Thông tin tài liệu
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ Nghiên cứu độc tố cassiicolin nấm Corynespora cassiicola khả phòng trừ sinh học bệnh rụng Corynespora (CLF) cao su vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens MÃ SỐ: E2019.05.1 Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Ngọc Bảo Châu Tp.Hồ Chí Minh, 12/2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ Nghiên cứu độc tố cassiicolin nấm Corynespora cassiicola khả phòng trừ sinh học bệnh rụng Corynespora (CLF) cao su vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens MÃ SỐ: E2019.05.1 Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Ngọc Bảo Châu Tp.Hồ Chí Minh, 12/2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ Độc lập - Tự - Hạnh phúc THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Số: /ĐHM- HTQLKH Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thông tin chung: - Tên đề tài: Nghiên cứu độc tố cassiicolin nấm Corynespora cassiicola khả phòng trừ sinh học bệnh rụng Corynespora (CLF) cao su vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens - Mã số: E2019.05.1 - Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Ngọc Bảo Châu - Đơn vị công tác: Khoa Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh - Thời gian thực hiện: 24 tháng Mục tiêu: Nghiên cứu tương tác mức độ phân tử tế bào vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens nấm gây bệnh rụng cao su Corynespora cassiicola Tính sáng tạo: Vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens phân lập từ cao su Hevea brasiliensis cho thấy có hoạt tính kháng nấm Corynespora Tuy nhiên, khơng có nhiều nghiên cứu mơ tả vai trị đối kháng B amyloliquefaciens việc kiểm sốt bệnh rụng cao su Hơn việc xác định gen mã hoá độc tố cassiicolin biểu gen trình xâm nhiễm đưa nhìn rõ độc lực nấm C.cassiicola gây Kết nghiên cứu: Nội dung Phân lập xác định nhóm độc tố cassiicolin diện mẫu nấm Corynespora cassiicola phân lập vùng trồng cao su Việt Nam Kết nghiên cứu chứng minh có diện gen cas thuộc nhóm cas2 hai chủng nấm CoryQN01 CoryDC01/20 chủng nấm sử dụng nghiên cứu phương pháp PCR Từ kết xây dựng phát sinh loài dựa vào trình tự đồng phân gen cas, hai chủng phân lập CoryQN01 CoryDC01 mang gen cas mã hóa cho protein độc tố cassiicolin thuộc nhóm đồng phân gen cas2 18 chủng phân lập cịn lại khơng phát gen cas xếp vào nhóm cas0 (không phát gen cas) Nội dung 2: Đánh giá khả gây bệnh in-planta mẫu nấm phân lập mang nhóm độc tố chuyên biệt dịng vơ tính cao su Hai chủng nấm thử nghiệm CoryQN01 CoryDC01 có khả gây bệnh cho dịng vơ tính cao su RRIV 209 IAN 873 Dịng vơ tính IAN 873 mẫn cảm với nấm gây bệnh C cassiicola so với dịng vơ tính RRIV 209 Dịng vơ tính cao su IAN 873 sử dụng cho thí nghiệm Kết phân tích hình ảnh vết bệnh phần mềm APS Assess 2.0 cho kết tương tự, tỉ lệ diện tích vết bệnh dịng vơ tính cao su IAN 873 lớn so với dịng vơ tính RRIV 209, khác biệt có ý nghĩa thống kê chủng phân lập CoryQN01 CoryDC01 Nội dung 3: Đánh giá khả đối kháng nấm Corynespora cassiicola vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens in vitro cao su tách rời Kết kháng nấm chủng vi khuẩn thử nghiệm hai chủng nấm C cassiicola CoryQN01 CoryDC01 cho thấy, đường kính vịng kháng nấm Bacillus amyloliquefaciens thử nghiệm chủng nấm CoryQN01 lớn so với chủng nấm CoryDC01 Kết xử lý T-Test cho thấy, khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,0001) Kết xử lý thống kê T-test mẫu đối chứng mẫu chủng bệnh có xử lý vi khuẩn kháng nấm cho thấy, kích thước vết bệnh tỉ lệ diện tích vết bệnh (%) khác biệt có ý nghĩa thống kê vào ngày thứ 3, 5, sau thử nghiệm Nội dung 4: Đánh giá khả biểu gen mã hoá độc tố cassiicolin mẫu nấm Corynespora cassiicola trước sau xử lý bệnh CFL vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens cao su tách rời mốc thời gian xâm nhiễm khác nấm C cassiisola