoạn này từ 30 giây đến vài chục phút, tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA Chu kỳ gồm ba bước này sẽ được lặp lại nhiều lần khoảng 25 - 40 (tùy vào ứng dụng chuyên biệt) Cuối cùng được kết thúc bằng một “extension” ở 72 °C trong 5 phút, sau đó cho ngừng hẳn bằng cách lưu trữ sản phẩm PCR ở nhiệt độ phòng hoặc ở 4 °C (tùy thuộc vào loại máy Thermal cycler được sử dụng) (Lê Huyền Ái Thuý, 2016)
1.7.2 Phần mềm phân tích trình tự DNA
Trong những năm gần đây lượng thông tin liên quan đến trình tự DNA được xác định ở các loài sinh vật khác nhau đã được quản lý dưới dạng ngân hàng dữ liệu (EMBL ở Châu Âu, GenBank ở Mỹ), có thể dễ dàng truy cập và tải về miễn phí thông tin trên internet BLAST là một trong những chương trình được sử dụng rộng rãi nhất trong tin sinh học BLAST cho phép nhà nghiên cứu tìm kiếm DNA, protein xem đoạn mà ta quan tâm có tương đồng với đoạn của sinh vật nào trong ngân hàng gen không, khi được cung cấp một thư viện hay dữ liệu các chuỗi đó Để chạy BLAST cần đầu tư hai chuỗi: chuỗi đích và cơ sở dữ liệu chuỗi Chuỗi đích nhỏ hơn nhiều so với cơ sở dữ liệu (Lê Huyền Ái Thuý, 2016)
Có 5 chương trình BLAST: BLAST N, BLAST P, BLAST S, TBLAST N, TBLAST X, trong đó BLAST N (Nucleotide-Nucleotide BLAST) cho phép so sánh cấu trúc chuỗi nucleotide trong ngân hàng dữ liệu.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Địa điểm nghiên cứu
Thời gian: Tháng 11/2021 đến tháng 6/2021 Địa điểm: Phòng thí nghiệm vi Sinh của công ty Cổ Phần Mỹ Lan tỉnh Trà Vinh.
Vật liệu nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn Bacillus được phân lập từ các mẫu nước ao tôm ở huyện
Duyên Hải tại tỉnh Trà Vinh
Chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus được cung cấp bởi phòng thí nghiệm vi sinh công ty cổ phần Mỹ Lan
- Môi trường LB (Lysogeny Broth)
- Môi trường NA ( Nutrient agar)
- Cồn tuyệt đối, cồn 96°, cồn 70°
- Thuốc nhuộm: Thuốc nhuộm kết tinh (crytal violet), Lugol, Safranin O
- Thuốc thử: Kowac’s, H2O2, Methy red, đỏ Congo
- Tủ an toàn sinh học cấp 2
- Nồi khử trùng nhiệt ướt
- Pipet (thủy tinh và micropipet)
Phương pháp nghiên cứu chính
Dựa vào mục tiêu nghiên cứu, thí nghiệm được bố trí ở sơ đồ sau:
Hình 2.1 Hình sơ đồ bố trí thí nghiệm
Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào Đối kháng với
Kiểm tra độ tương thích Định danh Khảo sát khả năng chịu mặn, chịu pH
Kiểm tra đặc tính sinh hóa
Phân lập Mẫu nước, mẫu ruột tôm
2.3.2 Phân lập vi khuẩn Bacillus và làm thuần
Mẫu nước ao và mẫu ruột tôm được thu nhận tại thị xã Duyên Hải tỉnh Trà Vinh Mẫu nước ao, các mẫu được loại bỏ tế bào sinh dưỡng, vi sinh vật không bền với nhiệt bằng cách gia nhiệt trong bể ổn nhiệt ở 80 °C trong 10 phút Pha loóng mẫu đến 10 -2 , hỳt 100 àl dịch gốc và dịch đó pha loóng trải trờn mụi trường
Để phân lập vi khuẩn Bacillus, môi trường LB agar được bổ sung agar và ủ ở 37°C trong 24 giờ Các khuẩn lạc đặc trưng cho Bacillus được chọn và cấy ria nhiều lần trên môi trường LB agar cho đến khi quan sát thấy chỉ còn một dạng khuẩn lạc đồng nhất về hình dạng và màu sắc (Vaseeharan et al., 2003).
