Tóm tắt: Nghiên cứu thu nhận chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và ứng dụng thu hồi vi tảo Nannochloropsis sp.

Nghiên cứu thu nhận chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và ứng dụng thu hồi vi tảo Nannochloropsis sp.Nghiên cứu thu nhận chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và ứng dụng thu hồi vi tảo Nannochloropsis sp.Nghiên cứu thu nhận chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và ứng dụng thu hồi vi tảo Nannochloropsis sp.Nghiên cứu thu nhận chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và ứng dụng thu hồi vi tảo Nannochloropsis sp.Nghiên cứu thu nhận chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và ứng dụng thu hồi vi tảo Nannochloropsis sp.Nghiên cứu thu nhận chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và ứng dụng thu hồi vi tảo Nannochloropsis sp.Nghiên cứu thu nhận chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và ứng dụng thu hồi vi tảo Nannochloropsis sp.Nghiên cứu thu nhận chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và ứng dụng thu hồi vi tảo Nannochloropsis sp.Nghiên cứu thu nhận chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và ứng dụng thu hồi vi tảo Nannochloropsis sp.Nghiên cứu thu nhận chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và ứng dụng thu hồi vi tảo Nannochloropsis sp.Nghiên cứu thu nhận chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và ứng dụng thu hồi vi tảo Nannochloropsis sp.Nghiên cứu thu nhận chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và ứng dụng thu hồi vi tảo Nannochloropsis sp.Nghiên cứu thu nhận chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và ứng dụng thu hồi vi tảo Nannochloropsis sp.Nghiên cứu thu nhận chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và ứng dụng thu hồi vi tảo Nannochloropsis sp.Nghiên cứu thu nhận chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và ứng dụng thu hồi vi tảo Nannochloropsis sp.Nghiên cứu thu nhận chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và ứng dụng thu hồi vi tảo Nannochloropsis sp.Nghiên cứu thu nhận chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và ứng dụng thu hồi vi tảo Nannochloropsis sp.Nghiên cứu thu nhận chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và ứng dụng thu hồi vi tảo Nannochloropsis sp.Nghiên cứu thu nhận chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và ứng dụng thu hồi vi tảo Nannochloropsis sp.Nghiên cứu thu nhận chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và ứng dụng thu hồi vi tảo Nannochloropsis sp.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG PHẠM THỊ ĐAN PHƯỢNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHITOSAN LACTATE TỪ VỎ LỘT XÁC TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (LITOPENAEUS VANNAMEI) VÀ ỨNG DỤNG THU HỒI VI TẢO NANNOCHLOROPSIS SP TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN KHÁNH HỊA - 2023 TĨM TẮT NHỮNG ĐĨNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đề tài luận án: Nghiên cứu thu nhận chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) ứng dụng thu hồi vi tảo Nannochloropsis sp Ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản Mã số: 9540105 Nghiên cứu sinh: Phạm Thị Đan Phượng Khóa: 2018 – 2022 Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Văn Hòa PGS.TS Huỳnh Nguyễn Duy Bảo Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang Những đóng góp luận án: Luận án xây dựng quy trình sản xuất chitin/chitosan từ nguồn nguyên liệu vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng thải q trình ni tơm thâm canh Sản phẩm chitin/chitosan thu đạt chất lượng thương mại (hàm lượng khống protein cịn lại 1%) Đặc biệt, lượng khống protein chứa vỏ lột xác tơm khác biệt lớn so với vỏ tôm từ nhà máy chế biến tơm Vì vậy, nồng độ hóa chất sử dụng q trình khử khống protein thấp (3 – 4%), thời gian xử lý ngắn (3 – giờ/quá trình khử) Hiệu suất thu hồi chitosan cao (~ 23%), độ deacetyl cao (~ 90%), độ tan cao (~ 99%) khối lượng phân tử đạt ~ 500 kDa Luận án xây dựng quy trình điều chế chitosan lactate từ chitosan thu nhận từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng Sản phẩm chitosan lactate tạo có độ tan nước tốt (> 99%) Luận án xác định điều kiện phù hợp sử dụng chitosan lactate để thu hồi sinh khối vi tảo Nannochloropsis sp Hiệu thu sinh khối vi tảo phương pháp kết hợp sử dụng chitosan lactate (250 ppm) điều chỉnh môi trường dịch vi tảo pH 10,0 đạt ~ 90% (sau lắng) Giáo viên hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Văn Hòa PGS.TS Huỳnh Nguyễn Duy Bảo Nghiên cứu sinh Phạm Thị Đan Phượng PHẦN MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Thủy sản ngành kinh tế mũi nhọn Việt Nam đem lại nguồn thu ngoại tệ lớn cho đất nước Năm 2022, kim ngạch xuất thủy sản đạt 11 tỷ USD, đó, tơm đối tượng có giá trị xuất cao đạt 4,1 - 4,2 tỷ USD Hiện nay, mơ hình ni tơm thâm canh triển khai đem lại hiệu kinh tế cao nhiều địa phương nước Việc kiểm sốt tốt điều kiện mơi trường mơ hình ni giúp giảm nguy dịch bệnh cho tôm Tuy nhiên, mật độ tôm cao nên lượng lớn chất thải q trình ni bao gồm thức ăn thừa, phân, chất lơ lửng, vỏ lột xác tơm… có khả gây nhiễm cho mơi trường nước, phát sinh dịch bệnh cho tơm Trong đó, lượng lớn vỏ lột xác tơm thu cách xi phông ngày Tận dụng nguồn vỏ lột xác làm nguyên liệu sản xuất chitin, chitosan không gia tăng giá trị cho tôm nuôi, mà cịn giảm thiểu nhiễm mơi trường ni, nâng cao giá trị cho chuỗi nuôi trồng, chế biến xuất tơm, góp phần phát triển bền vững ngành thủy sản Mặt