đánh giá diện biểu gen mã hoá protein lipopeptide vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens trình đối kháng với nấm bệnh Kết đánh giá mức độ biểu gen cas phản ứng Real-time PCR cho thấy, mẫu đối chứng không xử lý vi khuẩn kháng nấm, gen cas bắt đầu biểu vào ngày thứ sau chủng bệnh, mức độ biểu tăng dần vào cao vào ngày thứ giảm dần vào ngày thứ sau chủng bệnh Sự khác biệt mức độ biểu gen cas mẫu đối chứng mẫu xử lý vi khuẩn kháng nấm Bacillus amyloliquefaciens ghi nhận Mức độ biểu gen cas có chiều hướng giảm rõ rệt tương tác với vi khuẩn kháng nấm Kết tương đồng với kết định tính biểu gen cas phản ứng RT-PCR Đến ngày thứ 5, vết bệnh hay vòng độc tố cassiicolin bắt đầu xuất lan rộng vào ngày thứ tương ứng với biểu mạnh gen cas mã hóa cho độc tố cassiicolin Đối với mẫu chủng bệnh có xử lý vi khuẩn kháng nấm, kết cho thấy, phát triển khuẩn ty bị kìm hãm đồng thời khơng thấy rõ diện vịng độc tố cassiicolin tương ứng với biểu gen cas2 mức thấp so với đối chứng Kết đánh giá diện biểu gen mã hoá protein lipopeptide vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens trình đối kháng với nấm bệnh cho thấy gen sfp, ituA, ituB fenB diện vi khuẩn B amyloliquefaciens Biểu gen ituB, fenB đạt mức độ cao sau xử lý vi khuẩn, điều chứng minh ituB, fenB đóng vai trị quan trọng q trình điều hịa sinh học bệnh rụng Corynespora cao su Sản phẩm: ❖ Sản phẩm khoa học: Bài báo khoa học quốc tế ISI (SCIE): ✓ SCIE, Q2: "Identification and virulence evaluation of Corynespora cassiicola cassiicolin-encoding gene isolates from rubber trees in Vietnam" Tropical Plant Pathology (Accepted) ❖ Sản phẩm đào tạo: Cử nhân: sinh viên tốt nghiệp; cao học: học viên tốt nghiệp ✓ Cử nhân: Phân lập tinh chế hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết chủng Bacillus amyloliquefaciens T3 nội sinh có khả kháng vi nấm Corynespora cassiicola gây bệnh rụng cao su (Hevea brasiliensis) Huỳnh Xuân Thương MSSV: 1653010309 (Khoa CNSH, Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh) ✓ Cao học: Đánh giá tính độc số mẫu phân lập nấm Corynespora cassiicola cao su tìm thị phân tử liên quan với độc tố cassiicolin Nguyễn Phương Vinh (Cao học ngành Bảo vệ thực vật, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM) Phương thức chuyển giao, địa ứng dụng, tác động lợi ích mang lại kết nghiên cứu: Đề tài có tham gia học viên cao học sinh viên đại học nên giúp đào tạo nguồn nhân lực góp phần cho việc phát triển Công nghệ sinh học cho TP HCM khu vực Nghiên cứu giúp hiểu kiểm soát sinh học vi khuẩn nấm gây bệnh nguồn tài liệu tham khảo cho học viên, NCS, giảng viên INFORMATION ON RESEARCH RESULTS General information: Project title: Study on the virulence of Corynespora cassiicola cassiicolinencoding gene and the biological control of Corynespora leaf fall disease (CLF) from rubber trees using Bacillus amyloliquefaciens Code number: E 2019.05.1 Coordinator: Nguyen Ngoc Bao Chau, PhD Affiliation: Faculty of Biotechnology, Ho Chi Minh City Open University Duration: from 2019 to 2021 Objective(s): The aim of this study is to understand the interaction between Bacillus amyloliquefaciens and leaf fall disease in rubber tree caused by Corynespora cassiicola Creativeness and innovativeness: Bacillus amyloliquefaciens isolated from the leaves of the rubber tree Hevea brasiliensis have been shown antifungal activity However, little evidence has been demonstrated on antagonistic role of B.amyloliquefaciens in controlling CLFD in rubbe tree Additionally, the identification of gene encoding cassiicolin and its expression during infection provide a clearer insight of fungal virulence caused by C.cassiicola Research results: Theme 1: Isolation and identification of genes encoding cassiicolin in C.cassiicola isolates collected from various rubber growing regions in Vietnam We have confirmed the