Các dòng vi khuẩn được kiểm tra độ thuần bằng phương pháp nhuộm Gram được quan sát dưới kính hiển vi quang học (MacFaddin, 2000).
Do sự khác biệt về cấu trúc vách tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương sẽ giữ được phức hợp tím Gentian - iode không bị tẩy màu bởi alcool, trong khi vi khuẩn Gram âm không giữ được phức hợp màu này, do đó vi khuẩn Gram dương vẫn giữ được màu tím của gentian, còn Gram âm ăn màu hồng của safranin O hay fuchsin
Các bước thực hiện như sau:
+ Nhỏ giọt nước lên phiến kính sạch Tạo huyền phù với vi khuẩn cần nhuộm và cố định mẫu
+ Nhỏ dung dịch Crystal violet lên toàn bộ mẫu Để từ 1 - 2 phút Rửa nước, thấm khô
+ Nhỏ dung dịch lugol trong 1 phút Rửa nước, thấm khô
+ Tẩy cồn 96 0 từ 15 – 30 giây, rửa nước thấm khô Phủ hoàn toàn vết bôi với safranin O và để yên trong 30 giây Rửa với nước, thấm khô
Tế bào vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím
Tế bào vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng
Vi khuẩn có bào tử, bào tử trong suốt không bắt màu
2.3.3 Kiểm tra đặc tính sinh hóa (Phạm Văn Ty, 2016)
Enzym catalase thường gặp ở vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối hay tùy nghi Catalase có khả năng phân giải peroxyt tạo O2 và nước
Dùng que cấy vòng, lấy đầy 1 vòng cấy vi khuẩn hòa vào giọt H2O2 trên phiến kính, quan sát
Dương tính (+) có bọt khí do O2 tạo ra Âm tính (-) không có sủi bọt khí
Các loại vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối có hệ enzym oxidase (cytochrom oxydase) Hoạt tính cytochrom được phát hiện nhờ thuốc thử là giấy tẩm N – Dimethel – paraphenyldiamin
Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn trên đĩa thạch đã nuôi cấy, phết lên giấy tẩm thốc thử Đọc kết quả trog vòng 30 giây – 1 phút
Phản ứng oxydase dương (+): giấy tẩm thuốc thử chuyển sang màu tím đen
Phản ứng oxidase âm (-): giấy tẩm thuốc thử vẫn giữ nguyên màu trắng đục
⮚ Xác định khả năng di dộng
Một số vi khuẩn có tiêm mao (Flagella) nên có khả năng di động trong môi trường bán lỏng và làm đục môi trường hay mọc giống như rễ cây xung quanh đường cấy
Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn trên môi trường đặc cấy sang ống nghiệm thạch bán lỏng, trích thẳng từ trên xuống dưới, ngay giữa ống nghiệm Ủ 37 °C trong 24 – 48 giờ
Di động (+) vi khuẩn mọc lan ra khỏi đường cấy, xa hay gần tùy theo khả năng di động của vi khuẩn mạnh hay yếu
Di động (-) vi khuẩn chỉ mọc trên đường cấy
⮚ Xác định khả năng sinh Indol
Vi sinh vật tiết enzyme Trytophanase, chuyển hóa Trytophan thành Indol Indol sẽ kết hợp với para – dimethylaminobenzaldehyd trong thuốc thử Kowac’s, tạo thành phức chất Rosindol màu đỏ
Cấy vi sinh vật vào canh LB, ủ 37 °C trong 24 giờ, lấy ra nhỏ 3 – 5 giọt Kowac’s
Phản ứng Indol dương tính (+): lớp mặt môi trường xuất hiện vòng đỏ
Phản ứng Indol âm tính (-): môi trường có màu vàng chanh hoặc xanh nhạt
⮚ Khả năng phân giải gelatin
Một số loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme gelatinase ngoại bào thủy phân gelatin thành polypeptide và axit amin làm phá hủy đặc tính đông đặc của gelatin ngay khi ở nhiệt độ dưới 25 °C và hóa lỏng ở nhiệt độ trên 25 °C
