Đang tải... (xem toàn văn)
Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
HỒNG MỘNG HUYỀN
ẢNH HƯỞNG CỦA CHIẾT XUẤT THẢO DƯỢCLÊN ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH VÀ KHẢ NĂNG
KHÁNG BỆNH VI KHUẨN TRÊN
TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei)
LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
HỒNG MỘNG HUYỀN
MÃ SỐ NGHIÊN CỨU SINH P0616006
ẢNH HƯỞNG CỦA CHIẾT XUẤT THẢO DƯỢCLÊN ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH VÀ KHẢ NĂNG
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cô PGS.TS Trần Thị Tuyết Hoa đã dành nhiều thời gian, công sức và tận tình hướng dẫn tôi trong thời gian thực hiện luận án và theo học tại trường.
Xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cô TS Bùi Thị Bích Hằng, Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình hướng dẫn chuyên đề nghiên cứu sinh Xin được gửi lời cảm ơn đến Thầy GS.TS Trần Ngọc Hải, PGS.TS Lê Quốc Việt, PGS TS Nguyễn Trọng Tuân, TS Huỳnh Văn Hiền, Cô TS Đặng Thụy Mai Thy, Chị TS Trần Thị Mỹ Duyên và toàn thể Thầy Cô Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ; quý Thầy/Cô và các Anh/Chị em bộ môn Bệnh học Thủy sản đã sắp xếp công việc cũng như tạo điều kiện thuận lợi về thời gian để tôi có thể hoàn thành chương trình học tập.
Cảm ơn các hộ nuôi nuôi tôm ở tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng đã cung cấp thông tin khảo sát về thảo dược trong nuôi tôm Chân thành biết ơn các anh chị thuộc chi cục Thủy sản, trung tâm khuyến nông khuyến ngư tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng đã nhiệt tình hỗ trợ trong quá trình thu thập số liệu.
Cảm ơn các Anh/Chị nghiên cứu sinh khóa 2016; sự hỗ trợ tích cực của các anh, em học viên cao học: Nguyễn Văn Toàn, Thura Win, Võ Tấn Huy, và các em sinh viên: Nguyễn Thị Quế Anh, Nguyễn Văn Thanh, Hà Thị Tuyết Nhi, Quách Thị Tiểu Nguyệt, Nguyễn Thị Huyền My, Bùi Văn Phiên, Nguyễn Quốc Khánh, Lê Kim Ngọc, Nguyễn Văn Khỏe, Phạm Minh Nhựt, Nguyễn Quí Nhân, Lê Khánh Tường, Nguyễn Thị Mỹ Ngân, Đặng Thị Bé Thảo.
Cuối cùng, sự thành công của luận án không thể không kể đến sự đóng góp không nhỏ của các thành viên trong gia đình, những người luôn ủng hộ, động viên và giúp tôi vượt qua rất nhiều khó khăn trong thời gian học tập Xin chân thành cảm ơn./.
Trang 4TÓM TẮT
Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu xác định được loài thảo dược có khả năng tăng cường miễn dịch không đặc hiệu và khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) trên tôm thẻ chân trắng Nội dung nghiên cứu bao gồm: (1) Khảo sát tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược trong quá trình nuôi tôm biển ở tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng thuộc vùng ĐBSCL; (2) Nghiên cứu sàng lọc chọn ra một số loài thảo dược có khả năng kháng vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus, Vibrio harveyi gây bệnh trên tôm; (3) Xác
định khả năng tăng cường miễn dịch trên tôm của một số chất chiết thảo dược; (4) Thử nghiệm sử dụng chất chiết thảo dược trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ chân trắng.
Thảo dược hay các sản phẩm thảo dược được sử dụng chủ yếu ở mô hình nuôi tôm thâm canh (chiếm 90,9%, n= 20/22) và siêu thâm canh (chiếm 78,8%, n= 52/66) ở Cà Mau và Sóc Trăng, áp dụng trên cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng Nghiên cứu xác định được 18 loài thực vật đang được sử dụng trong nuôi tôm Trong đó, các loài thực vật được dùng phổ biến bao gồm tỏi
(Allium sativum) (73,6%, n= 53/72); diệp hạ châu (Phyllanthus spp.) (45,8%,33/72); ổi (Psidium guajava) (12,5%, n= 9/72); mật gấu (Vernonia
amygdalina) (8,3%; n= 6/72); thù lù (Physalis angulata) (8,3%, n= 6/72) Các
loài thảo dược tiềm năng tập trung ở bộ sơ ri (diệp hạ châu, mần ri), bộ cà (thù lù), bộ cúc (mật gấu, cỏ mực), bộ đào kim nương (ổi), bộ húng (ô rô).
Trong tổng số 15 loài thảo dược phổ biến ĐBSCL được lựa chọn để xác định hoạt tính kháng khuẩn thì có 6 loài thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao
(nhạy) trên cả vi khuẩn V parahaemolyticus (CM5) và V harveyi (T2016-04).
Cụ thể, chất chiết bàng, lựu, diệp hạ châu thân đỏ, diệp hạ châu thân xanh, bần ổi, bần chua có đường kính vòng kháng khuẩn dao động từ 14,7 mm đến 21,7
mm Tất cả 6 chất chiết này đều có tính kìm khuẩn đối với vi khuẩn V.
parahaemolyticus, V harveyi với giá trị MIC (0,095 đến 1,56 mg/mL) và
MBC (6,25 đến 25 mg/mL) Ngoài ra, 6 chất chiết thảo dược này cũng có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với các chủng vi khuẩn phân lập từ ao nuôi tôm thuộc các vùng nuôi khác nhau ở ĐBSCL Nghiên cứu cũng xác định chất
chiết ổi chỉ có hoạt tính kháng khuẩn đối với V parahaemolyticus nhưngkhông có hoạt tính kháng khuẩn đối với V harveyi; ngược lại chất chiết tỏi cóhoạt tính kháng V harveyi nhưng không có hoạt tính kháng V.
Tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung 1% và 2% chất chiết bàng, lựu, diệp hạ châu thân đỏ, bần ổi và bần chua liên tục trong 4 tuần không ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng, tỷ lệ sống và hệ số chuyển đổi thức ăn Cụ thể,
Trang 5tăng trưởng hàng ngày dao động 0,14 đến 0,19 g/con, tốc độ tăng trưởng đặc biệt dao
Trang 6động từ 5,95 đến 6,71%/ngày Hệ số chuyển đổi thức ăn dao động từ 0,95 đến 1,36 Tỷ lệ sống của tôm ở các nghiệm thức thí nghiệm dao động từ 80,3-90,4%.
Chế độ ăn bổ sung chất chiết lá bàng (T catappa) (1%), chất chiết quảbần chua (S caseolaris) (1%, 2%) trong 4 tuần liên tục giúp tôm thẻ chân
trắng tăng cường đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu thông qua tăng cường các chỉ số huyết học, hoạt tính PO, hoạt tính SOD, mức độ biểu hiện các gen miễn dịch (crustin, lysozyme và penaeidin-3a) và tăng tỷ lệ sống khi gây nhiễm thực
nghiệm với V parahaemolyticus Tỷ lệ chết tích lũy ở nghiệm thức bổ sung
2% chất chiết bần chua (35,6%); 1% chất chiết bàng (44,5%); 1% chất chiết bần chua (46,7%) thấp hơn khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng (71,1%).
Kết quả thử nghiệm ghi nhận chất chiết bàng (1%) và bần chua (1%) với nhịp bổ sung liên tục (trong tháng đầu thả nuôi) và nhịp bổ sung 2 tuần (tháng thứ 2) giúp cải thiện sức khỏe tôm thẻ chân trắng, gia tăng các thông số miễn
dịch không đặc hiệu và gia tăng tỷ lệ sống khi cảm nhiễm với V.