presence of cas gene belonging to the cas2 group in two fungal isolates including CoryQN01 and CoryDC01/20 by using PCR and sequencing approaches Herein, phylogenetic analysis indicated that at least two C.cassiicola isolates contain cas2 isoform and 18 remaining fungal isolates were classified as Cas0 (no cas gene detected) Theme 2: Evaluation of in-planta fungal virulence caused by C.cassiicola isolates carrying cas2 gene in rubber clones Two C.cassiicola isolates carrying cas2 gene (CoryQN01 and CoryDC01) are capable of causing infection in Vietnamese rubber clones such as RRIV209 and IAN 873 In addition, the IAN 873 clone was more susceptible to the pathogenic fungus C cassiicola than the RRIV 209 clone The rubber clone IAN 873 was used for further experiments The results of image analysis of lesions using APS Assess 2.0 software provided similar results The ratio of the lesion area on the rubber clone IAN 873 was larger than that of the RRIV 209 clone, siginificant difference was observed in both CoryQN01 and CoryDC01isolates Theme 3: Evaluation of antagonistic activity with Corynespora cassiicola induced by Bacillus amyloliquefaciens in-vitro and in detached leaves The antifungal results of the bacterial strain tested on two C cassiicola isolates (CoryQN01 and CoryDC01) showed that the diameter of the antifungal ring induced by the CoryQN01 was larger than that of the CoryDC01 The results of T-Test indicated that the difference was statistically significant (P < 0.0001) Moreover, the results of T-test between the samples with and without treament of B.amyloliquefaciens showed that the size of the lesions and the percentage of the wound area (%) were statistically significant on days 3, 5, and after inoculation Theme 4: Expression profiles of cassiicolin encoded gene in C.cassiicola isolate before and after treament of CLFD by Bacillus amyloliquefaciens on the detached leaves at different time intervals of inoculation as well as expression of genes encoding bacterial lipopetides during antagonistic activity of B.amylliquefaciens The results of expression levels of cas2 gene by realtime RT-PCR method indicated that the expresion of cas2 gene was observed after dpi in the sample without bacterial treament The expresion gradually increased at 5dpi and decreased at 7dpi Furthermore, there was a significant difference in expression levels of cas2 gene in the samples with and without treatment of B.amyloliquefaciens in which drastically reduction in cas2 expression was observed in the samples treated by this bacterial strain This result is consistent with the results of RT-PCR We also found that lesions or cassiicolin toxin rings began to appear at dpi and spread at dpi corresponding to strong expression of gene encoding cassiicolin toxin in the sample without bacterial treatment However, the growth of fungal mycelia was inhibited and the presence of cassiicolin toxin ring was not clearly visible when using C.cassiicola isolate with the treatment of B.amyloliquefacines in comparison with that in the control Results of evaluating the expression of genes encoding lipopeptide proteins of Bacillus amyloliquefaciens during the resistance against fungal pathogens showed that the genes sfp, ituA, ituB and fenB were present in B amyloliquefaciens Expression of the ituB, fenB gene reached its high level after bacterial treatment, the result demonstrated that they play an important role in the bioregulation of CLFD in rubber tree Products: ✓ SCIE, Q2: "Identification and virulence evaluation of Corynespora cassiicola cassiicolin-encoding gene isolates from rubber trees in Vietnam" Tropical Plant Pathology (accepted) ✓ undergraduated student: Isolation and purification of biologically active compounds from endogenous Bacillus amyloliquefaciens T3 extracts resistant to