khác, thời gian gần nhu cầu sử dụng sản phẩm vi tảo làm thức ăn nuôi thủy sản phát triển mạnh mẽ Vi tảo nguồn dinh dưỡng thiết yếu cho loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ, loài cá giáp xác giai đoạn ấu trùng Trong đó, vi tảo Nannochloropsis sp sử dụng phổ biến làm thức ăn cho ấu trùng thủy sản có kích thước nhỏ, chứa nhiều hoạt chất sinh học, hàm lượng dinh dưỡng cao Tuy nhiên, vấn đề khó khăn cần giải tìm phương pháp thu vi tảo Nannochloropsis sp hiệu với chi phí thấp, giữ chất lượng sản phẩm sau thu nhận, phù hợp làm thức ăn thủy sản Chitosan polyme sinh học ứng dụng nhiều lĩnh vực nông nghiệp, môi trường, thực phẩm, mỹ phẩm, y dược… Tuy nhiên, hạn chế sử dụng chitosan không tan nước mà tan số dung dịch acid loãng Để tăng độ tan nước, chitosan chuyển hóa thành dạng oligochitosan, muối chitosan, nanochitosan, gắn nhóm chức ưa nước Trong đó, chitosan lactate sản phẩm muối hữu chitosan lactic acid, tan tốt nước, khơng độc hại khơng mùi Ngồi ra, chitosan lactate giữ tính chất tạo màng bao hịa tan nước mang điện tích dương Do đó, ứng dụng chitosan lactate để thu hồi vi tảo biển (mang điện tích âm) đạt hiệu cao (theo chế trung hòa điện), dễ dàng triển khai, sản phẩm thu an toàn Từ lý trên, đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) ứng dụng thu nhận vi tảo Nannochloropsis sp.” đề xuất thực Mục tiêu nghiên cứu - Tận dụng nguồn nguyên liệu vỏ lột xác tơm thẻ chân trắng q trình ni thâm canh để thu nhận chitin chitosan có độ tinh cao - Xây dựng quy trình điều chế chitosan lactate có độ tan tốt nước từ chitosan thu - Xác định điều kiện phù hợp sử dụng chitosan lactate để thu sinh khối vi tảo Nannochloropsis sp 2 Phạm vi nội dung nghiên cứu Để đạt mục tiêu nghiên cứu, luận án tập trung nghiên cứu nội dung: - Nghiên cứu quy trình sản xuất chitin, chitosan có độ tinh cao từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng - Nghiên cứu quy trình điều chế chitosan lactate có độ tan tốt từ sản phẩm chitosan thu nhận - Nghiên cứu ứng dụng chitosan lactate để thu nhận sinh khối vi tảo Nannochloropsis sp Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án - Lần đầu tiên, nguyên liệu vỏ lột xác tơm q trình ni thâm canh đánh giá khả thu hồi, thành phần hóa học, tính chất sử dụng để sản xuất chitin, chitosan - Đề xuất quy trình sản xuất chitin, chitosan có độ tinh cao với lượng hóa chất sử dụng thấp, thời gian xử lý ngắn, không cần qua công đoạn khử màu - Đề xuất quy trình điều chế muối chitosan lactate tan tốt nước (độ tan > 99%) phương pháp rắn – lỏng, áp dụng quy mơ lớn cách dễ dàng - Đề xuất điều kiện thu hồi vi tảo biển Nannochloropsis sp đạt hiệu cao (~ 90% sau để lắng) sử dụng chitosan lactate có kết hợp điều chỉnh pH mơi trường - Kết đề tài mở định hướng tận dụng vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng tạo sản phẩm có giá trị gia tăng (chitin, chitosan, chitosan lactate), giảm ảnh hưởng xấu đến mơi trường q trình nuôi tôm thâm canh - Việc sử dụng sản phẩm từ q trình ni thủy sản (chitosan lactate) để thu vi tảo ứng dụng làm thức ăn thủy sản hướng đến kinh tế tuần hoàn phát triển bền vững cho ngành nuôi trồng thủy sản CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tiềm thu hồi vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng Việc áp dụng mô hình ni thâm canh, siêu thâm canh nhằm giảm thiểu ô nhiễm môi trường nuôi, hạn chế dịch bệnh, tăng mật độ nuôi vụ nuôi năm Qua đó, việc xi phơng ngày chất thải để làm ao ni giúp cho thu nhận lượng lớn vỏ lột xác tôm độ tuổi nuôi thương mại Mặc dù Việt Nam chiếm xấp xỉ 10% trại nuôi áp dụng công nghệ cao chiếm ~ 80% tổng sản lượng tơm thu hoạch từ trại ni mơ hình thâm canh, siêu thâm canh tập trung chủ yếu tỉnh khu vực Đồng sông Cửu Long Trong đó, xuất tơm thẻ chân trắng chiếm 72% tổng giá trị xuất tôm năm 2020 Năm 2022, tỉnh tiếp tục phát triển tôm thẻ chân trắng thâm canh, bán thâm canh cơng nghệ cao nhằm kiểm sốt môi trường tốt Theo Tổng cục Thủy sản thống kê (tháng 2/2022) lượng tôm thẻ chân trắng ước đạt 25.500 (tăng 6,3% so với kỳ năm trước) Trong q trình sống, tơm thường xun lột xác để sinh trưởng phát triển Lượng vỏ lột xác thu nhận thường xuyên ngày mơ hình ni cơng nghệ cao có mật độ dày nên lột xác tôm không đồng thời điểm Sản lượng vỏ lột xác tăng tỷ lệ thuận với sản lượng tôm thẻ chân trắng thu hoạch Vậy, không tận thu lượng vỏ (chất thải rắn ngành nuôi trồng) lãng phí, nguồn nguyên liệu tiềm để sản xuất chitin, chitosan Thành phần vỏ lột xác gồm chitin khoáng chất, cần tận thu để gia tăng giá trị cho sản phẩm ngành nuôi giải ô nhiễm môi trường Vỏ lột xác chứa hàm lượng khống cao lớp vỏ tơm lột sau bị vơi hóa, tạo nên độ cứng định để tơm tự lột lớp vỏ Khoáng chất tồn vỏ dạng tinh thể calci calci cacbonat vô định hình bao quanh chất lipid-protein, nên hàm lượng protein lipid chiếm tỷ lệ thấp Mặc dù lượng khoáng chiếm tỷ lệ cao chúng nằm xen kẽ với sợi chitin-protein hình thành phiến mỏng, xốp Vì vậy, xác lập quy trình sản xuất chitin với chế độ khử khống protein, khơng cần cơng đoạn khử chất màu Đồng thời, quy trình sản xuất định hướng tạo sản phẩm có chất lượng cao (hàm lượng khoáng protein < 1%) tiết kiệm hóa chất thời gian 1.2 Sản xuất chitosan điều chế chitosan lactate Chitosan ứng dụng rộng rãi ngành y sinh, thực phẩm, nông nghiệp, cơng nghệ sinh học dược phẩm nhờ có tính chất độc đáo mang chất polycation polyme tự nhiên an tồn Chitosan có khả kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, tạo màng, tạo gel, hấp phụ màu, làm dung dịch… hạn chế ứng dụng hòa tan số loại acid