Chất chiết từ methanol của lá bàng và quả bần chua được xác định có chứa các hợp chất sinh học bao gồm alkaloids, flavonoids, steroid và triterpenoids, đường khử, tannins và sesquiterpene lactones Như vậy, đây là nghiên cứu đầu tiên xác định được chất chiết quả bần chua có hiệu quả trong tăng cường các thông số miễn dịch và khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm nuôi thương phẩm.
Từ khóa: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính, bàng, bần chua, chất chiết thảo
dược, đáp ứng miễn dịch, tôm thẻ chân trắng
Trang 7The study aimed to determine medicinal plants that can enhance the
immune response and disease resistance of whiteleg shrimp (Penaeus
vannamei) to Vibrio parahaemolyticus causing AHPND The research content
includes (1) surveying the current status and potential of herb usage in shrimp farming in Ca Mau and Soc Trang provinces in the Mekong Delta; (2)
screening for herbal extracts that are resistant to Vibrio parahaemolyticus and
V harveyi causing diseases in shrimp; (3) determining the efficiency of the
screened extracts in shrimp immunity enhancement; (4) testing the screened extracts in whiteleg shrimp to prevent acute hepatopancreatic necrosis.
The investigation showed that in Ca Mau and Soc Trang provinces, medicinal plants or herbal products were mostly used for both black tiger shrimp and whiteleg shrimp in intense shrimp farming (accounted for 90.9%, n=20/22) and super-intensive shrimp farming (accounted for 78.8%, n=52/66) Eighteen species of herbs have been used for shrimp farming The most
common was Allium sativum, which accounted for 73,6% (n=53/72), followedby Phyllanthus spp (45,8%, 33/72); Psidium guajava (12,5%, n=9/72);
Vernonia amygdalina) (8,3%; n=6/72) and Physalis angulata (8,3%, n=6/72).
The majority of potential herbs belong to some orders such as Malpighiales, Solanales, Asterales, Myrtales and Lamiales.
Among fifteen medicinal plants being chosen to determine their antibacterial activity, six medicinal plants had strong antibacterial activities
(sensitive) against both V parahaemolyticus (CM5), and V harveyi (T2016-04) In the test of agar diffusion, Terminalia catappa, Punica
granatum, Phyllanthus amarus, P urinaria L., Sonneratia ovata and S.caseolaris had the diameter of inhibition zones ranging from 14.7 mm to 21.7
mm Moreover, those six extracts were bacteriostatic Their values of MIC (minimum inhibitory concentration) and MBC (minimum bacterial
concentration) values for both V parahaemolyticus and V harveyi varied from
Trang 8significant effects on shrimp growth, survival rate, or feed conversion ratio In detail, weight gain and specific growth rate were 0,14 to 0,19 g/shrimp and 5,95 to 6,71%/day Survival rates ranged from 80.3% to 90.4% The feed conversion ratio was from 0,95 to 1,36.
Being fed constantly with the extract of T catappa (1%), S caseolaris
(1%, 2%) for 4 weeks, the whiteleg shrimp had an enhancement of non-specific immune response, which was indicated through higher values of the hematological parameters, PO activity, SOD activity, gene expression of
crustin, lysozyme, penaeidin-3a) and resistance to V parahaemolyticus
causing acute hepatopancreatic necrosis disease in comparison with the control
(P<0.05) In detail, the cumulative mortality in the treatments of 2% S.
caseolaris (35,6%); 1% T catappa (44,5%); 1% S caseolaris (46,7%) was
much lower than in the control treatment (71,1%).
The results revealed that T catappa L and S caseolaris (1%) extracts
with continuous supplementation (in the first month of stocking) and 2-week interval supplementation (from the 2nd month of stocking) enhanced shrimp health, boosted non-specific immunological parameters and increased survival
rate when being challenge against V parahaemolyticus.
The extracts of T catappa L and S caseolaris both contained bioactive
compounds such as alkaloids, flavonoids, steroids, triterpenoids, reduced sugars, tannins, and sesquiterpene lactones In conclusion, this is the first study
showed that the extract of S caseolaris was able to improve immunological
parameters and resistance to acute hepatopancreatic necrosis in shrimp farming.
Keywords: Acute hepatopancreatic necrosis disease, herbal extract,
immune response, Penaeus vannamei, Terminalia catappa L., Sonneratia
caseolaris.
Trang 9LỜI CAM ĐOAN
Tôi tên là Hồng Mộng Huyền, là NCS ngành nuôi trồng thủy sản, khóa 2016 Tôi xin cam đoan luận án “Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng
(Penaeus vannamei)” là công trình nghiên cứu khoa học thực sự của bản thân
tôi được sự hướng dẫn của PGS TS Trần Thị Tuyết Hoa Đề tài này được tài trợ bởi Dự án Nâng cấp Trường Đại học Cần Thơ (VN14-P6) bằng nguồn vốn vay ODA từ chính phủ Nhật Bản (Đề tài: Nghiên cứu ứng dụng hóa sinh và hóa
- dược trong nuôi trồng thủy sản) Do đó, số liệu nghiên cứu sẽ được sử dụng trong khuôn khổ dự án.
Các thông tin được sử dụng tham khảo trong đề tài luận án được thu thập từ các nguồn đáng tin cậy, đã được kiểm chứng, được công bố rộng rãi và được tôi trích dẫn nguồn tham khảo rõ ràng ở phần Danh mục tài liệu tham khảo Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án này là do chính tôi thực hiện một cách nghiêm túc, trung thực và không trùng lắp với các đề tài khác đã được công bố trước đây.
Tôi xin lấy danh dự và uy tín của bản thân để đảm bảo cho lời cam đoan này.
Cần Thơ, ngàytháng năm 2024
Cán bộ hướng dẫn chínhTác giả thực hiện
Trang 10DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xvi
CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1
1.1Tính cấp thiết của luận án . 1
1.2Mục tiêu nghiên cứu của luận án . 3
1.3Nội dung nghiên cứu của luận án . 3
1.4Những đóng góp mới của luận án . 5
1.5Ý nghĩa thực tiễn của luận án . 6
CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7
2.1Đặc điểm sinh học, tình hình nuôi và tiêu thụ tôm thẻ chân trắng . 7
2.1.1Đặc điểm sinh học . 7
2.1.2Tình hình nuôi và tiêu thụ tôm thẻ chân trắng . 8
2.2Một số bệnh vi khuẩn và hệ miễn dịch trên tôm thẻ chân trắng . 14
2.2.1Một số bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng . 14
2.2.1.1Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính . 14
2.2.1.2Bệnh phát sáng do vi khuẩn Vibrio harveyi . 20
2.2.1.3Giải pháp phòng trị vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên tôm . 23
2.2.2Hệ miễn dịch trên tôm . 26
2.2.2.1Thành phần và chức năng của hệ miễn dịch không đặc hiệu . 26
2.2.2.2Yếu tố môi trường tác động đến đáp ứng miễn dịch . 31
2.3Thảo dược và tác dụng của thảo dược trong nuôi tôm . 31
2.3.1Sơ lược về thảo dược . 31
2.3.2Thành phần loài và phương pháp bổ sung thảo dược trong nuôi trồng thủy sản . 34
Trang 112.3.3Vai trò của thảo dược trong nuôi trồng thủy sản . 35
2.3.3.1Hoạt tính kháng vi khuẩn . 36
2.3.3.2Khả năng kích thích miễn dịch . 40
2.3.4Cơ chế tác động của các chất chiết xuất thảo dược và yếu tố ảnh hưởng đến tác dụng của thảo dược . 43
2.3.4.1Cơ chế kháng khuẩn của thảo dược . 43
2.3.4.2Một số hợp chất và cơ chế tác động của thảo dược đến hệ miễn dịch . 44
2.3.4.3Các yếu tố ảnh hưởng đến thảo dược trong nuôi trồng thủy sản . 45
2.3.5Đặc điểm thảo dược vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long . 48
2.3.5.6Một số loại thảo dược khác . 56
CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 65
3.1Phương tiện nghiên cứu . 65
3.1.1Thời gian và địa điểm thí nghiệm . 65
3.1.2Vật liệu thí nghiệm . 65
3.1.3Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm . 65
3.1.4Môi trường và hóa chất thí nghiệm . 66
3.2Phương pháp nghiên cứu . 67
3.2.1Xác định tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược trong nuôi tôm ở một số địa phương thuộc vùng ĐBSCL . 67
3.2.1.1Địa điểm và số lượng hộ nuôi tôm . 67
3.2.1.2Phương pháp phỏng vấn hộ nuôi tôm . 68
Trang 123.2.2.6Khảo sát khả năng ứng dụng chất chiết thảo dược có hoạt tính kháng
khuẩn đối với vi khuẩn phân lập từ ao tôm bệnh . 72
3.2.3Thí nghiệm xác định khả năng tăng cường đáp ứng miễn dịch, kháng bệnh và tăng trưởng của chất chiết thảo dược ở tôm thẻ chân trắng . 73
3.2.3.1 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến tốc độ tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng 73
3.2.3.2Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến khả năng tăng cường miễn dịch của tôm thẻ chân trắng . 75
3.2.3.3Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến khả năng đề kháng mầm bệnh vi khuẩn của tôm thẻ chân trắng . 77
3.2.4Thử nghiệm sử dụng chất chiết thảo dược trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ chân trắng . 78
3.2.4.1Thí nghiệm bổ sung chất chiết thảo dược cho tôm thẻ chân trắng 79
3.2.4.2Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến hệ miễn dịch của tôm thẻ chân trắng . 80
3.2.4.3Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến khả năng phòng AHPND của tôm thẻ chân trắng . 80
3.2.4.4Định tính một số thành phần hợp chất hóa học trong chất chiết bàng và bần chua . 81
3.3Phương pháp xử lý số liệu . 81
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 82
4.1Tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược trong nuôi tôm ở Cà Mau và Sóc Trăng . 82
4.1.1Đặc điểm hộ nuôi và kỹ thuật nuôi . 82
4.1.2Tình hình sử dụng thảo dược trong nuôi tôm . 84
4.1.3Tiềm năng và nhu cầu sử dụng thảo dược trong nuôi tôm . 87
4.2Hoạt tính kháng vi khuẩn V parahaemolyticus, V harveyi của chất chiết thảo dược . 90
4.2.1Hoạt tính kháng khuẩn của chất chiết thảo dược . 90
4.2.2Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của chất chiết thảo dược . 97
4.2.3Khảo sát khả năng ứng dụng chất chiết thảo dược có hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn phân lập từ ao tôm bệnh . 102
4.2.3.1Phân lập V parahaemolyticus và V harveyi từ ao nuôi tôm . 102
4.2.3.2Khảo sát khả năng ứng dụng chất chiết thảo dược có hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn phân lập từ ao tôm bệnh . 105
Trang 134.3Xác định khả năng tăng cường đáp ứng miễn dịch, kháng bệnh và tăng
trưởng của tôm thẻ chân trắng khi sử dụng một số chất chiết thảo dược 106
4.3.1Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến tốc độ tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng . 106
4.3.2Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến khả năng tăng cường miễn dịch của tôm thẻ chân trắng . 110
4.3.3Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến khả năng đề kháng mầm bệnh vi khuẩn của tôm thẻ chân trắng . 117
4.4Thử nghiệm sử dụng chất chiết thảo dược trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ chân trắng . 122
4.4.1Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến hệ miễn dịch của tôm thẻ chân trắng . 123
4.4.1.1Tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng . 123
4.4.1.2Tăng cường miễn dịch của tôm thẻ chân trắng . 125
4.4.2Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến khả năng phòng AHPND của tôm thẻ chân trắng . 131
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 138
5.1Kết luận . 138
5.2Kiến nghị . 139
TÀI LIỆU THAM KHẢO 140
PHỤ LỤC 174
PHỤ LỤC 1: Nội dung phiếu khảo sát . 174
PHỤ LỤC 2: Một số thông tin về hộ nuôi tôm được khảo sát . 180
PHỤ LỤC 3: Thông tin thảo dược sử dụng trong nghiên cứu . 185
PHỤ LỤC 4: Một số loại hóa chất sử dụng trong phân tích THC, GC, HC 186
PHỤ LỤC 5: Kết quả phân tích thống kê . 187
PHỤ LỤC 6: Số lượng tôm thẻ chân trắng chết hàng ngày khi cảm nhiễm V.
parahaemolyticus . 211
Trang 14DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1: Cơ chế gây bệnh của V harveyi . 21
Bảng 2.2: Vai trò của tế bào máu tôm 27
Bảng 2.3: Các loại thảo dược giúp tăng cường đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu trên tôm (Harikrishnan et al., 2011a) 41
Bảng 2.4: Cơ chế diệt khuẩn của các nhóm hợp chất chính cô lập từ thực vật
44
Bảng 2.5: Công dụng của cây bàng T catappa L. 50
Bảng 2.6: Thành phần hóa học của lựu 52
Bảng 3.1: Thông tin tổng quát của các hộ phỏng vấn về tình hình sử dụng thảo dược trong nuôi tôm 68
Bảng 3.2: Trình tự mồi sử dụng trong các phản ứng realtime PCR 77
Bảng 4.1: Thông tin về đặc điểm của các hộ nuôi tôm 82
Bảng 4.2: Các thông số kỹ thuật về ao nuôi, mật độ thả, tỉ lệ sống và giá trị
kinh tế của các hộ nuôi tôm 83
Bảng 4.3: Thông tin về tình hình sử dụng thảo dược trong các hộ nuôi tôm ở
Cà Mau và Sóc Trăng 84
Bảng 4.4: Cách thức sử dụng thảo dược trong quá trình nuôi tôm 85
Bảng 4.5: Đánh giá về công dụng của thảo dược trong nuôi tôm 86
Bảng 4.6: Các loại sản phẩm phòng trị bệnh hộ nuôi lựa chọn sử dụng trong
Bảng 4.10: Đặc điểm các chủng vi khuẩn phân lập từ tôm ở ao nuôi 103
Bảng 4.11: Đặc điểm các chủng vi khuẩn phân lập từ tôm và nước ao nuôi tôm
104
Bảng 4.12: Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của chất chiết thảo dược đối với các chủng vi khuẩn V parahaemolyticus và V harveyi phân lập từ ao nuôi tôm