the fungus Corynespora cassiicola causing rubber leaf blight (Hevea brasiliensis) (Huynh Xuân Thương Student number: 1653010309 (Faculty of Biotechnology, Ho Chi Minh City Open University) ✓ Master student: Evaluation of the toxicity of some isolates of the fungus Corynespora cassiicola on rubber trees and finding molecular markers related to cassiicolin toxin Nguyen Phương Vinh (Faculty of Agronomy, Nong Lam University) Transfer alternatives, application institutions, impacts and benefits of research results: - Providing useful information about presence of the cassiicolin toxin ring corresponding to the cas2 gene expression - Providing information for undergraduate student, graduate student and researcher to understand the interaction at molecular and cell between Bacillus amyloliquefaciens bacteria and leaf fall disease Corynespora cassiicola Ngày tháng năm Cơ quan quản lý xác nhận HIỆU TRƯỞNG Ngày tháng năm Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG 12 DANH MỤC HÌNH 12 DANH MỤC BIỂU ĐỒ 13 PHẦN 1: TỔNG QUAN 15 1.1 Giới thiệu cao su 16 1.1.1 Cây cao su tầm quan trọng 16 1.1.2 Tình hình sâu bệnh hại cao su 16 1.2 Bệnh rụng cao su nấm Corynespora cassiicola giới Việt Nam 17 1.3 Giới thiệu nấm Corynespora cassiicola 18 1.3.1 Triệu chứng bệnh 18 1.3.2 Phân loại 19 1.3.3 Đặc điểm nấm Corynespora cassiicola 20 1.4 Độc tố cassiicolin Corynespora cassiicola tiết 22 1.5 Tình hình nghiên cứu C cassiicola nước 24 1.5.1 Những nghiên cứu vế C cassiicola nước 24 1.5.2 Những nghiên cứu C cassiicola nước 24 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26 2.1 Địa điểm nghiên cứu 27 2.2 Vật liệu 27 2.2.1 Mẫu nghiên cứu 27 2.2.2 Hóa chất thiết bị 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 2.3.1 Phương pháp chủng bệnh Corynespora cassiicola cao su non tách rời 31 2.3.2 Phương pháp thử nghiệm khả kháng nấm vi khuẩn khuếch tán giếng thạch 33 2.3.3 Phương pháp kháng nấm vi khuẩn cao su tách rời 35 2.3.4 Phương pháp ly trích DNA 35 2.3.5 Phương pháp PCR phát gen cas 35 2.3.6 Phương pháp ly trích RNA 38 2.3.7 Phương pháp RT-PCR 39 2.3.8 Phương pháp Realtime-PCR 40 2.3.9 Phương pháp xác định diện gen đánh giá biều gen sfp, ituD, fenC RT-PCR Real-time PCR 41 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .46 Nội dung Phân lập xác định nhóm độc tố cassiicolin diện mẫu nấm Corynespora cassiicola phân lập vùng trồng cao su Việt Nam 46 3.1 Kết ly trích DNA từ mẫu nấm 46 3.2 Kết PCR phát gen cas chủng nấm Corynespora cassiicola 46 Nội dung 2: Đánh giá khả gây bệnh in-planta mẫu nấm phân lập mang nhóm độc tố chun biệt dịng vơ tính cao su 53 3.3 Kết chủng bệnh Corynespora cassiicola cao su non tách rời 53 Nội dung 3: Đánh giá khả đối kháng nấm Corynespora cassiicola vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens in vitro cao su tách rời 57 10 Variable Ngay1 Ngay3 Ngay5 Ngay7 Ngay9 Equality of Variances Method Num DF Den DF Folded F 2 1.07 Folded F 2 4.81 Folded F 2 19.51 Folded F 2 1.38 Folded F 2 1.53 F Value Pr > F 0.9644 0.3444 0.0975 0.8404 0.7916 87 Phụ lục Kết xử lý thống kê khuếch tán đĩa thạch Khuechtandiathach The TTEST Procedure Statistics Lower CL Upper CL Lower CL Upper CL Variable NT N Mean Mean Mean Std Dev Std Dev Std Dev Std Err Minimum Maximum kichthuoc I 31.089 32.222 33.355 0.9955 1.4738 2.8234 0.4913 29.6 34.2 kichthuoc II 26.359 26.778 27.197 0.3681 0.5449 1.044 0.1816 25.8 27.6 kichthuoc Diff (1-2) 4.3341 5.4444 6.5548 0.8275 1.1111 1.6909 0.5238 T-Tests Variable Method Variances DF t Value Pr > |t| kichthuoc Pooled Equal 16 10.39 |t| Ngay1 Pooled Equal 1.52 0.2021 Ngay1 Satterthwaite Unequal 2.41 1.52 0.2458 Ngay3 Pooled Equal 5.85 0.0042 Ngay3 Satterthwaite Unequal 3.8 5.85 0.0050 Ngay5 Pooled Equal 12.09 0.0003 Ngay5 Satterthwaite Unequal 2.51 12.09 0.0027 Ngay7 Pooled Equal 32.50
Ngày đăng: 28/03/2023, 09:23
Xem thêm:
