Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)
GIỚI THIỆU
Tính cấp thiết của luận án
Ở Việt Nam, theo qui hoạch và định hướng phát triển ngành nuôi tôm nước lợ mặn vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) đến 2020 và tầm nhìn
2030 của Bộ Nng nghiệp và Phát triển Nông thôn, tổng diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng theo mô hình nuôi thâm canh đạt 90.000 ha (năm 2020) và tăng lên
100.000 ha (năm 2030), tăng trưởng bình quân 1,06%/năm, qui hoạch nuôi tập trung ở Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Kiên Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Tiền Giang, Long An Đến năm 2030, tổng sản lượng nuôi tôm nước lợ các tỉnh ven biển vùng ĐBSCL là 900.000 tấn, trong đó sản lượng tôm thẻ chân trắng đạt 450.000 tấn (chiếm 50%) Định hướng phát triển theo hướng hiệu quả, bền vững đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm, đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ trong nước và chế biến xuất khẩu.
Tuy nhiên, việc thâm canh hóa nâng cao năng suất kết hợp với vấn đề thời tiết thay đổi thất thường, đã làm gia tăng tình hình dịch bệnh ở hầu hết các mô hình nuôi tôm thương phẩm Vi khuẩn gây bệnh trên tôm nuôi được xác định chủ yếu là do các loài Vibrio spp Ở trại sản xuất tôm giống, Vibrio harveyi là mầm bệnh vi khuẩn thường gặp, gây bệnh phát sáng trên ấu trùng, hậu ấu trùng tôm Bệnh phát sáng được ghi nhận gây thiệt hại về kinh tế cho nghề nuôi tôm của nhiều nước trên thế giới như Indonesia (Sunaryanto & Mariam, 1986), Thái Lan (Jiravanichpaisal et al., 1994), Philippines (Baticados et al., 1990; Lavilla- Pitogo et al., 1990), Australia (Pizzutto & Hirst, 1995), Đài Loan (Liu et al., 1996 a; b) và Ecuador (Robertson et al.,
1998) Trong ao nuôi thương phẩm, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Acute hepatopancreatic necrosis disease - AHPND) được ghi nhận là một trong các bệnh phổ biến trên tôm nuôi vùng ĐBSCL Từ đầu năm 2022 đến nay, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính xảy ra tại 75 xã của 11 tỉnh, thành phố với tổng diện tích trên 342 ha, tăng 7% (Tổng cục Thủy sản, 2022).
AHPND được xác định do Vibrio parahaemolyticus chứa plasmid mang gen độc tố (Photorhabdus insect-related, PirA, PirB) (Tran et al., 2013a; b; Kondo et al., 2014; Han et al., 2015a), gây chết đến 100% đàn tôm Bệnh xuất hiện trên tôm ở giai đoạn 30 đến 35 ngày nuôi (FAO, 2013; Hong et al., 2016; NACA, 2012), và ở giai đoạn tụm 46 đến 96 ngày nuụi (De la Peủa et al.,
2015) Ngoài ra, các loài vi khuẩn Vibrio spp (Vibrio harveyi, V campbellii,
V punensis và V owensii) chứa plasmid mang gen độc tố cũng có khả năng gây AHPND (Kondo et al., 2015; Dong et al., 2017; Liu et al., 2018; Restrepo et al., 2018; Xiaosha et al., 2020) Xiao et al (2017) cho rằng plasmid mang gen độc tố PirA, PirB gây bệnh AHPND trên tôm phổ biến ở nhiều loài Vibrio.
Các gen độc tố có thể được truyền từ loài vi khuẩn Vibrio này sang loài vi khuẩn Vibrio khác (Kondo et al., 2015) Do đó, khả năng kiểm soát bệnh hoại tử gan tụy cấp tính hay bệnh do vi khuẩn nói chung cũng gặp nhiều khó khăn.
Sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh do vi khuẩn là giải pháp thường được người nuôi tôm áp dụng, tuy có tác động tích cực nhưng vẫn không được khuyến cáo sử dụng vì các tác động xấu đến môi trường Việc sử dụng nhiều kháng sinh đã dẫn đến sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc (Miranda & Zemelman, 2002; Seyfried et al., 2010), kháng sinh tồn lưu trong sản phẩm thủy sản, dẫn đến những hậu quả tiềm ẩn đối với sức khỏe con người (Romero Ormazábal et al., 2012) Việc sử dụng nhiều chất kháng sinh, thuốc tổng hợp đã cho thấy các hiện tượng mẫn cảm và tác dụng phụ không mong muốn (Atal, 1982), như ảnh hưởng đến sự phát triển và ức chế cơ chế tự bảo vệ của ấu trùng (Brown, 1989) Vaccin cũng được coi là một liệu pháp tiềm năng giúp phòng bệnh vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản Tuy nhiên, vaccin thương mại quá đắt để sử dụng rộng rãi bởi một loại vaccine đơn chỉ có hiệu quả chống lại một loại mầm bệnh (Sakai, 1999; Pasnik et al., 2005; Harikrishnan et al., 2011b).
Trong nhóm các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên, chất chiết thảo dược là những chiết xuất từ thực vật có chứa các hợp chất sinh học giúp phòng và trị bệnh ở đối tượng sử dụng (Prasad & Variyur Padhyoy, 1993) Nhiều loại thảo dược được xác định có chứa nhiều hợp chất hoạt tính sinh học cao giúp kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm, ký sinh trùng, kích thích tăng trưởng, kích thích sự thành thục, chống stress, tăng cường miễn dịch (Direkbusarakom et al., 2004; Chitmanat et al., 2005; Citarasu, 2010; Chakraborty & Hancz, 2011;
Harikrishnan et al., 2011a; b; c; Ji et al., 2012; Reverter et al., 2014; 2017;
2021) Đặc biệt, nhiều loài thảo dược được xác định có hoạt tính kháng khuẩn cao, có phổ kháng khuẩn rộng, diệt được cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm (Castro et al., 2008; Roomiani et al., 2013) Bên cạnh đó, thảo dược với nhiều ưu điểm như rẻ, dễ chuẩn bị, hiệu quả phòng bệnh cao do dễ hấp thu, ít tác dụng phụ trong quá trình điều trị bệnh và không ảnh hưởng đến môi trường cũng như không nguy hiểm đến đối tượng nuôi (Hai, 2015).
Trong thời gian gần đây, các công trình nghiên cứu sử dụng chất chiết thảo dược giúp tăng khả năng kháng vi khuẩn Vibrio và tăng cường đáp ứng miễn dịch tôm đã tăng lên đáng kể (Ghosh et al., 2021) Ví dụ, Gracilaria spp.(họ Gracilariaceae) và Sargassum spp (họ Sargassaceae) đã được sử dụng hầu hết cho các thí nghiệm in-vitro và in-vivo để xác định hiệu quả phòng bệnh trên tôm Một số loài thực vật khác như Eucalyptus camaldulensis, Psidium guajava,
Rhodomyrtus tomentosa và Syzygium cumini (họ Myrtaceae) đã được xác định hiệu quả giúp tôm kháng Vibrio gây bệnh (Reverter et al., 2017; Ghosh et al.,
2021) Do vậy, việc sàng lọc các loài thảo dược sẵn có giúp tăng cường hệ miễn dịch tôm, tăng sức đề kháng mầm bệnh nhằm tìm ra giải pháp phòng bệnh an toàn sinh học sẽ mang lại hiệu quả thiết thực cho người nuôi tôm vùng ĐBSCL Từ những cơ sở nêu trên, đề tài nghiên cứu “Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên miễn dịch và khả năng kháng khuẩn trên tôm thẻ chân trắng ( Penaeus vannamei )” được thực hiện.
Mục tiêu nghiên cứu của luận án
Nghiên cứu được thực hiện nhằm: (i) Đánh giá tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược trong nuôi tôm biển ở một số hộ nuôi tôm thuộc các tỉnh thuộc vùng ĐBSCL; (ii) Chọn lọc được một số loài thảo dược phổ biến ở ĐBSCL có hoạt tính kháng khuẩn trong điều kiện in-vitro, cũng như khả năng tăng cường miễn dịch và giúp tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) kháng vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trong điều kiện in-vivo; (iii) Xác định một số hợp chất tự nhiên trong chất chiết thảo dược có hiệu quả trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính Trên cơ sở đó, kết quả nghiên cứu góp phần đóng góp các thông tin khoa học làm cơ sở đề xuất giải pháp ứng dụng sản phẩm thảo dược trong phòng bệnh do vi khuẩn gây ra, đặc biệt là nhóm vi khuẩn Vibrio, điều này góp phần đề xuất các giải pháp quản lý dịch bệnh tổng hợp và phát triển nghề nuôi tôm biển bền vững.
Nội dung nghiên cứu của luận án
Nhằm đạt được mục tiêu đề ra, luận án được thực hiện bao gồm 4 nội dung chính (Hình 1.1):
Khảo sát tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược trong quá trình nuôi tôm biển ở tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng thuộc vùng ĐBSCL.
Sàng lọc một số loài thảo dược có khả năng kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, Vibrio harveyi gây bệnh trên tôm.
Xác định khả năng tăng cường miễn dịch tôm của một số chất chiết thảo dược.
Thử nghiệm sử dụng chất chiết thảo dược trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ chân trắng.
Xác định loại chất chiết thảo dược lên tăng trưởng, đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng khuẩn V parahaemolyticus trên tôm thẻ chân trắng
V parahaemolyticus và V harveyi phân lập trực tiếp từ ao nuôi
Hình 1.1: Sơ đồ các nội dung nghiên cứu tổng quát của luận án
1) Khảo sát tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược trong quá trình nuôi tôm biển
- Chọn thảo dược được sử dụng nhiều, thảo dược tiềm năng
V parahaemolyticus Định danh bằng kỹ thuật PCR
Xác định nhịp bổ sung chất chiết thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng khuẩn V. parahaemolyticus trên tôm thẻ chân trắng
4) Thử nghiệm sử dụng chất chiết thảo dược trong phòng bệnh AHPND trên tôm
3) Xác định khả năng tăng cường miễn dịch tôm 2) Sàng lọc một số loại thảo dược có khả năng kháng vi khuẩn V parahaemolyticus, V harveyi gây bệnh trên tôm
Tôm bệnh ngoài ao nuôi
Phân tích thành phần một số hợp chất hóa học cơ bản trong môt số chất chiết thảo dược có hiệu quả trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm.
Những đóng góp mới của luận án
Luận án có những đóng góp về mặt nghiên cứu khoa học và khả năng ứng dụng của thảo dược đối với ngành nuôi trồng thủy sản ở một số nội dung:
Khảo sát cho thấy tỷ lệ hộ nuôi sử dụng thảo dược trong nuôi tôm là rất cao, mô hình sử dụng là thâm canh và siêu thâm canh, đối tượng áp dụng cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng.
Xác định được 18 loài thực vật đang được sử dụng trong nuôi tôm, trong đó tỏi là loài được sử dụng phổ biến nhất, tiếp theo là cây diệp hạ châu (Phyllanthus spp.), ổi (Psidium guajava), mật gấu (Vernonia amygdalina), thù lù (Physalis angulata) Các loài thảo dược tiềm năng tập trung ở bộ sơ ri (diệp hạ châu, mần ri), bộ cà (thù lù), bộ cúc (mật gấu, cỏ mực), bộ đào kim nương (ổi), bộ húng (ô rô).
Xác định được 6 loài thảo dược thu thập ở vùng ĐBSCL có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với V parahaemolyticus (CM5) và V harveyi (T2016-
04) bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch, bao gồm chất chiết bằng methanol của bàng (Terminalia catappa), lựu (Punica granatum), diệp hạ châu thân đỏ (P urinaria L.), diệp hạ châu thân xanh (Phyllanthus amarus Schumach & Thonn), bần ổi (Sonneratia ovata), bần chua (S caseolaris) Tất cả 6 chất chiết thảo dược này đều có tính kìm khuẩn Ngoài ra, các chất chiết này đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với các chủng V. parahaemolyticus và V harveyi phân lập từ ao nuôi tôm.
Xác định được liều lượng và thời gian bổ sung chất chiết xuất từ lá bàng (T catappa) và chất chiết xuất từ quả bần chua (S caseolaris) (1% và nhịp bổ sung 2 tuần) giúp tôm thẻ chân trắng (P vannamei) tăng cường đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu và khả năng kháng V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính Đồng thời với liều lượng và thời gian bổ sung các chất chiết này không ảnh hưởng đến tăng trưởng, tỷ lệ sống và hệ số chuyển đổi thức ăn của tôm thẻ chân trắng. Đây cũng là kết quả đầu tiên xác định được chất chiết quả bần chua có hiệu quả trong tăng cường các thông số miễn dịch và khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm nuôi thương phẩm Kết quả nghiên cứu xác định được tiềm năng của chất chiết bàng và bần chua có thể ứng dụng trong phòng bệnh cho tôm nuôi.
Ý nghĩa thực tiễn của luận án
Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chất chiết thảo dược trên vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (V parahaemolyticus) và vi khuẩn gây bệnh phát sáng (V harveyi) là cơ sở khoa học và tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm xác định giải pháp phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính và bệnh phát sáng hiệu quả và an toàn.
Kết quả đạt được của nghiên cứu cung cấp thông tin, số liệu về tiềm năng sử dụng thảo dược trong nuôi trồng thủy sản Cụ thể, thông tin khảo sát giúp xác định rõ thực trạng và nhu cầu sử dụng thảo dược của người nuôi tôm; chọn lọc được một số loài thảo dược có khả năng kháng khuẩn, tăng cường miễn dịch kháng vi khuẩn gây bệnh và không ảnh hưởng đến tăng trưởng của tôm nuôi; xác định loài thảo dược có khả năng ứng dụng vào quá trình nuôi tôm thẻ chân trắng thương phẩm.
Từ đó, kết quả nghiên cứu đóng góp thông tin khoa học: (i) cho định hướng ứng dụng thảo dược vào quy trình nuôi tôm; nhằm hạn chế việc sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi thủy sản; (ii) giúp cho các nhà khoa học và cơ quan quản lý thuốc kháng sinh có giải pháp ngăn chặn và kiểm soát vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh nhằm hướng đến việc sản xuất tôm an toàn và bền vững.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm
Thời gian: Các thí nghiệm của luận án được thực hiện trong thời gian từ tháng 10/2017 đến tháng 8/2021. Địa điểm nghiên cứu: (i) Nội dung khảo sát tình hình sử dụng thảo dược của hộ nuôi tôm được thực hiện ở tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng (ii) Phân tích hoạt tính kháng khuẩn của thảo dược và thí nghiệm sử dụng thảo dược trên tôm thẻ chân trắng được thực hiện ở Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ (iii) Thu thập nguồn vi khuẩn từ hộ nuôi tôm thuộc tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu và Tiền Giang, phục vụ cho thử nghiệm ứng dụng chất chiết thảo dược có hoạt tính kháng khuẩn cao (nhạy).
Nguồn thảo dược được thu hái từ các tỉnh ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, bao gồm 15 loài (Phụ lục 3) trong đó có: (i) 5 loài chọn từ kết quả khảo sát, có tỉ lệ hộ nuôi sử dụng nhiều; và (ii) chọn thêm 10 loài có tiềm năng (từ nội dung khảo sát và từ các công trình nghiên cứu được công bố, cũng như mức độ phổ biến của thảo dược đó ở vùng ĐBSCL).
Chủng vi khuẩn V parahaemolyticus (CM5), V harveyi (T2016-04) sử dụng cho nội dung xác định hoạt tính kháng khuẩn và cho thí nghiệm cảm nhiễm, thuộc bộ sưu tập của bộ môn Bệnh học thủy sản, khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ Ngoài ra, một số chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus, V harveyi được phân lập từ mẫu tôm, nước thu trực tiếp từ ao nuôi, dùng cho thử nghiệm ứng dụng chất chiết thảo dược kháng vi khuẩn.
Tôm thẻ chân trắng (1-2 g) dùng để thực hiện các thí nghiệm tôm ăn thức ăn bổ sung chất chiết thảo dược ở nội dung 3 và 4 của luận án Nguồn tôm thẻ chân trắng được tiếp nhận từ trại nuôi tôm thuộc bộ môn Kỹ thuật nuôi Hải sản, khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ và tôm đã được xác định âm tính với bệnh do WSSV, V parahaemolyticus, V harveyi bằng kỹ thuật PCR. án:
3.1.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
Các dụng cụ và thiết bị chính được sử dụng trong quá trình thực hiện luận
Dùng cho ly trích thảo dược, hoạt tính kháng khuẩn, phân lập định danh vi khuẩn: tủ sấy (Memmert, Đức), máy nghiền (Việt Nam), hệ thống máy cô quay chân không RV 10 Digital V-C (IKA, Đức), tủ cấy vi sinh Telstar Bio II
Advance EN 12469 (Telstar, Úc), nồi tiệt trùng Hirayama HVA-110 (Hirayama, Nhật Bản), tủ ủ vi sinh vật Memmert IN30 (Memmert, Đức), máy quang phổ kế S-220 Spectrophothometer (Boeco, Đức), máy ly tâm (Hettich, Đức), máy lắc Shaker SK-300 (Lab Companion, Mỹ).
Dùng cho phân tích miễn dịch: máy đọc đĩa ELISA (Thermo Scientific, Mỹ), máy ly tâm Hettich EBA 21 (Hettich, Đức), máy ly tâm lạnh Hettich Mikro 220 (Hettich, Đức), kính hiển vi quang học (Novex, Hà Lan), bộ micropipet (eppendorf, Đức), máy ủ nhiệt khô Dry-Block ® DB-2D (Techne, Anh), máy so màu quang phổ (Thermo Scientific, Mỹ), máy PCR (Applied Biosystems, Mỹ), bộ điện di PowerPac™ HC (Bio Rad, Mỹ), hệ thống chụp ảnh gel Gel Doc XR + system (Bio Rad, Mỹ), máy Realtime-PCR (Lightcycler, Roche), máy đo hàm lượng RNA Nanodrop ND2000 (Thermo Scientific, Mỹ) và các dụng cụ khác.
Dùng cho bố trí nuôi dưỡng tôm và cảm nhiễm: hệ thống bể composite, hệ thống sục khí, xô, vợt, bể kính, và một số dụng cụ khác.
3.1.4 Môi trường và hóa chất thí nghiệm
Một số hóa chất chính được sử dụng cho các thí nghiệm của luận án:
Môi trường và hóa chất phục hồi, nuôi cấy, phân lập vi khuẩn: Nutrient agar (NA, Merck, Đức), nutrient broth (NB, Merck, Đức), Mueller- Hinton agar (MHA, Merck, Đức), Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar (TCBS Agar, Himedia, Ấn Độ), Chromagar Vibrio (CHROMagar Microbiology, Pháp), sodium chloride (NaCl, XiLong, Trung Quốc), glycerol (Merck, Đức),
Hóa chất dùng để ly trích thảo dược và pha loãng thảo dược: methanol (CH3OH, Chemsol, Việt Nam), Dimethyl sulfoxide (DMSO, Merck, Đức).
Khỏng sinh: Doxycycline (DOX 30 àg, Abtex, UK), dựng làm đối chứng dương trong khảo sát hoạt tính kháng khuẩn.
Hóa chất dùng trong phân tích các chỉ tiêu miễn dịch: Giemsa (Merck, Đức), aceton (XiLong, Trung Quốc), xylen (XiLong, Trung Quốc), sodium cacodylate (Sigma, Mỹ), trisodium citrate (Sigma, Mỹ), trypsin (Sigma, Mỹ), L-DOPA (Sigma, Mỹ), glucose (Merck, Đức), canxi clorua (CaCl2, XiLong, Trung Quốc), magie clorua (MgCl2, XiLong, Trung Quốc), formalin (Merck, Đức), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, Sigma, Mỹ).
Hóa chất dùng trong phân tích PCR và Realtime-PCR: tris(hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride (tris-HCl, Marck, Đức),ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, Merck, Đức), RNAzol ® RT
(Molecular research, Mỹ), ethanol (Merck, Đức), nước cất 2 lần không chứaDNA/RNA ultraPURE (Invitrogen corporation, UK), PCR buffer (Promega, Mỹ), MgCl2
(Promega, Mỹ), dNTPs (Promega, Mỹ), Taq DNA polymerase (Promega,Mỹ), agarose (Invitrogen, Mỹ), tris acetate-EDTA buffer (TAE (10X), Sigma,Mỹ), ethidium bromide (Promega, Mỹ), thang DNA (Promega, Mỹ),SensiFAST cDNA Synthsis Kit (Bioline, UK), Taqman (AB appliedBiosystems, Mỹ) Cặp mồi AP4F1/R1, cặp mồi AP4F2/R2, cặp mồi F6/R4,mồi lysozyme (LSZ), penaeidin-3a (PEN), crustin, beta-actin (IDT)
Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Xác định tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược trong nuôi tôm ở một số địa phương thuộc vùng ĐBSCL
3.2.1.1 Địa điểm và số lượng hộ nuôi tôm
Thông tin tình hình sử dụng thảo dược trong nuôi tôm biển vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) được khảo sát năm 2018, đối tượng được khảo sát là người nuôi tôm (hộ), với tổng số hộ khảo sát là 90 hộ thuộc 2 tỉnh
Cà Mau và Sóc Trăng thuộc vùng ĐBSCL Chọn mẫu ngẫu nhiên theo mẫu chùm sẽ được tiến hành bằng việc chọn 2 tỉnh ở giai đoạn 1 và tiếp tục giai đoạn 2 sẽ chọn các huyện đại diện cho tỉnh bằng kỹ thuật chọn mẫu ngẫu nhiên hệ thống Cụ thể, khu vực Cà Mau gồm có huyện Đầm Dơi, Cái nước, Phú Tân với 15 hộ trên một huyện; tương tự ở Sóc Trăng gồm các huyện Mỹ Xuyên, Vĩnh Châu, Trần Đề (Hình 3.1).
Hình 3.1: Địa điểm thực hiện phỏng vấn hộ nuôi tôm ở Cà Mau và
Các khu vực thu mẫu được lựa chọn dựa trên các tiêu chí: diện tích nuôi,năng suất, kỹ thuật nuôi cũng như tiềm năng cơ cấu về quy hoạch phát triển ngành nuôi trồng thủy sản của tỉnh Trong quá trình khảo sát sơ bộ ghi nhận các hộ nuôi quảng canh, quảng canh cải tiến không có sử dụng thảo dược trong quá trình nuôi Do đó, những hộ phỏng vấn được chọn hoàn toàn ngẫu nhiên trong nhóm các hộ nuôi tôm với mật độ cao và có bổ sung thức ăn cho tôm nuôi Cụ thể thông tin được trình bày Bảng 3.1 và Phụ lục 2.
Bảng 3.1: Thông tin tổng quát của các hộ phỏng vấn về tình hình sử dụng thảo dược trong nuôi tôm Đối tượng nuôi Mô hình (n: số lượng hộ) Địa điểm
Tôm sú Thâm canh (5) Đầm Dơi,
Tôm thẻ chân trắng Thâm canh (18), siêu thâm canh (22) 45
Tôm sú Bán thâm canh (2), thâm canh (13) Mỹ Xuyên,
Tôm thẻ chân trắng Thâm canh (30) 45
3.2.1.2 Phương pháp phỏng vấn hộ nuôi tôm
Phỏng vấn người nuôi tôm được thực hiện bằng cách sử dụng phiếu câu hỏi (phiếu khảo sát), nội dung phiếu khảo sát được thiết kế dựa trên mục tiêu của nghiên cứu là đánh giá tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược trong nuôi tôm ở một số tỉnh vùng ĐBSCL Cụ thể, cấu trúc phiếu khảo sát bao gồm các thông tin về: (i) đặc điểm hộ nuôi, (ii) tình hình sử dụng thảo dược và (iii) tiềm năng thảo dược (Phụ lục 1).
3.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi khuẩn và nồng độ ức chế tối thiểu, nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của chất chiết thảo dược
3.2.2.1 Phương pháp ly trích thảo dược a) Chuẩn bị thảo dược: các loài thực vật sau khi thu về, được rửa sạch, để ráo, sấy khô ở 60 o C (Memmert UN110, Đức), ở nhiệt độ này có thể loại bỏ các enzyme (men) có trong thực vật Sau đó được nghiền thành bột, thao tác này làm phá vỡ tế bào thực vật giúp dung môi dễ thấm vào thảo dược Để đảm bảo các bột thảo dược này khô hoàn toàn và có tính ổn định giữa các lần ly trích thì bột cao chiết tiếp tục sấy cho đến khi khối lượng không đổi (Phụng, 2007). b) Ly trích thảo dược: Sử dụng kỹ thuật ngâm dầm để chiết tách các hợp chất có trong thực vật, cụ thể bột thảo dược được ngâm với methanol (Chesol, Việt Nam) theo tỉ lệ 1:10 trong 3 ngày, sau đó loại bỏ phần bã cây ra khỏi dung dịch chiết bằng giấy lọc Whatman No.1 (Whatman, Anh) Methanol được thu hồi bằng máy cô quay chân không ở 40 o C, chất còn lại sau cô quay là cao thô (cao tổng) Dung môi cần được loại bỏ hoàn toàn bằng cách sấy (40 o C) cho đến khi khối lượng cao không đổi (Phụng, 2007).
3.2.2.2 Phương pháp phục hồi, nuôi và định danh vi khuẩn a) Phục hồi và nuôi vi khuẩn
Vi khuẩn V parahaemolyticus (CM5) và V harveyi (T2016-04) được trữ trong 20% glycerol ở -20 o C được phục hồi trên đĩa môi trường NA bổ sung
1,5% NaCl (NA + ), ủ ở 28 o C trong 24 giờ, chọn khuẩn lạc đơn điển hình nằm trên đường cấy để sử dụng Dùng que cấy tiệt trùng chọn khuẩn lạc đơn điển hình vào ống nghiệm có chứa môi trường NB bổ sung 1,5% NaCl (NB + ) đã tiệt trùng, sau đó ủ ở 28 o C trong 24 giờ trên máy nuôi lắc. b) Phương pháp ly trích DNA từ vi khuẩn
Vi khuẩn (2-3 khuẩn lạc) được cho vào ống eppendorf cú chứa 500 àL
TE buffer (10mM Tris-HCl, pH 8,0; 1mM EDTA), ủ 10 phút ở 100°C, ly tâm
10.000 vòng/phút trong 5 phút (Pang et al., 2006) Sau đó, phần dịch nổi được chuyển sang ống eppendorf mới và điều chỉnh nồng độ DNA của vi khuẩn xuống 200 ng/àL, trữ ở -20°C và để dựng cho thực hiện phản ứng PCR.
Nồng độ DNA được xác định bằng máy so màu quang phổ sử dụng bước súng 260 nm và 280 nm Cỏc bước thực hiện bao gồm: chuẩn bị 500 àL nước cất để tạo mẫu trắng (blank) và 500 àl DNA mẫu (pha loóng DNA ly trớch được 100 lần) để đo nồng độ Sau đó, mẫu được đo và đọc kết quả Nồng độ DNA được tính theo công thức:
[DNA] (àg/mL) = Giỏ trị đo ở 260 nm x 50 x độ pha loóng c) Quy trình Nested-PCR phát hiện V parahaemolyticus
Phương pháp thực hiện: DNA chiết tách và được pha loãng về nồng độ
200 ng/àL sẽ sử dụng làm khuụn cho phản ứng khuếch đại gen đặc hiệu phỏt hiện vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính với trình tự mồi AP4-F1: 5’-ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC-3’, AP4-R1:
GTTAGTCATGTGAGCACCTTC-3’ (Dangtip et al., 2015) Thành phần hóa chất tham gia phản ứng bước 1: 1X PCR buffer (5X), 3 mM MgCl2 (25 mM),
200 μg/mL, MBC là 125M dNTPs (10 mM), 5 mM mồi AP4-F1 (10 mM); 5 mM mồi AP4-R1 (10 mM), 1,5U Taq DNA polymerase (5U); 2 μg/mL, MBC là 125L DNA (200 ng/μg/mL, MBC là 125L) và tổng thể tích cho phản ứng là 25 μg/mL, MBC là 125L Điều kiện phản ứng bước 1: 94ºC trong 2 phút, tiếp theo 94ºC trong 30 giây, 55ºC trong 30 giây, 72ºC trong 1 phút 30 giây với 30 chu kỳ, cuối cùng 72ºC trong 2 phút Thành phần hóa chất tham gia phản ứng bước 2: 1X PCR buffer (5X), 3 mM MgCl 2 (25 mM), 200 μg/mL, MBC là 125M dNTPs (10 mM), 3,75 mM mồi AP4-F2 (10 mM); 3,75 mM mồi AP4-R2 (10 mM); 1,5U Taq DNA polymerase (5U); 2 μg/mL, MBC là 125L sản phẩm PCR bước 1 và tổng thể tích cho phản ứng là
25 μg/mL, MBC là 125L Điều kiện phản ứng bước 2: 94ºC trong 2 phút, tiếp theo 94ºC trong 20 giây, 55ºC trong 20 giây, 72ºC trong 20 giây với 25 chu kỳ, cuối cùng 72ºC trong 2 phút (Dangtip et al., 2015).
Phương pháp điện di: Phân tách các đoạn DNA sau khuếch đại trên bản thạch 1,5% với dung dịch đệm TAE 0,5X Cụ thể: (i) Chuẩn bị bản thạch (agarose gel): Đun nóng dung dịch agarose bằng lò vi sóng cho tới khi agarose tan hoàn toàn Sau đó, dung dịch được để nguội khoảng 50-60 o C, thêm EtBr (ethidium bromide) vào và đổ vào khuôn gel Thể tích gel tùy thuộc vào kích cỡ của khuôn gel, (ii) Thực hiện điện di: Cho bản thạch vào bồn điện di, thêm dung dịch điện di cho vừa bao phủ bản thạch Thể tớch 10 àL mẫu cần phõn tích, đối chứng âm, đối chứng dương và thang DNA được cho vào từng giếng.
Sử dụng dòng điện 90V để chạy gel với thời gian 50-60 phút Qui trình kết thúc khi sản phẩm khuếch đại di chuyển khoảng 2/3 gel.
Phương pháp đọc kết quả: Kết quả điện di được ghi nhận bằng máy đọc gel, căn cứ vào thang DNA 100 bp để xác định trọng lượng phân tử Mẫu có vạch 1.269 bp (sản phẩm PCR bước 1) và 230 bp (sản phẩm PCR bước 2) là mẫu nhiễm V parahaemolyticus Mẫu đối chứng âm không có vạch sản phẩm. d) Qui trình PCR phát hiện V harveyi
Phương pháp thực hiện: DNA chiết tách và pha loãng về nồng độ 200 ng/àL sử dụng làm khuụn cho phản ứng khuếch đại gen đặc hiệu phỏt hiện vi khuẩn V harveyi với trình tự mồi F6: 5’-TGGATGTAAA TGAGTTTGG-3’, R4: 5’-CGTTACGATTATTTGATAG-3’ (Sun et al., 2009) Thành phần hóa chất tham gia phản ứng bao gồm: PCR buffer 1X (5X), 1,5 mM MgCl2
Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được nhập bằng phần mềm Microsoft Excel 2013 Sử dụng phần mềm SPSS 20.0 cho: (i) Thực hiện các phép thống kê trung bình và thống kê tần số đối với những biến định tính nhằm mô tả tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược của các hộ nuôi; (ii) Chọn phương pháp phân tích phương sai
1 nhân tố (One-Way ANOVA) sử dụng kiểm định Duncan với độ tin cậy 95% để so sánh sự khác biệt giữa các trung bình của các nghiệm thức; (iii) Sử dụng kiểm định t (Independent-Samples t test) với độ tin cậy 95% để so sánh sự khác biệt giữa trung bình của hai nhịp thu mẫu trên cùng nghiệm thức.