loãng Để nâng cao chất lượng tăng khả ứng dụng, việc chuyển chitosan thành muối chitosan hòa tan nước nhà khoa học quan tâm nhiều Muối chitosan (chitosan hòa tan nước) hình thành nhóm amin vị trí số chitosan bị proton hóa (NH3+OCOR-) môi trường acid (vô hữu cơ) Hiện nay, chitosan sản xuất từ chitin qua công đoạn deacetyl, q trình tách nhóm acetyl khỏi phân tử chitin Muối chitosan điều chế bắng cách cho chitosan phản ứng với loại acid vô hữu điều kiện thích hợp Sản phẩm muối thu sau lọc rửa để loại acid dư Các yếu tố ảnh hưởng đến trình hình thành muối chitosan phụ thuộc vào kích thước hạt chitosan, tỷ lệ chitosan dung môi phản ứng, nồng độ loại acid, nhiệt độ thời gian phản ứng Có phương pháp điều chế sản phẩm muối chitosan acid: (1) sản phẩm tạo chitosan trạng thái rắn phản ứng với acid môi trường cồn sấy khô, (2) sản phẩm tạo cho chitosan trạng thái rắn phản ứng với acid sấy khô, (3) chitosan hịa tan hồn tồn mơi trường acid tạo gel, sau sấy phun/đơng khơ thành bột sấy khơ tạo màng 1.3 Thu hoạch vi tảo biển Nannochloropsis sp Đến nay, việc thu hồi sinh khối vi tảo trở ngại nên ngành kinh tế vi tảo Việt Nam chưa phát triển mạnh Khó khăn chủ yếu chi phí đầu tư thiết bị cơng nghệ hệ thống thu hoạch vi tảo thương mại cao, phương pháp thu hiệu tập trung số lồi tảo có kích thước lớn vi tảo nước Các giải pháp áp dụng phổ biến nuôi vi tảo trại nuôi thủy sản, ly tâm để thu dạng sệt bảo quản lạnh đến cung cấp cho trại ni giống Ngồi ra, có nhiều phương pháp thu nhận nghiên cứu ứng dụng: lắng trọng lực, vi lọc, đông tụ/kết bông, tuyển kết hợp phương pháp Tuy nhiên, phương pháp tồn số hạn chế chi phí lượng cao, độc tính chất hóa học sử dụng…, khơng khả thi việc mở rộng quy mô sản xuất Những năm gần đây, phương pháp keo tụ vi tảo polyme sinh học nghiên cứu ứng dụng nhằm thay chất hóa học có tính độc hại, chi phí đầu tư thấp, kỹ thuật đơn giản nên dễ áp dụng thực tế Tuy nhiên, lồi vi tảo biển khả thu không cao môi trường vi tảo chứa hàm lượng muối cao, gây ảnh hưởng cho trình keo tụ Muối chitosan có khả hịa tan cao phạm vi pH rộng, mở triển vọng cho ứng dụng chitosan Việc sử dụng chitosan lactate để nghiên cứu phương pháp thu hoạch vi tảo Nannochloropsis sp nhằm giảm chi phí vận chuyển từ trại nuôi vi tảo đến trại nuôi thủy sản giữ chất lượng yêu cầu (hoạt chất sinh học khả phục hồi sinh trưởng) Bên cạnh đó, nghiên cứu phương pháp keo tụ chất hữu cho phù hợp để ứng dụng quy mơ lớn tính hiệu cao, chi phí vận hành thấp, phù hợp nhiều lồi tảo, nhanh chóng, u cầu bảo trì tối thiểu thân thiện với môi trường CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu Vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei), vi tảo Nannochloropsis sp 2.2 Phương pháp nghiên cứu Sơ đồ nghiên cứu tổng quát trình bày Hình 2.4 Giải thích sơ đồ: (1) Đánh giá tiềm sử dụng vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng làm nguyên liệu sản xuất chitin, chitosan Mục tiêu nội dung ước tính sơ sản lượng nhận, thành phần hóa học vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng theo độ tuổi trình ni thâm canh và thử nghiệm sản xuất chitin, chitosan theo quy trình cơng bố (2) Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất chitin, chitosan từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng Mục tiêu nội dung xác định điều kiện thích hợp để thu chitin có độ tinh cao, chitosan có độ deacetyl cao, độ tan tốt từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng, giảm lượng hóa chất sử dụng rút ngắn thời gian khử khống (3) Nghiên cứu xây dựng quy trình điều chế chitosan lactate từ chitosan thu nhận từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng Mục tiêu nội dung xác định thơng số thích hợp cho bước quy trình điều chế chitosan lactate từ chitosan thu nhận từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng Từ đó, đề xuất quy trình điều chế chitosan lactate từ chitosan vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng có độ tan tốt, hiệu suất thu hồi cao tính chất tương đương sản phẩm thương mại (4) Nghiên cứu ứng dụng chitosan lactate điều chế từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng để thu hồi sinh khối vi tảo Nannochloropsis sp cô đặc 5 Mục tiêu nội dung xác định điều kiện thích hợp để kết bơng vi tảo Nannochloropsis sp phương pháp kết hợp dùng chitosan lactate điều chỉnh pH Đồng thời, trì tối đa hàm lượng chlorophyll-a, carotenoids có sản phẩm thu hoạch có khả phục hồi sinh khối vi tảo đáp ứng nhu cầu sử dụng ngành nuôi trồng thủy sản Ao nuôi tôm thâm canh Đánh giá tiềm thu hồi vỏ lột xác Đánh giá khả thu hồi vỏ lột xác theo độ tuổi tơm thẻ chân trắng Đánh giá thành phần hóa học vỏ lột xác thử nghiệm sản xuất chitin theo độ tuổi Vỏ lột xác tôm Nghiên cứu điều kiện sản xuất chitin Nghiên cứu quy trình sản xuất chitin, chitosan Chitin, chitosan Nghiên cứu quy trình điều chế chitosan lactate Chitosan lactate Nghiên cứu phương pháp thu hồi vi tảo Nannochloropsis sp Dịch vi tảo cô đặc Nghiên cứu điều kiện sản xuất chitosan Đánh giá khả trương nở chitosan ảnh hưởng đến độ tan hiệu suất thu hồi chitosan lactate .Nghiên cứu điều kiện điều chế chitosan lactae Đánh giá ảnh hưởng nồng độ chitosan lactate, phương pháp kết hợp dùng chitosan lactate điều chỉnh pH đến hiệu suất lắng theo thời gian thu hoạch Đánh giá ảnh hưởng phương pháp thu hoạch đến hiệu suất thu hồi hàm lượng chlorophyll-a, carotenoids khả sinh trưởng sinh khối vi tảo Nannochloropsis sp Kết luận Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm tổng qt 2.3 Phương pháp phân tích Hàm lượng khống, ẩm