Cấy vi sinh vật vào môi trường canh LB có bổ sung 10 % gelatin ủ 37 °C trong 24 giờ
Sau khi ủ lấy ra cho vào ngăn dưới tủ lạnh 30 phút – 1 giờ
Nếu môi trường hóa lỏng (+)
Nếu môi trường đông đặc (-)
⮚ Phản ứng Methyl red (MR)
Một số nhóm vi sinh vật đường ruột có khả năng chuyển hóa glucose thành acid pyruvic Rồi tiếp tục chuyển hóa acid pyruvic thành ethanol, axit acetic, acid lactic, acid succinic Các loại acid tạo ra làm cho pH của môi trường giảm mạnh, pH = 4 – 4,5 Ở pH này Methyl red màu đỏ, còn ở mức pH cao hơn methyl red sẽ chuyển sang màu vàng
Cấy vi khuẩn vào môi trường Clark Lub ủ 37 °C trong 48 giờ Sau đó nhỏ trực tiếp 5 – 10 giọt thuốc thử Methy red, đọc kết quả
Dương tính (+): Dung dịch methyl red trong môi trường giữ nguyên màu đỏ Âm tính (-): Dung dịch methyl red trong môi trường chuyển màu đỏ sang màu vàng
⮚ Phản ứng Voges – Proskauer (VP)
Thử nghiệm VP dựa trên sự phát hiện acetoin, là sản phẩm biến dưỡng cuối cùng từ glucose Vi sinh vật chuyển hóa glucose thành acid pyruvic Acid pyruvic tiếp tục chuyển hóa thành AMC (acetyl methyl carbinolverdine) AMC trong môi trường kiềm sẽ kết hợp với α - naphtol, NaOH và oxy trong không khí (lắc) tạo thành diacetyl Diacetyl kết hợp với nhân guanidine trong pepton tạo thành màu hồng đỏ
Cấy vi khuẩn vào môi trường Clark Lub ủ 37 °C trong 24 giờ Sau đó nhỏ trực tiếp
5 – 10 giọt NaOH 40 % hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn, sau đó nhỏ tiếp 5 – 10 giọt thuốc thử α - naphtol Đọc kết quả từ 5 – 10 phút
Dương tính (+): môi trường có màu hồng đỏ Âm tính (-): môi trường có màu vàng cam hoặc nâu đất
⮚ Khả năng sử dụng Nitrat
Một số vi khuẩn có khả năng sử dụng nguồn nitrate làm nguồn nhận hydro cơ chất trong quá trình hô hấp kị khí đồng thời sử dụng nitrat làm nguồn nito do có khả năng tổng hợp enzyme Nitratreductase Nitrat bị khử thành nitrit, tiếp tục khử thành NH3 hoặc N2
Cơ chế: Acid sulfanilic không màu trong Gress A sẽ kết hợp với nhóm NO2 - tạo thành muối diazonium, acid sulfanilic bị diazo hóa
Cấy vi khuẩn vào môi trường Nitrat, ủ 37 °C trong 24 giờ Sau đó nhỏ trực tiếp 2 giọt Gress A, 2 giọt Gress B
Môi trường có màu hồng đỏ (+): Trong môi trường có xuất hiện nhóm NO2 - do
Môi trường không đổi màu (±):Trong môi trường không có nhóm NO2 - Có 2
+ Trường hợp 1 (-): NO3 - không chuyển thành NO2 -
+ Trường hợp 2 (+): NO3 - chuyển thành NO2 - rồi tiếp tục chuyển thành NH3 hay N2 nên thuốc thử Gress A và Gress B không phát hiện được
Tiếp tục cho bột kẽm vào phản ứng nếu xuất hiện màu đỏ thì âm tính, nếu không đổi màu là dương tính
⮚ Xác định khả năng sử dụng Citrat
Một số loài vi sinh vật có khả năng sinh enzym citrat permease có khả năng sử dụng citrat trong môi trường có chứa Na.Citrat làm nguồn cacbon duy nhất Khi sử dụng citrat chúng giải phóng ra môi trường Na + làm tăng pH của môi trường Đồng thời những vi sinh vật có khả năng sử dụng citrat làm nguồn cacbon thì cũng có khả năng sử dụng muối amonium vô cơ NH4H2PO4 làm nguồn nito, giải phóng
NH3 làm kiềm hóa môi trường, sự thay đổi Ph này được nhận biết nhờ chỉ thị màu Bromothymol blue có khoảng đổi pH từ 6 – 7,6 tương ứng với khoảng màu từ vàng - xanh lục – xanh dương
Cấy vi khuẩn vào môi trường thạch nghiêng Simon’s Citrat ủ 37 °C trong 24 giờ
Phản ứng citrat (+): Xanh bromothymol chuyển từ màu lục sang màu xanh dương
Phản ứng citrat (-): Xanh bromothymol vẫn giữ nguyên màu lục
Test KIA được sử dụng để kiểm tra đồng thời 2 khả năng là khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau và khả năng sinh H2S Vi khuẩn cấy lên môi trường này có 3 trường hợp: Chỉ sử dụng glucose: sau 18 - 24 giờ, phần nuôi cấy nghiêng có pH trở nên kiềm, phần nuôi cấy đứng có pH acid Do glucose trên bề mặt của môi trường được vi sinh vật sử dụng oxi hóa hoàn toàn thành CO2 và H2O để thu năng lượng Để đáp ứng nhu cầu năng lượng trong tăng trưởng vi sinh vật tiếp tục dị hóa peptone qua đó giải phóng NH3 làm phần bề mặt của môi trường có pH kiềm Phần sâu trong môi trường có điều kiện oxi không đầy đủ, glucose lên men kị khí sinh các acid hữu cơ làm pH môi trường giảm Sử dụng cả glucose và lactose: sau 18 - 24 giờ toàn bộ môi trường đều trở nên có pH acid vì sự biến dưỡng đồng thời cả hai loại đường giúp vi sinh vật đủ năng lượng để tăng trưởng mà chưa cần sử dụng đến peptone Khi thời gian nuôi cấy quá dài bề mặt môi trường sẽ trở nên kiêm do vi sinh vật sử dụng hết nguồn Carbon trong môi trường và phải sử dụng đến peptone Không sử dụng glucose và lactose: Bề mặt môi trường sẽ trở nên kiềm hóa do vi sinh vật biến dưỡng nguồn peptone chỉ trong điều kiện kị khí Khả năng sinh H2S vi sinh vật khử sufate có thể khử sodium thiosufate nhờ có enzyme thiosunfat reductase để giải phóng H2S, H2S phản ứng với Fe 2+ của chỉ thị ferric amonium citrate tạo kết tủa màu đen FeS
Dùng que cấy thẳng vi sinh vật vào môi trường KIA cấy thẳng sâu vào ống nghiệm, không chạm đáy, sau đó ria lên bề mặt thạch nghiêng, ủ 24 giờ ở 37 °C và đọc kết quả
- Đọc kết quả Đỏ/vàng: vi khuẩn lên men glucose không lên men Lactose
Vàng/vàng: vi khuẩn lên men glucose và lactose Đỏ/đỏ: không lên men glucose và lactose
Vi khuẩn Bacillus cereus được loại bỏ trên môi trường Mycoplasma đặc biệt (MYP) Vi khuẩn phát triển trên môi trường này có kết tủa màu đỏ hồng, xung quanh có quầng kết tủa và có hiện tượng làm tan máu trên môi trường thạch máu cừu (TCVN 7903:2008).
2.3.5 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào
Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào dựa trên phương pháp của Trần Thị Bích Quyên và cộng sự (2012) có hiệu chỉnh để phù hợp với điều kiện thí nghiệm như sau: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường TSB lỏng ở 37 °C trong 24 giờ, sau đó cấy nhỏ giọt lên đĩa môi trường NA có bổ sung từng loại cơ chất 1% tinh bột, 1 % casein, 1 % CMC tương ứng cho khảo sát sinh các enzyme amylase, protease, cellulase Ủ các đĩa khảo sát ở 30 °C trong 24 giờ và quan sát vòng phân giải trên đĩa
2.3.6 Khả năng đối kháng với Vibrio parahaemolyticus