(mm) 105
Bảng 4.13: Tốc độ tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung thảo dược sau 4 tuần nuôi 107
Trang 15Bảng 4.14: Tổng tế bào máu (THC) (x106 tb/mL) của tôm thẻ chân trắng ăn
thức ăn bổ sung chất chiết thảo dược sau 2 tuần và 4 tuần 111
Bảng 4.15: Tổng tế bào không hạt (HC), có hạt (GC) (x106 tb/mL) của tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung chất chiết thảo dược sau 2 tuần và 4 tuần 111
Bảng 4.16: Tốc độ tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng sau 8 tuần 123
Bảng 4.17: Tổng tế bào máu (THC) (x106 tb/mL) của tôm thẻ chân trắng ăn
thức ăn bổ sung chất chiết bàng và bần chua 125
Bảng 4.18: Tổng tế bào không hạt (HC), tế bào có hạt (GC) (x106 tb/mL) của tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung chất chiết bàng và bần chua 126
Bảng 4.19: Thành phần hóa học trong chất chiết bàng (T catappa) và bần chua(S caseolaris)… 135
Trang 16DANH SÁCH HÌNH
Hình 1.1: Sơ đồ các nội dung nghiên cứu tổng quát của luận án 4
Hình 2.1: Bản đồ các nước nuôi tôm thẻ chân trắng 7
Hình 2.2: Biểu đồ sản lượng tôm nuôi theo khu vực/nước và xu hướng tăng trưởng đến năm 2021 9
Hình 2.3: Biểu đồ sản lượng tôm nuôi ở các nước thuộc Châu Á và xu hướng tăng trưởng đến năm 2021 10
Hình 2.4: Diễn biến diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng vùng ĐBSCL giai đoạn
Hình 2.9: Kích cỡ tôm thu hoạch ở Châu Á 13
Hình 2.10: Bản đồ các quốc gia xuất hiện bệnh hoại tử gan tụy cấp tính 15
Hình 2.11: Trình tự đầy đủ của plasmid pVA1 gây bệnh AHPND trên tôm 16
Hình 2.12: Tôm thẻ chân trắng nhiễm AHPND có màu nhợt nhạt ruột rỗng,
gan tụy nhợt nhạt, teo (trái); tôm khỏe có màu sắc bình thường (phải) 17
Hình 2.13: Bản đồ trình tự của plasmid pVHvo liên quan đến AHPND trong
V.owensii và sơ đồ nhận dạng trình tự của plasmid pVH 19
Hình 2.14: Mô hình hệ thống cảm biến quorum sensing của V harveyi ) 22
Hình 2.15: Số lượng bài báo nghiên cứu về việc sử dụng thảo dược, tảo, hay
các sản phẩm tự nhiên trong nuôi trồng thủy sản 33
Hình 2.16: Số lượng bài báo nghiên cứu về việc sử dụng thảo dược chống lại
Vibrio gây bệnh trên tôm 33
Hình 2.17: Tỉ lệ phần trăm (%) các bộ phận cây được sử dụng nghiên cứu
dùng trong nuôi trồng thủy sản 34
Hình 2.18: Tỉ lệ phần trăm (%) hoạt tính sinh học của các chiết xuất thực vật
sử dụng trong nuôi trồng thủy sản 36
Hình 2.19: Dung môi phân cực và các hợp chất có độ phân cực tương ứn) 46
Hình 2.20: Các bước nghiên cứu sử dụng cây thuốc trong nuôi trồng thuỷ sản
47
Trang 17Hình 2.21: Tỷ lệ phần trăm nông dân sử dụng phụ gia thức ăn và chiết xuất
thảo dược (mũi tên) trong trại nuôi 48
Hình 3.2: Sơ đồ thí nghiệm xác định tác động của thảo dược kháng vi khuẩn
V.parahaemolyticus trên tôm thẻ chân trắng 73
Hình 3.3: Sơ đồ thí nghiệm chế độ bổ sung thảo dược trên tôm thẻ chân trắng 79
Hình 4.1: Biểu đồ thể hiện phần trăm hộ biết đến thực vật làm thảo dược trong nuôi tôm 88
Hình 4.2: Loài thảo dược được hộ nuôi biết đến trong quá trình khảo sát 89
Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR đối với 2 chủng vi khuẩn Vibrio 91
Hình 4.4: Hoạt tính kháng của các loại chiết xuất thảo dược 93
Hình 4.5: Các loại thảo dược có hoạt tính kháng V parahaemolyticus (CM5) và
V harveyi (T2016-04) 97
Hình 4.6: Khả năng ức chế vi khuẩn V parahaemolyticus (CM5) của chất
chiết thảo dược 98
Hình 4.7: Khuẩn lạc vi khuẩn V parahaemolyticus (A) trên môi trường ChromAgar Vibrio, (B) trên môi trường TCBS 103
Hình 4.8: Kết quả điện di sản phẩm PCR đối với chủng vi khuẩn Vibrioparahaemolyticus 103
Hình 4.9: Khuẩn lạc vi khuẩn V harveyi (A) trên môi trường TCBS, (B) trên môi trường phát quang 104 Hình 4.10: Kết quả điện di sản phẩm PCR đối với chủng vi khuẩn V harveyi.
Trang 18Hình 4.14: Ảnh hưởng của thời gian bổ sung chất chiết đến mức độ biểu hiện của
các gen miễn dịch (A) crustin, (B) lysozyme và (C) penaeidin-3a trong máu của tôm thẻ chân trắng 116 Hình 4.15: Tỷ lệ chết tích lũy của tôm thẻ chân trắng sau 14 ngày cảm nhiễm với vi khuẩn V parahaemolyticus (CM5) 118 Hình 4.16: Tôm thẻ chân trắng thí nghiệm cảm nhiễm với vi khuẩn V.
parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính 119
Hình 4.17: Kết quả PCR tái định danh vi khuẩn V parahaemolyticus (CM5) trong thí nghiệm cảm nhiễm 119 Hình 4.18: Tỷ lệ sống của tôm thẻ chân trắng sau 8 tuần bổ sung chất chiết
gen miễn dịch (A) crustin, (B) lysozyme và (C) penaeidin-3a trong máu của tôm thẻ chân trắng 130 Hình 4.22: Tỷ lệ chết tích lũy của tôm thẻ chân trắng sau 14 ngày cảm nhiễm với vi khuẩn V parahaemolitycus (CM5) 132 Hình 4.23: Tôm thẻ chân trắng thí nghiệm cảm nhiễm với vi khuẩn V.
parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính 133
Hình 4.24: Kết quả PCR tái định danh vi khuẩn V parahaemolyticus (CM5) trong thí nghiệm cảm nhiễm 133
Trang 19DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
AHPND Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease AHPNS Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome
FAO Food & Agriculture Organization of the United Nations
GOAL Global Outlook for Aquaculture Leadership
H&E Haematoxylin & Eosin
Trang 20NB Nutrient Broth
OIE World Organisation for Animal Health
OECD Organisation for Economic Co-operation Development
TCBS Thiosulfate-Citrate Bile Salts
Trang 21CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của luận án
Ở Việt Nam, theo qui hoạch và định hướng phát triển ngành nuôi tôm nước lợ mặn vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) đến 2020 và tầm nhìn 2030 của Bộ Nng nghiệp và Phát triển Nông thôn, tổng diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng theo mô hình nuôi thâm canh đạt 90.000 ha (năm 2020) và tăng lên
100.000 ha (năm 2030), tăng trưởng bình quân 1,06%/năm, qui hoạch nuôi tập trung ở Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Kiên Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Tiền Giang, Long An Đến năm 2030, tổng sản lượng nuôi tôm nước lợ các tỉnh ven biển vùng ĐBSCL là 900.000 tấn, trong đó sản lượng tôm thẻ chân trắng đạt 450.000 tấn (chiếm 50%) Định hướng phát triển theo hướng hiệu quả, bền vững đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm, đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ trong nước và chế biến xuất khẩu.
Tuy nhiên, việc thâm canh hóa nâng cao năng suất kết hợp với vấn đề thời tiết thay đổi thất thường, đã làm gia tăng tình hình dịch bệnh ở hầu hết các mô hình nuôi tôm thương phẩm Vi khuẩn gây bệnh trên tôm nuôi được xác
định chủ yếu là do các loài Vibrio spp Ở trại sản xuất tôm giống, Vibrio
harveyi là mầm bệnh vi khuẩn thường gặp, gây bệnh phát sáng trên ấu trùng,
hậu ấu trùng tôm Bệnh phát sáng được ghi nhận gây thiệt hại về kinh tế cho nghề nuôi tôm của nhiều nước trên thế giới như Indonesia (Sunaryanto &
Mariam, 1986), Thái Lan (Jiravanichpaisal et al., 1994), Philippines(Baticados et al., 1990; Lavilla- Pitogo et al., 1990), Australia (Pizzutto &Hirst, 1995), Đài Loan (Liu et al., 1996 a; b) và Ecuador (Robertson et al.,
1998) Trong ao nuôi thương phẩm, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Acute hepatopancreatic necrosis disease - AHPND) được ghi nhận là một trong các bệnh phổ biến trên tôm nuôi vùng ĐBSCL Từ đầu năm 2022 đến nay, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính xảy ra tại 75 xã của 11 tỉnh, thành phố với tổng diện tích trên 342 ha, tăng 7% (Tổng cục Thủy sản, 2022).