xác định theo phương pháp AOAC 1990 Hàm lượng protein vỏ lột xác xác định theo phương pháp Biuret, hàm lượng protein chitin, chitosan xác định theo phương pháp Micro-Biuret; hàm lượng protein có vi tảo xác định theo phương pháp Biuret, xử lý theo phương pháp Dorsey cộng (1978) Hàm lượng chitin xác định theo phương pháp Black Schwartz (1950) Hàm lượng carotenoid vỏ tôm nguyên liệu xác định theo phương pháp Sachindra cộng (2006) Độ deacetyl chitosan xác định theo phương pháp Wu Zivanovic (2008) Độ trương nở chitosan dung môi xác định theo phương pháp Minh cộng (2017) Hàm lượng lipid vỏ tôm vi tảo xác định theo phương pháp Bligh Dyer (1959) Hàm lượng carbohydrate phương pháp phenol-sulphuric acid (Nielsen, 2010) Hàm lượng chlorophyll-a carotenoids vi tảo xác định phương pháp Sumanta cộng (2014) Mật độ tế bào xác định buồng đếm hồng cầu Neubauer improved Hình ảnh soi kích thước vi tảo chụp kính hiển vi Olympus BX41 Khối lượng phân tử chitosan xác định thông qua độ nhớt nội cơng thức Mark-Houwink (2001) Độ hịa tan chitosan chitosan lactate xác định theo phương pháp Minh cộng (2019) Độ nhớt biểu kiến xác định nhớt kế Brookfield Hình ảnh soi vỏ lột xác, chitin, chitosan chụp kính hiển vi điện tử Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier phạm vi 500 – 4000 cm-1 Xác định độ kết tinh tương đối (CrI) mẫu phổ nhiễu xạ tia X (XRD) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H NMR) đo thiết bị quang phổ AV300 MHz, Bruker, Hoa Kỳ 2.4 Cơng thức tính Sản lượng vỏ lột xác tơm thẻ chân trắng thu hồi từ q trình ni thâm canh ước tính theo cơng thức sau: !" G = ! (1.1) # Trong đó: G (kg/kg) sản lượng vỏ lột xác tơm thẻ chân trắng thu hồi từ q trình ni thâm canh MS (kg) lượng vỏ lột xác tơm thẻ chân trắng thu hồi Mo (kg) lượng tôm thương phẩm thu hoạch từ vụ nuôi thâm canh Xác định hiệu suất thu hồi (RE) theo công thức (1.2) Trong đó, M R (g) khối lượng mẫu ban đầu mẫu sau xử lý RE (%) = $∗&'' (1.2) ! Hiệu thu hồi trình keo tụ sinh khối vi tảo xác định thông qua tiêu hiệu suất lắng sinh khối vi tảo Hiệu suất lắng (FE) xác định cách đo mật độ quang học tế bào vi tảo trước sau tiến hành keo tụ Mật độ quang học (OD) đo máy quang phổ UV-VIS (DR6000) 490 nm Cơng thức tính hiệu suất lắng (1.3) (Şirin cộng sự, 2012): !"đ – !") FE (%) = !" x 100 (1.3) đ Trong đó, ODđ ODs mật độ quang dung dịch tảo trước sau keo tụ Xác định hiệu suất thu hồi hàm lượng chất màu (chorophyll-a: RECh-a, carotenoids tổng số: RECarotenoids) theo công thức (1.4) (1.5): " ∗&'' RE %&'( (%) = *+*+ (1.4) , RE %()*+,-*./0 (%) = *"*∗&'' , (1.5) Trong đó, ChT, CT(g) hàm lượng chlorophyll-a, carotenoids mẫu vi tảo ban đầu; ChS, CS hàm lượng chlorophyll-a, carotenoids mẫu sinh khối vi tảo sau thu hoạch 2.5 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu báo cáo giá trị trung bình lần thí nghiệm lặp lại với lần phân tích, có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Số liệu xử lý thống kê phần mềm IBM SPSS Statistics để so sánh giá trị trung bình mẫu nghiên cứu Sử dụng phần mềm Microsoft Excel, Visio Profesional, Origin để vẽ sơ đồ khối, đồ thị 7 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thực trạng tiềm sử dụng vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng làm nguyên liệu sản xuất chitin, chitosan 3.1.1 Thực trạng vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng sở nuôi tôm thâm canh Thực trạng khảo sát số sở nuôi tôm thâm canh nhận thấy, vỏ lột xác tơm tạo liên tục q trình ni Khi diện tích ni tăng nhanh lượng vỏ lột xác tơm tăng đáng kể gây ô nhiễm nguồn nước nuôi khu vực ao nuôi không thu gom xử lý cách Trong đó, vỏ lột xác tơm lại chứa thành phần có giá trị chitin, khống chất Hơn nữa, vỏ lột xác tơm thu gom dễ dàng hệ thống xi phông ao ni thâm canh Vì vậy, việc khảo sát sản lượng vỏ tôm lột xác theo chu kỳ sinh trưởng, từ đề xuất thu gom sử dụng cho sản xuất sản phẩm giá trị gia tăng cần thiết 3.1.2 Sản lượng vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng theo độ tuổi thu hồi q trình ni thâm canh Sản lượng vỏ lột xác tơm thu hồi từ q trình nuôi thâm canh độ tuổi nuôi (³40 ngày tuổi) đạt trung bình ~ 280 (kg/ao/vụ) ao 1500 m2 mật độ thả 200 con/m2 Nếu sản lượng tôm thương phẩm đạt 4.500 – 6.000 kg/ao/vụ (trung bình 5.000 kg/ao/vụ) khả thu hồi vỏ lột xác 0,056 Điều có nghĩa sản lượng tơm thương phẩm thu hoạch có ~56 kg sản lượng vỏ lột xác khô thu vụ nuôi Như vậy, sản lượng vỏ lột xác thu tương đương ~ 5% so với sản lượng tơm thương phẩm 3.1.3 Thành phần hóa học vỏ lột xác thử nghiệm sản xuất chitin Vỏ lột xác tôm độ tuổi từ 40 ngày nuôi đến 90 ngày nuôi xác định, chứa thành phần hóa học gồm chitin (20 – 24%), khoáng (52 – 61%) protein (10 – 13%) Thử nghiệm sản xuất chitin thơng qua quy trình Toan cộng (2006): khử khoáng HCl 4% (1:5, w/v) 30oC 12 khử protein NaOH 4% (1:5, w/v) 30oC 24 Kết cho thấy khả thu hồi chitin phù hợp độ tuổi từ 60 ngày tuổi trở lên với hàm lượng chitin thu 23 – 24%, hàm lượng khống protein cịn lại chitin thấp (£1%) 3.2 Sản xuất chitin từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng 3.2.1 Q trình khử khống Vỏ lột xác tôm trạng thái khác (khô ướt) xử lý với dung dịch HCl có nồng độ khác nhiệt độ 30-70oC 1-12 Kết khảo sát trình bày Hình 3.5 Hình 3.6 Theo đó, nồng độ HCl yếu tố quan trọng định đến hiệu khử khoáng, nhiệt độ thời gian hai yếu tố có ảnh hưởng khơng đáng kể Để làm giảm chi phí sản xuất áp dụng quy mô lớn hạn chế ảnh hưởng khơng có lợi đến chất lượng chitin, đồng thời thỏa mãn điều kiện hàm lượng khoáng cịn lại chitin thơ xấp xỉ 1%, luận án đề xuất điều kiện khử khoáng phù hợp cho mẫu vỏ lột xác ướt khô là: nồng độ HCl 4%, nhiệt độ 30oC thời gian Khi hàm lượng khống cịn lại mẫu chitin thô thu nhận từ mẫu vỏ lột xác ướt 1,3 ± 0,2% khô 1,3 ± 0,1%, hiệu suất thu hồi chitin thô đạt 41,6 ± 1,5% (ướt) 36,3 ± 2,1% (khô) 8 (a) (a) (b) (b) Hình 3.5 Ảnh hưởng nồng độ HCl (%), nhiệt độ xử lý đến hiệu suất thu hồi hàm lượng khống cịn lại chitin thơ ( ( Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ HCl (%), thời gian xử lý đến hiệu suất thu hồi hàm lượng khống cịn lại chitin thơ Ghi chú: Điều kiện chung phản ứng: Tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch HCl: 1:5 (nguyên liệu ướt: a), 1:15 (nguyên liệu khô: b) Các chữ khác biểu đồ (màu sắc theo cột nồng độ (đỏ: HCl 2%, xanh lục: HCl 3%, xanh: HCl 4%), riêng màu đen theo nhiệt độ) khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) 3.2.2 Quá trình khử protein Sau mẫu vỏ lột xác khử khoáng HCl 4% 30oC hai trạng thái mẫu ướt khô thu chitin thô, tiếp tục tiến hành khử protein để thu chitin tinh Quá trình khử protein thực điều kiện: nồng độ NaOH (2%, 3%, 4%), nhiệt độ khử (30oC, 50oC, 70oC) thời gian (3, 6, 9, 12 24h) Kết khảo sát trình bày Hình 3.7 Hình 3.8 Theo đó, hai yếu tố nồng độ NaOH nhiệt độ xử lý ảnh hưởng lớn đến hiệu khử protein Khi nồng độ NaOH nhiệt độ xử lý tăng làm tăng hiệu khử protein tăng Tuy nhiên, nồng độ NaOH (%) sử dụng nhiệt độ xử lý cao khả thu hồi chitin thấp có độ tinh cao Để đạt yêu cầu hàm lượng protein lại thấp 1% tiết kiệm hóa chất, NaOH 3% nồng độ phù hợp xử lý nhiệt độ 50oC với thời gian hiệu suất thu hồi chitin đạt 32,4% nguyên liệu vỏ lột xác ướt 26,3% vỏ lột xác khơ 9 (a) (a) (b) (b) Hình 3.7 Ảnh hưởng nồng độ NaOH (%), nhiệt độ xử lý đến hiệu suất thu hồi hàm lượng protein lại chitin tinh Hình 3.8 Ảnh hưởng nồng độ NaOH (%), thời gian xử lý đến hiệu suất thu hồi hàm lượng protein lại chitin tinh Ghi chú: Điều kiện chung phản ứng: Tỷ lệ chitin thô/dung dịch NaOH: 1:5 hai trạng thái nguyên liệu ban đầu (ướt: a, khô: b) Các chữ khác biểu đồ (màu sắc theo cột nồng độ (đỏ: NaOH 2%, xanh lục: NaOH 3%, xanh: NaOH 4%), riêng màu đen theo nhiệt độ) khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) 3.2.3 Q trình deacetyl hóa Bảng 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ, thời gian deacetyl đến độ deacetyl, độ nhớt, độ tan, hiệu suất thu hồi, hàm lượng khống protein cịn lại sản phẩm Nhiệt độ (oC) Thời Độ Độ nhớt Độ tan Hiệu suất thu Khoáng Protein gian deacetyl (cPs)* (%)* hồi chitosan (%)* (%)* (giờ) (%)* (%)* 12h 83,5 ± 1,4a 1.227 ± 38c 97,0 ± 0,8a 24,2 ± 2,5a 0,5 ± 0,1a 0,11 ± 0,0b o 80 C 24h 86,7 ± 0,7a 986 ± 24b 99,0 ± 0,1b 23,6 ± 2,9a 0,5 ± 0,1a 0,07 ± 0,0ab b a b a 36h 90,2 ± 1,7 639 ± 32 99,0 ± 0,2 23,3 ± 3,0 0,3 ± 0,1a 0,02 ± 0,0a a b a a 12h 86,1 ± 0,1 558 ± 51 97,7 ± 0,7 24,2 ± 2,6 0,3 ± 0,2a 0,15 ± 0,1a o 90 C 24h 89,2 ± 1,6b 479 ± 72b 99,0 ± 0,2b 23,0 ± 2,4a 0,2 ± 0,1a 0,10 ± 0,1a b a b a 36h 90,5 ± 1,3 342 ± 13 99,1 ± 0,2 22,1 ± 3,3 0,1 ± 0,0a 0,09 ± 0,0a * Tính theo lượng chất khô tuyệt đối Các giá trị bảng có ký tự khác khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Chitin thu từ vỏ lột xác tôm deacetyl dung dịch NaOH 50% với điều kiện nhiệt độ (80, 90oC) thời gian (12h, 24h, 36h) khác để thu nhận chitosan Kết khảo sát trình bày Bảng 3.7 Theo đó, nhiệt độ xử lý cao, thời gian xử lý dài chitosan thu có độ deacetyl độ tan cao, độ 10 tinh tăng Tuy nhiên, tiến hành deacetyl nhiệt độ cao kéo dài thời gian độ nhớt giảm hiệu suất thu hồi chitosan thấp Để đạt yêu cầu sản phẩm chitosan có DD ~ 90%, độ tan ~ 99% điều kiện deacetyl phù hợp là: dung dịch NaOH 50%, nhiệt độ 90oC 24 giờ, hiệu suất thu hồi 23%, độ nhớt chitosan 479 cPs có độ tinh cao 3.2.4 Đề xuất quy trình sản xuất chitin, chitosan từ vỏ lột xác Quy trình sản xuất chitin, chitosan từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng, thực qua hai bước khử khống protein (khơng cần thêm bước khử màu) với thời gian ngắn Chế độ khử khoáng HCl 4% nhiệt độ 30oC chế độ khử protein NaOH 3% nhiệt độ 50oC Sản phẩm chitin thu có chất lượng cao (hàm lượng khống protein 1%) Chitin tinh deacetyl hóa NaOH 50% (w/v) 90oC 24 (tỷ lệ 1:5, w/v) Sau lọc rửa trung tính, thu sản phẩm chitosan tinh Hình 3.12 Hình ảnh SEM vỏ lột xác (a,b) độ phóng đại khác nhau, (c) chitin (d) chitosan sản xuất từ vỏ lột xác Hình 3.13 Phổ FTIR chitin (a), chitosan (b) tách chiết từ vỏ lột xác tôm chitosan (c) tách chiết từ vỏ tôm chế biến 11 Sản phẩm thu đánh giá cao độ tinh sạch, hàm lượng kim loại nặng (As, Hg, Cd, Pb) mức cho phép Trạng thái bề mặt của sản phẩm chitin, chitosan so sánh với lớp vỏ lột xác Hình 3.12, cho thấy tinh sản phẩm Điều thấy rõ phân tích XRD (Hình 3.15), tại 2θ 30o – 50o, không thấy xuất đỉnh CaCO3 phổ chitosan khơng có đỉnh tạp chất phổ NMR (Hình 3.14) Chitosan thu có độ kết tinh cao (65,72%) Khi so sánh với sản phẩm chitosan từ vỏ tơm chế biến cấu trúc hóa học cấu trúc tinh thể chitosan từ vỏ lột xác khơng khác biệt thể Hình 3.13 3.15 Hình 3.14 Phổ 1H NMR chitosan tách chiết từ vỏ lột xác Hình 3.15 Phổ XRD vỏ lột xác (a), chitin (b), chitosan (c) tách chiết từ vỏ lột xác chitosan (d) tách chiết từ vỏ tôm chế biến 3.3 Điều chế chitosan lactate Chitosan thu từ vỏ tôm lột xác sử dụng làm nguyên liệu để điều chế chitosan lactate điều kiện trương nở chitosan hỗn hợp dung môi ethanol/nước với tỷ lệ thời gian ngâm khác Sau đó, chitosan trương nở phản ứng với acid lactic với nồng độ, nhiệt độ thời gian khác 3.3.1 Ảnh hưởng nồng độ ethanol (%,v/v) đến độ trương nở Sự ảnh hưởng tỷ lệ EtOH (%, v/v) dung môi ethanol/nước đến độ trương nở chitosan, trạng thái, độ tan hiệu suất thu hồi chitosan lactate trình bày Bảng 3.11 Hình 3.16 Theo đó, độ tan mẫu muối chitosan từ chitosan 12 ngâm trương nở cao hẳn so với mẫu chitosan không trương (ĐC) Tuy nhiên, nồng độ ethanol từ 10 đến 50% độ trương nở khơng đồng khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê Ngồi ra, sau phản ứng với lactic acid, muối chitosan lactate bị tan nhiều nên hiệu thu hồi thấp sản phẩm bị dẻo vón cục, màu vàng sậm sau sấy khô Với tỷ lệ EtOH chiếm 70 80% làm trương nở chitosan tốt tạo muối thu hiệu suất thu hồi cao hỗn hợp dung môi khác Do vậy, để tiết kiệm dung môi, tỷ lệ EtOH/H2O nên chọn để trương nở chitosan 70%, thời gian ngâm giờ, độ trương ~450%, hiệu suất thu muối ~ 152% độ tan ~ 98% Bảng 3.11 Ảnh hưởng tỷ lệ EtOH (%, v/v) dung môi ethanol/nước đến độ trương nở chitosan, trạng thái, độ tan hiệu suất thu hồi chitosan lactate Tỷ lệ EtOH/H2O (%) Độ trương nở (%)* Độ tan (%)* Hiệu suất thu hồi (%)* ĐC 83,7 ± 2,1a 138,3 ± 3,3b d 506,0 ± 28,3 d 10 504,0 ± 27,9 20 501,2 ± 27,8d 30 493,7 ± 26,9cd cd 40 474,4 ± 23,3 50 466,8 ± 14,4bcd 98,2 ± 0,9b 132,1 ± 1,2a 60 452,3 ± 4,7bc 98,3 ± 1,4b 143,6 ± 2,7bc bc b 70 450,6 ± 6,5 98,1 ± 0,3 151,0 ± 1,5d 80 428,8 ± 2,0ab 98,0 ± 0,8b 151,6 ± 0,5d a b 90 402,3 ± 3,4 96,3 ± 0,3 146,3 ± 5,0cd * Tính hàm lượng chất khô tuyệt đối Các giá trị bảng có ký tự giống khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Do mẫu sản phẩm chitosan lactate tạo gel bị hòa tan dung môi sau phản ứng chitosan trương nở dung mơi có tỷ lệ EtOH/H2O khoảng 10 – 40 %, nên khơng thể tính độ tan hiệu suất thu hồi Hình 3.16 (a) Chitosan ngâm trương nở EtOH/H2O tỷ lệ dung môi khác nhau, (b) chitosan sau trương nở phản ứng với lactic acid (c) chitosan lactate thu 3.3.2 Ảnh hưởng thời gian ngâm đến độ trương nở Bảng 3.12 trình bày độ trương nở chitosan, độ tan hiệu suất thu hồi chitosan lactate ngâm chitosan hỗn hợp dung môi EtOH/H2O với tỷ lệ EtOH (70%) thời gian từ 0,25 – 12 13 Bảng 3.12 Ảnh hưởng thời gian ngâm chitosan đến độ trương nở chitosan, độ tan hiệu suất thu hồi chitosan lactate Thời gian ngâm (giờ) Độ trương nở (%)* Độ tan (%)* HSTH (%)* 0,25 425,2 ± 3,2a 90,7 ± 1,8a 140,4 ± 3,4a b ab 0,5 445,6 ± 3,3 93,8 ± 1,7 143,9 ± 2,5ab 446,3 ± 2,7b 94,4 ± 1,5abc 144,6 ± 4,2ab b bcd 447,8 ± 2,8 94,9 ± 1,1 146,2 ± 2,9ab b bcd 448,3 ± 1,5 95,0 ± 1,1 147,7 ± 3,1ab 451,2 ± 3,2b 98,5 ± 0,3d 151,1 ± 2,2b b cd 450,9 ± 6,4 98,1 ± 0,4 151,0 ± 1,6ab b cd 445,7 ± 3,8 98,1 ± 0,3 148,7 ± 2,7ab b cd 10 445,4 ± 2,2 97,8 ± 0,8 148,2 ± 4,0ab 12 445,8 ± 3,1b 96,1 ± 0,4bcd 147,5 ± 2,8ab * Tính hàm lượng chất khơ tuyệt đối Các giá trị bảng có ký tự khác khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Hình 3.17 Chitosan ban đầu trương nở dung môi EtOH/H2O 70% giờ, chitosan ban đầu (a) chitosan ngâm dung mơi (b) kính hiển vi (10x) Kết cho thấy độ trương nở chitosan đạt cao sau 0,5 ngâm để đạt độ tan hiệu suất thu chitosan lactate sau ngâm (Hình 3.17) chitosan cho hiệu cao 98,5% 151% 3.3.3 Ảnh hưởng nồng độ lactic acid Chitosan sau ngâm dung môi EtOH/H2O (70% EtOH) cho phản ứng với lactic acid nồng độ khác (0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9, 1,0 1,5M) Bảng 3.13 cho thấy nồng độ lactic acid tăng hiệu suất thu hồi độ tan chitosan lactate tăng Sử dụng nồng độ lactic acid 1,0 M đạt giá trị cao (độ tan đạt 98,5% hiệu suất thu hồi đạt ~ 152%) không khác biệt thống kê tiếp tục tăng nồng độ Bảng 3.13 Ảnh hưởng nồng độ acid phản ứng đến độ hòa tan hiệu suất thu hồi chitosan lactate Nồng độ lactic acid (M) Độ tan (%)* Hiệu suất thu hồi (%)* 0,5 56,2 ± 2,6a 114,4 ± 6,5a 0,6 72,8 ± 2,7b 132,0 ± 4,4b c 0,7 83,2 ± 2,7 140,5 ± 1,1c d 0,8 92,6 ± 1,6 141,7 ± 1,2c de 0,9 95,4 ± 0,8 144,0 ± 1,6c 1,0 98,5 ± 0,2e 151,8 ± 1,8d e 1,5 98,8 ± 0,1 151,5 ± 1,9d * Tính hàm lượng chất khô tuyệt đối Các giá trị bảng (theo cột) có ký tự khác khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) 3.3.4 Ảnh hưởng thời gian phản ứng Bảng 3.14 trình bày ảnh hưởng thời gian phản ứng chitosan lactic acid đến độ tan hiệu suất thu hồi chitosan lactate Theo đó, tăng thời gian 14 phản ứng độ tan hiệu suất thu hồi sản phẩm tăng ~ 2,5 đầu gần không đổi sau thời gian (hiệu suất thu hồi ~ 152% độ tan đạt 99%) Bảng 3.14 Ảnh hưởng thời gian phản ứng đến độ hòa tan hiệu suất thu hồi chitosan lactate Thời gian phản ứng (giờ) Độ tan (%)* Hiệu suất thu hồi (%)* a 0,5 97,7 ± 0,5 150,8 ± 0,4 a ab 1,0 98,2 ± 0,5 151,1 ± 2,0 a ab 1,5 98,5 ± 0,2 151,8 ± 1,8 a b 2,0 99,4 ± 0,3 151,7 ± 2,8 a 2,5 99,5 ± 0,3 b 152,0± 1,4 a b 3,0 99,5 ± 0,3 151,8 ± 0,2a * Tính hàm lượng chất khô tuyệt đối Các giá trị bảng (theo cột) có ký tự khác khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) 3.3.5 Đề xuất quy trình sản xuất chitosan lactate Quy trình sản xuất chitosan lactate từ chitosan chiết từ vỏ lột xác tôm mơ tả tóm tắt Hình 3.18 Chitosan Nghiền, sàng (35 mesh) Ngâm trương nở chitosan 70% (EtOH/H2O), tỷ lệ 1:10 (w/v), giờ, nhiệt độ phòng Loại dung môi Phản ứng với lactic acid (1M) tạo muối chitosan, tỷ lệ 1:10 (w/v), giờ, nhiệt độ phòng Rửa acid dư Sấy khô 40 oC, ~12 Chitosan lactate Hình 3.18 Quy trình điều chế chitosan lactate từ chitosan vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng Sau nghiền nhỏ, chitosan sàng có kích thước 35 mesh ngâm hỗn hợp dung môi ethanol/nước với tỷ lệ EtOH 70% (tỷ lệ 1:10, chitosan/dung môi, w/v) nhiệt độ phòng Sau làm ráo, chitosan sau trương nở phản ứng với lactic acid 1,0 M dung môi EtOH (1:10, v/v), khuấy đảo nhiệt độ phòng Loại acid dư cách rửa phần rắn lần EtOH 85% (10 15 phút/lần) ngâm EtOH 99,5% (30 phút) Sản phẩm thu sau sấy 40oC đến đạt độ ẩm ~ 10% Sản phẩm chitosan lactate từ chitosan vỏ lột xác so sánh với sản phẩm chitosan lactate sản xuất từ chitosan (tương đương với chất lượng ban đầu) công ty Vietnam Food (Việt Nam) sản xuất quy trình Hình 3.18 Đồng thời hai sản muối so sánh với chitosan lactate thương mại cơng ty MarkNature (Hoa Kỳ) (Bảng 3.16) Bảng 3.16 Tính chất chitosan lactate từ nguồn khác Chitosan lactate Nguồn từ VLX Nguồn từ VNF Nguồn từ Chỉ tiêu MarkNature Độ nhớt (cPs) 105 ± 2b 172 ± 18c 36,3 ± 5,2a b a Độ tan 1% chitosan lactate 99,4 ± 0,3 96,0 ± 0,9 99,6 ± 0,2b nước (%) Điện zeta (mV) 99,3 ± 1,6b 91,7 ± 2,9a 99,1 ± 1,9b HSTH chitosan lactate (%) 151,7 ± 2,8 143,6 ± 1,1 Trạng thái, màu sắc hạt Hạt rời, vàng nhạt Hạt rời, vàng nhạt Bột mịn, vàng nhạt Màu sắc 1% chitosan lactate hòa tan Trắng, Trắng, Vàng nhạt, trong nước Độ ẩm (%) 9,5 ± 0,6a 9,2 ± 0,7a 8,8 ± 0,2a a a pH 1% chitosan lactate hòa tan 4,7 ± 0,2 4,7 ± 0,3 4,7 ± 0,2a nước *Kết tính trọng lượng khơ tuyệt đối; (-) Khơng phân tích; Các giá trị bảng (theo hàng) có ký tự khác khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) (A) (B) Hình 3.20 (A) Phổ FTIR Hình 3.21 (B) phổ XRD (a) chitosan (b) chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm (c) vỏ tôm chế biến công ty Vietnam Food, (d) chitosan lactate thương mại từ cơng ty Mark Natural Bảng 3.16, Hình 3.20 Hình 3.21 cho thấy chitosan lactate thu nhận từ nguồn vỏ tơm lột có tính chất (độ deacetyl, thời gian hòa tan, màu sắc, độ ẩm, hàm lượng khống protein, pH 1% muối hịa tan nước, độ kết tinh, nhóm chức cấu trúc) tương đương với sản phẩm muối sản xuất quy trình từ nguồn vỏ tơm chế biến muối chitosan lactate thương mại Kết phân tích phổ FTIR (Hình 2.20) xác nhận có tạo thành muối chitosan lactate sử dụng chitosan từ vỏ tôm lột để điều chế Khi so sánh với chitosan lactate thương mại muối điều chế từ vỏ tôm chế biến, không thấy khác biệt đáng kể số lượng, vị trí cường độ đỉnh 16 (a) (b) (c) Hình 3.22 Phổ 1H-NMR (a) chitosan lactate thương mại từ cơng ty Mark Nature, Hình 3.23 Phổ 1H-NMR (b) chitosan lactate điều chế từ chitosan thu nhận từ vỏ tôm chế biến công ty Vietnam Food Hình 3.24 Phổ 1H-NMR (c) chitosan lactate điều chế từ chitosan thu nhận từ vỏ lột xác tôm 3.4 Thu nhận vi tảo Nannochloropsis sp chitosan lactate 3.4.1 Tính chất thành phần vi tảo Nannochloropsis sp Vi tảo Nannochloropsis sp (kích thước – µm) nhân giống từ vi tảo gốc lưu trữ Trung tâm nghiên cứu Giống Dịch bệnh thủy sản, Trường Đại học Nha Trang Mẫu dịch vi tảo đạt mật độ tế bào 37,3 x 106 ± 2,6 (tb/mL), màu xanh lục zeta – 6,1 ± 1,5 (mV) thể tế bào vi tảo Nannochloropsis sp có điện tích bề mặt âm Vi tảo chứa hàm lượng carbohydrates với tỷ lệ cao (~ 32,3 %) hàm lượng protein, lipids, khống chất có giá trị ~26,9%, ~16,2% ~8,2% Đặc biệt, hàm lượng đáng kể chlorophyll-a (10.369 ± 174, µg/g) carotenoids (7.368 ± 129, µg/g) vi tảo 3.4.2 Ảnh hưởng nồng độ chitosan lactate Đến nay, chưa có nghiên cứu ứng dụng chitosan lactae để thu hoạch vi tảo Chitosan lactate xem an tồn hịa tan trực tiếp nước ứng dụng công nghệ keo tụ làm nước quả, rượu vang nước trà… Từ sở đó, chitosan lactate (CTSs) đề xuất làm chất keo tụ thu hoạch vi tảo, đặc biệt vi tảo biển (Nannochloropsis sp.) Ảnh hưởng nồng độ chitosan lactate đến hiệu xuất lắng hình thái vi tảo thu trình bày Hình 3.25 Hình 3.25 Ảnh hưởng nồng độ chitosan lactate (ppm) đến hiệu suất lắng theo thời gian thu hoạch (a), thời điểm 15 phút lắng (b) ĐC: mẫu đối chứng Các giá trị biểu đồ có ký tự (theo ký hiệu màu) khác khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Hình 3.25a cho thấy với nồng độ CTSs 300 – 400 ppm đạt hiệu suất lắng cao (75 – 77%) Có khác biệt lớn so với hiệu lắng nồng độ khác thời điểm sau 15 phút lắng (Hình 3.25b) khác biệt không đáng kể kéo dài thời gian lắng (Hình 3.25a) Khi tăng nồng độ chitosan lactate 500 ppm hiệu suất lắng mật độ tế bào thu giảm xuống Vì vậy, để tiết kiệm chitosan lactate, nồng độ 17 300 ppm chọn để tiếp tục nghiên cứu phương pháp kết hợp điều chỉnh pH môi trường 3.4.3 Ảnh hưởng phương pháp kết hợp điều chỉnh pH Việc kết hợp sử dụng chitosan lactate điều chỉnh pH nhằm mục đích đạt hiệu thu cao giảm nhược điểm so với sử dụng phương pháp riêng lẻ Các nghiên cứu minh chứng điện tích bề mặt vi tảo phân tử chitosan thay đổi theo pH mơi trường tùy lồi tảo có pH tối ưu khác Kết khảo sát ảnh hưởng điều chỉnh pH môi trường với nồng độ CTSs khác trình bày Hình 3.26 Hình 3.27 Hình 3.26 Ảnh hưởng nồng độ chitosan lactate pH mơi trường đến hiệu suất lắng (a) hình ảnh vi tảo Nannochloropsis sp thu CTSs 250 ppm kết hợp điều chỉnh độ pH khác (b), thời điểm sau 120 phút lắng Các giá trị biểu đồ có ký tự (theo ký hiệu màu) giống khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Hình 3.26 cho thấy hiệu suất lắng mẫu nồng độ CTSs tăng dần đến mức cao khoảng 90,2% (CTSs 250 ppm) không khác biệt thống kê (p>0,05) tăng nồng độ CTSs lên 300 ppm (khoảng 89%) Như vậy, điều kiên phù hợp để thu nhận vi tảo Nannochloropsis sp nồng độ chitosan lactate 250 ppm kết hợp với điều chỉnh pH 10 Hình 3.27 Ảnh hưởng phương pháp kết hợp chitosan lactate điều chỉnh pH (a, pH 9,0), (b, pH 9,5), (c, pH 10,0) đến hiệu suất lắng theo thời gian thu hoạch ĐC: mẫu đối chứng Các giá trị biểu đồ có ký tự (theo ký hiệu màu) khác khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Hình 3.27 cho thấy hiệu keo tụ chịu ảnh hưởng nồng độ chitosan độ pH khác Trong đó, hiệu suất lắng phụ thuộc lớn đến thay đổi nồng độ chitosan lactate sử dụng Nồng độ CTSs cao hiệu suất lắng vi tảo cao, đạt cao 90% sau lắng Tuy nhiên, khơng có thay đổi đáng kể hiệu suất lắng thu hoạch nồng độ CTSs 300 ppm độ pH điều chỉnh khác khoảng pH 9,0 – 10,0 Với nồng độ CTSs thấp (< 300 ppm), hiệu suất lắng tăng lên tăng độ pH kết hợp 18 Tiến hành so sánh hiệu lắng vi tảo Nannochloropsis sp sử dụng loại CTSs khác thể Bảng 3.18 Hình 3.29 Hiệu suất lắng vi tảo Nannochloropsis sp dùng CTSs từ nguồn chitosan chế biến điều chế muối quy trình với CTSs từ nguồn vỏ lột xác không khác biệt đáng kể (p > 0,05) hiệu cao so với việc sử dụng muối CTSs thương mại (MarkNature) Bảng 3.18 So sánh hiệu thu hồi sinh khối vi tảo Nannochloropsis sp loại chitosan lactate (250 ppm) khác kết hợp điều chỉnh pH sau 15 phút lắng Phương pháp thu Hiệu suất lắng (%) CTSs từ VLX (N) CTSs từ VNF (V) CTSs từ MarkNature (M) CTSs 58,8 ± 1,9 b 58,2 ± 2,4 b 52,5 ± 1,7 a b c CTSs + pH10.0 85,9 ± 0,5 87,5 ± 0,5 65,8 ± 0,7 a Các giá trị bảng (theo hàng) có ký tự khác thể khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Hình 3.29 Hình ảnh sinh khối vi tảo Nannochloropsis sp thu loại chitosan lactate khác (a) có kết hợp điều chỉnh pH 10,0 (b), thời điểm sau 15 phút lắng Hình 3.30 Ảnh hưởng phương pháp thu hoạch vi tảo đến hiệu suất lắng (FE), hiệu suất thu hồi tương đối chất màu (chlorophyll-a carotenoids) (a) sinh khối vi tảo Nannochloropsis sp thu khác (b) thời điểm sau 15 phút lắng Các giá trị biểu đồ có ký tự khác khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Hình 3.31 Hình thái tế bào kính hiển vi quang học sau 15 phút lắng Hình 3.30a cho thấy hàm lượng chlorophyll-a carotenoids tế bào vi tảo bị ảnh hưởng lớn phương pháp thu khơng có thay đổi màu sắc tế bào (sắc 19 tố lục lạp) đáng kể quan sát mắt thường (Hình 3.30b) kính hiển vi (Hình 3.31) Bảng 3.19 Hình 3.32 cho thấy sinh khối vi tảo Nannochloropsis sp sau thu hoạch có khả sinh trưởng phát triển sau ngày nuôi Bảng 3.19 Khả sinh trưởng sinh khối vi tảo Nannochloropsis sp sau thu hoạch Phương pháp thu ngày nuôi (a) Mật độ tế bào (tb/ml) CTSs + pH 10 CTSs 1,08 x 106 ± 0,04 1,29 x 106 ± 0,06 40,23 x 106 ± 1,8 41,63 x 106 ± 1,6 (b) Hình 3.32 Hình ảnh khả sinh trưởng vi tảo sau thu hoạch phương pháp khác sau ngày (a) ngày (b) nuôi Như vậy, sản phẩm chitosan lactate đề tài phù hợp để ứng dụng kết hợp điều chỉnh pH 10,0 để thu hoạch vi tảo biển Nanochloropsis sp đạt hiệu cao (~ 90% sau 120 phút lắng), hiệu suất thu hồi hàm lượng lớn chlorophyll-a (~94%) carotenoids (~88 – 90%) KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu luận án cho phép rút số kết luận sau: 1) Vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng (> 60 ngày ni) từ q trình ni thâm canh sử dụng để sản xuất chitin, chitosan tinh đạt chất lượng thương mại theo quy trình gồm cơng đoạn chính: (1) Khử khống HCl 4% (tỷ lệ 1:5, w/v) 30oC giờ, (2) Khử protein NaOH 3% (tỷ lệ 1:5, w/v) 50oC giờ, deacetyl NaOH 50% (tỷ lệ 1:5, w/v) 90oC 24 Quy trình có tính ổn định cao, hiệu suất sản xuất chitin đạt khoảng 32% sản xuất chitosan đạt khoảng 23% 2) Chitosan sản xuất từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng dùng để điều chế chitosan lactate tinh phương pháp phản ứng rắn – lỏng với dung dịch lactic acid lỗng (1M) theo quy trình gồm cơng đoạn chính: (1) Ngâm trương nở chitosan (35 mesh) hỗn hợp dung môi ethanol/nước (70%) nhiệt độ phòng, (2) Cho chitosan trương nở (ở trạng thái rắn) phản ứng với dung dịch lactic acid 1M (pha ethanol tuyệt đối) nhiệt độ phòng Hiệu suất điều chế đạt khoảng 152% sản phẩm chitosan lactate thu có độ hòa tan nước 99%, độ nhớt khoảng 105 cPs 20 3) Chitosan lactate sản xuất từ vỏ lột xác tơm thẻ chân trắng sử dụng làm chất keo tụ để thu vi tảo Nannochloropsis sp Nồng độ chitosan lactate phù hợp để thu vi tảo 250 ppm, môi trường pH 10,0 Hiệu suất lắng vi tảo Nannochloropsis sp sau 120 phút điều kiện đạt khoảng 90% Sản phẩm vi tảo thu khơng bị vỡ tế bào, có khả nuôi tăng sinh khối hiệu suất thu hồi chất có hoạt tính sinh học vi tảo cao: chlorophyll-a đạt khoảng 94% carotenoids đạt khoảng 88 – 90% Kiến nghị Qua trình thực đề tài luận án dựa kết đạt cho phép đề xuất sau: - Tiếp tục nghiên cứu sản xuất chitin, chitosan chitosan lactate từ vỏ lột xác tôm thẻ chân trắng quy mô pilot - Triển khai thử nghiệm ứng dụng chitosan lactate để thu hoạch vi tảo ao nuôi sinh khối CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG LUẬN ÁN • Bài báo đăng tạp chí nước Phạm Thị Đan Phượng, Đỗ Quốc Dũng, Nguyễn Công Minh, Trang Sĩ Trung, Huỳnh Nguyễn Duy Bảo, Nguyễn Văn Hịa (2021), “Sản lượng vỏ tơm lột xác q trình ni thâm canh thử nghiệm sản xuất chitin”, Tạp chí Khoa học – Cơng nghệ Thủy sản, 3, 51-57 • Bài báo đăng tạp chí quốc tế (ISI, Q2) Pham Thi Dan Phuong, Trang Si Trung, Willem F Stevens, Nguyen Cong Minh, Huynh Nguyen Duy Bao, Nguyen Van Hoa (2022), “Valorization of heavy waste of modern intensive shrimp farming as a potential source for chitin and chitosan production”, Waste and Biomass Valorization, 13(2), 823-830 • Bài báo phản biện tạp chí quốc tế (ISI, Q1) Trang Si Trung, Pham Thi Dan Phuong, Nguyen Cong Minh, Nguyen Thi Nhu Thuong, Witoon Prinyawiwatkul, Huynh Nguyen Duy Bao, Nguyen Van Hoa (2022), “Swollen-state preparation of chitosan lactate from moulded shrimp shells and its application for harvesting marine microalgae Nannochloropsis sp.”, International Journal of Biological Macromolecules, x(xx), xxx