Trang 22gen
Trang 23độc tố PirA, PirB gây bệnh AHPND trên tôm phổ biến ở nhiều loài Vibrio.Các gen độc tố có thể được truyền từ loài vi khuẩn Vibrio này sang loài vikhuẩn Vibrio khác (Kondo et al., 2015) Do đó, khả năng kiểm soát bệnh hoại
tử gan tụy cấp tính hay bệnh do vi khuẩn nói chung cũng gặp nhiều khó khăn Sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh do vi khuẩn là giải pháp thường được người nuôi tôm áp dụng, tuy có tác động tích cực nhưng vẫn không được khuyến cáo sử dụng vì các tác động xấu đến môi trường Việc sử dụng nhiều kháng sinh đã dẫn đến sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc
(Miranda & Zemelman, 2002; Seyfried et al., 2010), kháng sinh tồn lưu trong
sản phẩm thủy sản, dẫn đến những hậu quả tiềm ẩn đối với sức khỏe con
người (Romero Ormazábal et al., 2012) Việc sử dụng nhiều chất kháng sinh,
thuốc tổng hợp đã cho thấy các hiện tượng mẫn cảm và tác dụng phụ không mong muốn (Atal, 1982), như ảnh hưởng đến sự phát triển và ức chế cơ chế tự bảo vệ của ấu trùng (Brown, 1989) Vaccin cũng được coi là một liệu pháp tiềm năng giúp phòng bệnh vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản Tuy nhiên, vaccin thương mại quá đắt để sử dụng rộng rãi bởi một loại vaccine đơn chỉ có
hiệu quả chống lại một loại mầm bệnh (Sakai, 1999; Pasnik et al., 2005;Harikrishnan et al., 2011b).
Trong nhóm các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên, chất chiết thảo dược là những chiết xuất từ thực vật có chứa các hợp chất sinh học giúp phòng và trị bệnh ở đối tượng sử dụng (Prasad & Variyur Padhyoy, 1993) Nhiều loại thảo dược được xác định có chứa nhiều hợp chất hoạt tính sinh học cao giúp kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm, ký sinh trùng, kích thích tăng trưởng, kích
thích sự thành thục, chống stress, tăng cường miễn dịch (Direkbusarakom et
al., 2004; Chitmanat et al., 2005; Citarasu, 2010; Chakraborty & Hancz, 2011;
Harikrishnan et al., 2011a; b; c; Ji et al., 2012; Reverter et al., 2014; 2017;
2021) Đặc biệt, nhiều loài thảo dược được xác định có hoạt tính kháng khuẩn cao, có phổ kháng khuẩn rộng, diệt được cả vi khuẩn Gram dương và Gram
âm (Castro et al., 2008; Roomiani et al., 2013) Bên cạnh đó, thảo dược với
Trang 24guajava,
Trang 25Rhodomyrtus tomentosa và Syzygium cumini (họ Myrtaceae) đã được xác định
hiệu quả giúp tôm kháng Vibrio gây bệnh (Reverter et al., 2017; Ghosh et al.,
2021) Do vậy, việc sàng lọc các loài thảo dược sẵn có giúp tăng cường hệ miễn dịch tôm, tăng sức đề kháng mầm bệnh nhằm tìm ra giải pháp phòng bệnh an toàn sinh học sẽ mang lại hiệu quả thiết thực cho người nuôi tôm vùng
ĐBSCL Từ những cơ sở nêu trên, đề tài nghiên cứu “Ảnh hưởng của chiếtxuất thảo dược lên miễn dịch và khả năng kháng khuẩn trên tôm thẻ chân
trắng (Penaeus vannamei)” được thực hiện.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án
Nghiên cứu được thực hiện nhằm: (i) Đánh giá tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược trong nuôi tôm biển ở một số hộ nuôi tôm thuộc các tỉnh thuộc vùng ĐBSCL; (ii) Chọn lọc được một số loài thảo dược phổ biến ở ĐBSCL có
hoạt tính kháng khuẩn trong điều kiện in-vitro, cũng như khả năng tăng cườngmiễn dịch và giúp tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) kháng vi khuẩn gâybệnh hoại tử gan tụy cấp tính trong điều kiện in-vivo; (iii) Xác định một số hợp
chất tự nhiên trong chất chiết thảo dược có hiệu quả trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính Trên cơ sở đó, kết quả nghiên cứu góp phần đóng góp các thông tin khoa học làm cơ sở đề xuất giải pháp ứng dụng sản phẩm thảo dược
trong phòng bệnh do vi khuẩn gây ra, đặc biệt là nhóm vi khuẩn Vibrio, điều
này góp phần đề xuất các giải pháp quản lý dịch bệnh tổng hợp và phát triển nghề nuôi tôm biển bền vững.
1.3 Nội dung nghiên cứu của luận án
Nhằm đạt được mục tiêu đề ra, luận án được thực hiện bao gồm 4 nội dung chính (Hình 1.1):
Khảo sát tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược trong quá trình nuôi tôm biển ở tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng thuộc vùng ĐBSCL.
Sàng lọc một số loài thảo dược có khả năng kháng vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus, Vibrio harveyi gây bệnh trên tôm.
Trang 26Xác định loại chất chiết thảodược lên tăng trưởng, đáp ứngtiềm năng sử dụng thảo dược trong quá trình nuôi tôm biển
- Chọn thảo dược được chiết thảo dược trong phòng bệnh AHPND trên tôm
chất hóa học cơ bản trong môt số chất chiết thảo dược có hiệu quả trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm.
Trang 271.4 Những đóng góp mới của luận án
Luận án có những đóng góp về mặt nghiên cứu khoa học và khả năng ứng dụng của thảo dược đối với ngành nuôi trồng thủy sản ở một số nội dung:
Khảo sát cho thấy tỷ lệ hộ nuôi sử dụng thảo dược trong nuôi tôm là rất cao, mô hình sử dụng là thâm canh và siêu thâm canh, đối tượng áp dụng cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng.
Xác định được 18 loài thực vật đang được sử dụng trong nuôi tôm, trong đó tỏi là loài được sử dụng phổ biến nhất, tiếp theo là cây diệp hạ châu
(Phyllanthus spp.), ổi (Psidium guajava), mật gấu (Vernonia amygdalina), thùlù (Physalis angulata) Các loài thảo dược tiềm năng tập trung ở bộ sơ ri (diệp
hạ châu, mần ri), bộ cà (thù lù), bộ cúc (mật gấu, cỏ mực), bộ đào kim nương (ổi), bộ húng (ô rô).
Xác định được 6 loài thảo dược thu thập ở vùng ĐBSCL có hoạt tính
kháng khuẩn cao đối với V parahaemolyticus (CM5) và V harveyi
(T2016-04) bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch, bao gồm chất chiết bằng
methanol của bàng (Terminalia catappa), lựu (Punica granatum), diệp hạ châuthân đỏ (P urinaria L.), diệp hạ châu thân xanh (Phyllanthus amarusSchumach & Thonn), bần ổi (Sonneratia ovata), bần chua (S caseolaris) Tất
cả 6 chất chiết thảo dược này đều có tính kìm khuẩn Ngoài ra, các chất chiết
này đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với các chủng V.
parahaemolyticus và V harveyi phân lập từ ao nuôi tôm.
Xác định được liều lượng và thời gian bổ sung chất chiết xuất từ lá bàng
(T catappa) và chất chiết xuất từ quả bần chua (S caseolaris) (1% và nhịp bổsung 2 tuần) giúp tôm thẻ chân trắng (P vannamei) tăng cường đáp ứng miễndịch không đặc hiệu và khả năng kháng V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử
gan tụy cấp tính Đồng thời với liều lượng và thời gian bổ sung các chất chiết này không ảnh hưởng đến tăng trưởng, tỷ lệ sống và hệ số chuyển đổi thức ăn của tôm thẻ chân trắng.
Trang 281.5 Ý nghĩa thực tiễn của luận án
Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chất chiết thảo dược trên vi khuẩn
gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (V parahaemolyticus) và vi khuẩn gây bệnhphát sáng (V harveyi) là cơ sở khoa học và tiền đề cho các nghiên cứu tiếp
theo nhằm xác định giải pháp phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính và bệnh phát sáng hiệu quả và an toàn.
Kết quả đạt được của nghiên cứu cung cấp thông tin, số liệu về tiềm năng sử dụng thảo dược trong nuôi trồng thủy sản Cụ thể, thông tin khảo sát giúp xác định rõ thực trạng và nhu cầu sử dụng thảo dược của người nuôi tôm; chọn lọc được một số loài thảo dược có khả năng kháng khuẩn, tăng cường miễn dịch kháng vi khuẩn gây bệnh và không ảnh hưởng đến tăng trưởng của tôm nuôi; xác định loài thảo dược có khả năng ứng dụng vào quá trình nuôi tôm thẻ chân trắng thương phẩm.
Từ đó, kết quả nghiên cứu đóng góp thông tin khoa học: (i) cho định hướng ứng dụng thảo dược vào quy trình nuôi tôm; nhằm hạn chế việc sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi thủy sản; (ii) giúp cho các nhà khoa học và cơ quan quản lý thuốc kháng sinh có giải pháp ngăn chặn và kiểm soát vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh nhằm hướng đến việc sản xuất tôm an toàn và bền vững.
Trang 29CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Đặc điểm sinh học, tình hình nuôi và tiêu thụ tôm thẻ chân trắng2.1.1 Đặc điểm sinh học
Tôm thẻ chân trắng có tên khoa học là Penaeus vannamei (Boone, 1931)hay còn được gọi với tên Litopenaeus vannamei, loài này thuộc họ tôm he, họ
tôm này là họ tôm có nhiều loài được nuôi phổ biến trên thế giới (Flegel,
2007; Fofonoff et al., 2018) Năm 1997, Pérez Farfante & Kensley đã đề xuấttôm thẻ chân trắng với danh pháp khoa học là Litopenaeus vannamei, nhóm
tác giả đã dựa trên những khác biệt về hình thái, đặc biệt là những đặc trưng về cơ quan sinh dục Tuy nhiên, kết quả dựa vào đặc điểm hình thái để phân
nhánh giống Penaeus đã không thống nhất với các kết quả phân tích di truyền,do vậy được kết luận giữ nguyên tên giống Penaeus (Fofonoff et al., 2018).
Flegel (2007) cho rằng sự định loại sai sẽ ảnh hưởng đến nghiên cứu dịch tễ học, cũng như việc quản lý dịch bệnh trên tôm.
Tôm thẻ chân trắng là loài tôm nhiệt đới, có nguồn gốc từ vùng biển Tây
Mỹ Latinh, phân bố từ phía Nam Peru đến phía bắc Mexico Đầu những năm 1970, chúng được đưa đến các đảo ở Thái Bình Dương, từ đây các nghiên cứu đầu tiên về lai tạo giống được tiến hành nhằm nâng cao tiềm năng nuôi trồng thủy sản đối với đối tượng này Vào cuối những năm 1970 và đầu những năm 1980, tôm thẻ chân trắng được đưa tới Hawaii và bờ biển phía Đông Đại Tây Dương, bao gồm các nước thuộc Châu Mỹ, phía Nam Carolina, Bắc Texas đến Trung Mỹ và Nam Brazil Từ đó, tôm thẻ chân trắng đã trở thành loài nuôi chính ở Ecuador, Mexico, Venezuela, Brazil, và Trung Mỹ Tôm thẻ chân trắng được đưa vào Châu Á nuôi thử nghiệm từ năm 1978 đến năm 1979, nhưng chỉ được thương mại hóa từ năm 1996 ở Trung Quốc và Đài Loan, sau đó mở rộng sang Philippin, Indonesia, Việt Nam, Thái Lan, Malaysia và Ấn Độ (2000- 2001) (Hình 2.1) (FAO, 2006).
Trang 30Ở Việt Nam vào đầu những năm 2000, tôm thẻ chân trắng cũng được du nhập và nuôi, tuy nhiên việc nuôi đối tượng này vẫn còn hạn chế vì những lo ngại rằng tôm thẻ chân trắng có khả năng truyền bệnh truyền nhiễm cho tôm bản địa Mãi đến năm 2006, ngành thuỷ sản đã cho phép nuôi bổ sung tôm chân trắng tại các tỉnh từ Quảng Ninh đến Bình Thuận, nhưng vẫn cấm nuôi tại khu vực ĐBSCL Đầu năm 2008, nhận thấy thị trường thế giới đang có xu hướng tiêu thụ mạnh mặt hàng tôm thẻ chân trắng của Thái Lan, Trung Quốc… và sản phẩm tôm sú nuôi của Việt Nam bị cạnh tranh mạnh, hiệu quả sản xuất thấp, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (Bộ NN&PTNT) đã ban hành Chỉ thị số 228/CT-BNN&PTNT cho phép nuôi tôm chân trắng tại vùng ĐBSCL nhằm đa dạng hoá sản phẩm thuỷ sản xuất khẩu, giảm áp lực cạnh tranh, đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng của các nước trong khu vực và trên thế giới (Bộ NN&PTNT).
2.1.2 Tình hình nuôi và tiêu thụ tôm thẻ chân trắng
Theo ghi nhận từ FAO (2006) (FAO Fisheries & Aquaculture Department) tôm thẻ chân trắng được nuôi với các hình thức: quảng canh, bán thâm canh, thâm canh và siêu thâm canh, tương ứng với mật độ thả thấp, trung bình, cao và rất cao Thông số chi tiết mô tả các mô hình bao gồm: (i) Mô hình quảng canh: tôm nuôi ở những vùng gần biển, không sử dụng hệ thống bơm nước, không sục khí Ao có hình dạng không đều, thường diện tích 5-10 ha (tối đa 30 ha) và độ sâu 0,7-1,2 m Giống từ tự nhiên thông qua việc lấy nước bằng cống cấp nước hay thu mua, tôm được thả với mật độ 4-10 PL/m2 Thức ăn cho tôm chủ yếu là thức ăn tự nhiên và cho ăn một lần trong ngày hay ăn thức ăn có hàm lượng protein thấp Kích cỡ tôm thu hoạch 11-12 g/con sau 4-5 tháng nuôi Năng suất đạt 150-500 kg/ha/vụ, với 1-2 vụ/năm (ii) Mô hình bán thâm canh: ao nuôi có diện tích 1-5 ha, giống được thả với mật độ 10-30 PL/ m2 Ao nuôi thường được thay nước, độ sâu của ao là 1,0-1,2 m và sục khí ở mức tối thiểu Thức ăn cho tôm ăn là thức ăn tự nhiên và được bổ sung thêm thức ăn công nghiệp với chế độ 2-3 lần/ngày Năng suất trong các ao bán thâm canh dao động từ 500-2000 kg/ha/vụ, với 2 vụ/năm (iii) Mô hình thâm canh: các trang trại thường được đặt tại các khu vực không có thủy triều, nơi ao có thể thoát nước hoàn toàn, phơi khô và thuận tiện cho chuẩn bị trước trong mỗi lần thả nuôi, cách xa biển ở những khu vực có độ mặn thấp Ao được thiết kế là ao đất, hay có lót bạt để giảm xói mòn và tăng cường chất lượng nước Ao thường nhỏ (0,1-1,0 ha), có hình vuông hoặc tròn Độ sâu của nước thường lớn hơn 1,5 m Mật độ thả giống dao động từ 60-300 PL/m2 Cho ăn với thức ăn công nghiệp chế độ ăn 4-5 lần/ngày, FCR đạt khoảng 1,4 - 1,8 : 1 kg tôm Sản lượng tôm khoảng 20.000 kg/ha/vụ, với 2-3 vụ/năm, có thể đạt được tối đa
Trang 31hình này có thể vận hành theo hệ thống biofloc và duy trì hệ vi sinh vật dị dưỡng Thức ăn có hàm lượng protein thấp và được cho ăn 2-5 lần/ngày, đồng thời phải duy trì tỷ lệ C: N là 10: 1, ao nuôi hình thành các hạt floc là một nhóm hệ sinh vật, tôm sẽ tiêu thụ các hạt floc này, giảm sự phụ thuộc vào thức ăn giàu protein, giảm FCR và tăng hiệu quả chi phí (iv) Mô hình siêu thâm canh tôm được nuôi khép kín, không trao đổi nước (chỉ bổ sung lượng ít do bay hơi hoặc xả thải), tôm giống được kiểm tra là tôm sạch bệnh Hệ thống nuôi này được cho là an toàn sinh học, thân thiện với môi trường, có thể sản xuất tôm chất lượng cao, tiết kiệm chi phí Sản lượng 28.000-68.000 kg/ha/vụ với tốc độ tăng trưởng 1,5 g/tuần, tỷ lệ sống đạt 55-91%, trọng lượng trung bình 16-26 g và FCR là 1,5- 2,6:1 kg tôm Ở Việt Nam, một số tỉnh giáp biển cũng đã sớm có những ban hành các qui định điều kiện nuôi tôm phù hợp với địa bàn địa phương, như quyết định số 05/2019/QĐ-UBND ngày 12/3/2019 của Ủy ban Nhân Dân tỉnh Trà Vinh về điều kiện nuôi tôm nước lợ siêu thâm canh, công nghệ cao trên địa bàn tỉnh Trà Vinh.
Bên cạnh sự phát triển về sự đa dạng hình thức, kỹ thuật nuôi nhằm nâng cao năng xuất, thì trong một thập kỷ qua tình hình dịch bệnh và khủng hoảng kinh tế cũng dẫn đến ngành công nghiệp nuôi tôm có nhiều biến động, tuy nhiên năm 2016 và 2017 đã có dấu hiệu phục hồi Theo khảo sát của Liên minh Nuôi trồng Thủy sản Toàn cầu (Global Outlook for Aquaculture Leadership – GOAL) và Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (Food & Agriculture Organization of the United Nations - FAO) tỷ lệ tăng trưởng hàng năm (compound annual growth rate - CAGR) giai đoạn 2012 đến 2017 là 2,2% Bên cạnh đó GOAL đã báo cáo năm 2018 sản lượng gia tăng + 11% so với năm 2017 và có những ước tính về sự tăng trưởng hơn nữa vào năm 2021 (Hình 2.2) (GOAL, 2019).
Trang 32Sản lượng tôm trên toàn cầu đạt 4,5 triệu tấn vào năm 2018 và có khả năng lên hơn 5,00 triệu tấn vào năm 2021 Đặc biệt tăng trưởng mạnh ở Việt Nam và Trung Quốc, với dự đoán về CAGR lần lượt là 4,6 và 3,9% từ 2018 đến 2021 Bên cạnh xu hướng tăng lên về sản lượng tôm của Việt Nam và Trung Quốc thì các nước Ấn Độ và Indonesia cho thấy sự giảm xuống, cụ thể ở Indonesia dự kiến chỉ sản xuất 450.000 tấn vào năm 2021, tức là giảm 18% so với sản lượng được báo cáo trong năm 2017 Ấn Độ đạt mức sản xuất là 700.000 tấn vào năm 2018 nhưng dự kiến sản lượng giảm xuống 600.000 tấn vào năm 2021 Tuy nhiên, Thái Lan sản lượng tôm vẫn đang tiếp tục phục hồi sau sự tác động của AHPND, nhưng có tốc độ tăng trưởng chậm với sản lượng dự kiến sẽ đạt 330.000 tấn vào năm 2021, chỉ bằng 56% của năm 2010 (trước khi dịch bệnh AHPND xuất hiện (Hình 2.3) (GOAL, 2019).
Hình 2.3: Biểu đồ sản lượng tôm nuôi ở các nước thuộc Châu Á và xuhướng tăng trưởng đến năm 2021 (Nguồn: FAO (2019) và GOAL (2011
đến 2018) cho năm 2010 đến 2017, GOAL (2019) cho năm 2018 đến 2021)
Nuôi tôm thẻ chân trắng vùng ĐBSCL bắt đầu phát triển vào năm 2008 Quyết định số 456/QĐ-BNN-NTTS ngày 04/02/2008 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (Bộ NN&PTNT) Đến năm 2014, tổng diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng tại 8 tỉnh (Cà Mau, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Trà Vinh, Bến Tre, Kiên Giang, Tiền Giang, Long An) vùng ven biển ĐBSCL là 60.952 ha, tăng hơn 13 lần so với năm 2008 (4.477 ha) với mức tăng trưởng bình quân đạt 54,53%/năm (Hình 2.4).
Trang 33Hình 2.4: Diễn biến diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng vùng ĐBSCL giaiđoạn 2008 – 2014 (Nguồn: Tổng cục Thủy sản, Sở NN&PTNT 8 tỉnh ven biển
vùng ĐBSCL)
Trong đó, tỉnh Sóc Trăng có diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng lớn nhất chiếm 44,33% kế đến là Bạc Liêu, Cà Mau lần lượt là 13,25; 10,83% (Hình 2.5) vào năm 2014.
Hình 2.5: Cơ cấu diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng các tỉnh vùng
Trang 34Hình 2.6: Cơ cấu sản lượng nuôi tôm thẻ chân trắng các tỉnh vùngĐBSCL năm 2014 (Nguồn: Tổng cục Thủy sản, Sở NN&PTNT 8 tỉnh ven
biển vùng ĐBSCL)
Qua những con số thống kê trên cho thấy Cà Mau và Kiên Giang là 2 tỉnh được trú trọng đầu tư và khai thác triệt để điều kiện của vùng nhằm tăng cường diện tích nuôi và nâng cao sản lượng Theo Bộ NN&PTNT định hướng diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng vào 2030 thì tỉnh Cà Mau có diện tích nuôi lớn nhất kế đến là Sóc Trăng Các tỉnh khác cũng có diện tích tăng lên nhưng thấp hơn so với Cà Mau và Sóc Trăng Đồng thời sản lượng tôm thẻ chân trắng theo định hướng đến năm 2030 sản lượng tôm thẻ chân trắng gần bằng sản lượng tôm sú, ở Sóc Trăng sản lượng tôm thẻ chân trắng cao hơn tôm sú và đứng hàng thứ 2 trong tổng 8 tỉnh ven biển ĐBSCL (Hình 2.7 và 2.8).
Hình 2.7: Diện tích nuôi tôm nước lợ ở các tỉnh ĐBSCL đến năm 2020 vàtầm nhìn đến 2030 (ha)
Trang 35Hình 2.8: Sản lượng nuôi tôm nước lợ các tỉnh ĐBSCL đến năm 2020,tầm nhìn đến 2030 (tấn)
Theo quyết định số 456/QĐ-BNN-NTTS cho phép phát triển mô hình nuôi tôm thẻ chân trắng thâm canh Diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng theo mô hình nuôi thâm canh đạt 90.000 ha (năm 2020) và tăng lên 100.000 ha (năm 2030), tăng trưởng bình quân 1,06%/năm Diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng thâm canh được bố trí nuôi tập trung ở các huyện Đầm Dơi, Cái Nước, Phú Tân, Thới Bình, Năm Căn, Trần Văn Thời, Ngọc Hiển và thành phố Cà Mau (Cà Mau), thị xã Vĩnh Châu và các huyện Trần Đề, Long Phú, Cù Lao Dung, Mỹ Xuyên (Sóc Trăng) và một số huyện và thành phố trực thuộc các tỉnh Bạc Liêu, Bến Tre, Trà Vinh, Kiên Giang, Tiền Giang, Long An Qua kế hoạch định hướng phát triển diện tích nuôi và sản lượng đạt được vào năm 2030 còn cho thấy được một số tỉnh được chọn là nơi đột phá về năng xuất trong đó Cà Mau và Sóc Trăng là 2 tỉnh có tiềm năng nhất tính đến kế hoạch 2030.
Tuy nhiên với tình hình dịch bệnh ngày càng phức tạp và dưới sự tác động yếu tố thời tiết, để giảm thiểu rủi ro người nuôi dân thu hoạch tôm với kích cỡ nhỏ.
Trang 36Cụ thể, ở biểu đồ Hình 2.9 cho thấy ở các nước Châu Á, kích cỡ tôm thu hoạch có xu hướng nhỏ hơn (khoảng 51-60 con/kg và nhỏ hơn) kể từ năm 2011 Tỷ lệ kích cỡ tôm thu hoạch nhỏ tăng từ 27% trong năm 2010 lên 48% vào năm 2017 Tuy nhiên tỷ lệ kích cỡ tôm thu hoạch nhỏ giảm xuống còn 37% vào năm 2018, nhưng nhìn chung vẫn cao hơn so với kích cỡ tôm thu hoạch được báo cáo trước năm 2010 Cụ thể nguyên nhân do bùng phát dịch bệnh AHPND vào năm 2009 (GOAL, 2019).
2.2 Một số bệnh vi khuẩn và hệ miễn dịch trên tôm thẻ chân trắng
Bệnh được định nghĩa là sự thay đổi bất kỳ từ trạng thái bình thường của sức khỏe Là sự kết hợp của các triệu chứng do duy nhất một nguyên nhân hoặc nhiều nguyên nhân xảy ra cùng nhau để tạo thành một biểu hiện lâm sàng riêng biệt Kết quả là dẫn đến các dấu hiệu bệnh lý của bệnh như tăng trưởng kém hoặc giảm sức đề kháng, căng thẳng (Dorland’s Medical Dictionary, 1968) Các bệnh xuất hiện trên tôm nuôi bao gồm bệnh truyền nhiễm và bệnh không truyền nhiễm (Lightner & Redmanr, 1998) Trong đó, bệnh truyền nhiễm với tác nhân chủ yếu là virus, vi khuẩn, nấm, protista và metazoan
(Lightner, 1993; 1996; Brock & Lightner, 1990b; Fulks et al., 1992) Một số
tác nhân gây bệnh không truyền nhiễm bao gồm các biến động tiêu cực của môi trường, mất cân bằng dinh dưỡng, chất độc và yếu tố di truyền (Brock & Lightner, 1990a; Lightner, 1996).
Hiện nay với sự tăng cường của ngành nuôi tôm và chuyển giao các sinh vật thủy sản trên toàn thế giới dẫn đến gia tăng tỷ lệ mắc bệnh truyền nhiễm, cũng như sự diễn biến phức tạp của tình hình dịch bệnh Nhóm vi khuẩn gây
bệnh trên tôm thẻ chân trắng chủ yếu là do Vibrio, nhóm vi khuẩn Vibrio có
thể đóng vai trò là tác nhân gây bệnh chính hoặc tác động như các tác nhân cơ
hội trong nhiễm trùng thứ phát (Saulnier et al., 2000) Trong đó, vi khuẩn
Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính và Vibrio harveyi
gây bệnh phát sáng trên tôm được đánh giá là tác nhân gây bệnh liên quan đến làm giảm tỷ lệ sống của tôm ở các trại giống và ao nuôi (Song & Lee, 1993).
2.2.1 Một số bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng2.2.1.1 Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính
Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) xuất hiện đầu tiên ở Trung Quốc vào năm 2009, sau đó bệnh xuất hiện ở Việt Nam vào năm 2010; Malaysia vào năm 2011; Thái Lan năm 2012
(Flegel, 2012; Lightner et al., 2012); Mexico năm 2013 (Nunan et al., 2014),năm 2015 ở Philippin (de la Peña et al., 2015; Dabu et al., 2017); năm 2016 ở
Úc, Nam Mỹ; năm 2017 ở Myanmar; năm 2019 ở Bangladesh, Mỹ (Hình
Trang 372.10) (Kumar
Trang 38et al., 2021) Đầu tiên, bệnh được báo cáo với tên gọi là hội chứng chết sớm
(Early Mortality Syndrome - EMS), do bệnh có khả năng gây chết hàng loạt ấu trùng tôm trong vài ngày Sau đó, bệnh được đề xuất với tên mới là hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính (Acute Hepatopancreas Necrosis Syndrome -AHPNS), tên gọi nhằm mô tả chi tiết hơn cho giai đoạn biểu hiện cấp tính của bệnh, ở Đông Nam Á bệnh hoại tử gan tụy cấp tính đã gây thiệt hại đáng kể ở
các trang trại nuôi tôm (Tran et al., 2013a).
Hình 2.10: Bản đồ các quốc gia xuất hiện bệnh hoại tử gan tụy cấptính (Kumar et al., 2021)
Khả năng gây thiệt hại về kinh tế do AHPND là rất lớn, cụ thể là khi dịch bệnh mới xuất hiện lần đầu tiên ở Trung Quốc đã làm giảm 80% sản lượng tôm nuôi; ở Việt Nam dịch bệnh cũng làm tổn thất kinh tế ước tính là
570.000-7.200.000 USD được ghi nhận vào khoảng 2011 và 2012, do sản lượng giảm từ 70.000 tấn trong năm 2010 xuống 40.000 (2011) và 30.000 tấn (2012) Trong suốt năm 2012; ở Thái Lan tổng sản lượng tôm bị mất do dịch bệnh khoảng
7%, đặc biệt tập trung nhiều ở các khu vực ven biển (Lightner et al., 2013).
Năm 2013, bệnh này đã được báo cáo xuất hiện ở các nước phía tây bán cầu và Mexico, làm thiệt hại khoảng 118 triệu USD, việc lây lan mầm bệnh sang khu vực tây bán cầu đã trở thành một mối quan tâm lớn cho các nhà sản xuất
tôm trong khu vực (Schryver et al., 2014).
Tác nhân gây bệnh
Năm 2013, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm nuôi được xác định là do
vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, vi khuẩn này mang plasmid mã hóa gengây độc (Tran et al., 2013a; b; Kondo et al., 2015) Plasmid có kích thước
Trang 39thuộc loài
Trang 40Photorhabdus, gen mã hóa độc tố (Photorhabdus insect-related - Pir) này có
khả năng tiêu diệt côn trùng, có tên là PirA và PirB (Hình 2.11) (Yang et al.,2014; Kondo et al., 2014; Han et al., 2015a; Lee et al., 2015) Plasmid hiệndiện trong vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh AHPND đã được xác địnhlà pVA1 (Lee et al., 2015; OIE, 2021).
Hình 2.11: Trình tự đầy đủ của plasmid pVA1 gây bệnh AHPND trên tôm
(Lee et al., 2015)
Dấu hiệu bệnh lý
Tôm nuôi nhiễm AHPND có các dấu hiệu lâm sàng bao gồm (i) tôm ngừng ăn, bơi chậm; (ii) vỏ mỏng, màu tôm nhợt nhạt, ruột không liên tục hay rỗng;
(iii) gan tụy có biểu hiện trắng nhợt nhạt, teo, dai (Hình 2.12) (NACA, 2012; NACA, 2014).