VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2021- 7/2021 tại phòng thí nghiệm Động vật học và phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh Trường Đại học Mở Tp HCM, cơ sở 3 Bình Dương số 68 Lê Thị Trung, phường Phú Lợi, thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương.
VẬT LIỆU
2.2.1 Nguồn ruồi đục trái Bactrocera dosalis
Thu thập nguồn ruồi đục trái Bactrocera dosalis từ những trái khế có dấu hiệu hư hỏng, có chấm đen, ứa mủ ở chợ Thủ Dầu Một đem về phòng thí nghiệm Động vật học, khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh, cơ sở 3 Bình Dương Việc xác định loài ruồi đục trái Bactrocera dosalis được vào tài liệu Cục Bảo vệ thực vật- Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn
2.2.2 Nấm kí sinh côn trùng sử dụng trong phòng thí nghiệm
Nguồn nấm kí sinh côn trùng được phân lập từ mẫu côn trùng bị nhiễm nấm kí sinh ngoài tự nhiên gồm mẫu ve sầu bị nấm kí sinh thu tại vườn cà phê, xã Sơ Pai, K’bang, tỉnh Gia Lai
Mẫu nấm kí sinh sinh côn trùng Isaria fumosorosea Bb-V3 sau khi phân lập và làm thuần sẽ tiến hành giữ giống tại phòng thí nghiệm Động vật học Sau đó các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Động vật học, Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở, cơ sở 3 Bình Dương
SVTH: Nguyễn Thanh Triều Trang 22
Hình 2.1 Hình ảnh giống chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 trong phòng thí nghiệm Động vật học.
THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG
- Mẫu nấm kí sinh côn trùng Isaria fumosorosea Bb-V3 đã được phân lập và giữ giống tại phòng thí nghiệm Động vật học
- Đối tượng thử nghiệm: nhộng ruồi đục trái Bactrocera dosalis
- Các thiết bị: tủ cấy vô trùng, nồi hấp, máy lắc, máy xay, cân phân tích, kính hiển vi, kính sôi nổi, buồng đếm hồng cầu
- Pipet (thủy tinh và pipetman)
SVTH: Nguyễn Thanh Triều Trang 23
2.3.3 Môi trường, hóa chất và thuốc nhuộm
- Môi trường: Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)
- Thuốc nhuộm: Thuốc nhuộm Lactophenol Control blue (LPCB)
- Hóa chất: Nacl, đường Glucose, agar, cồn 96 0 , cồn 70 0 , Tween 80,…
- Nguyên liệu: cám gạo, bột đậu nành, trấu, bột ngô, lúa, khoai tây.
PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
SVTH: Nguyễn Thanh Triều Trang 24
Dựa vào mục tiêu đề tài đưa ra, tôi tiến hành bố trí thí nghiệm theo sơ đồ:
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ quy trình các bước thực hiện thí nghiệm
Chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 đã được phân lập và giữ giống
Khảo sát hiệu lực tiêu diệt nhộng ruồi đục trái Bactrocera doalis từ chế phẩm của chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Quan sát đặc điểm hình thái sinh học của chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3
Khảo sát hiệu lực tiêu diệt nhộng ruồi đục trái Bactrocera dosalis của dịch bào tử chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 ở mật độ bào tử khác nhau trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Khảo sát hiệu lực tiêu diệt nhộng ruồi đục trái Bactrocera dosalis từ chế phẩm của chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 ở ngoài vườn.
Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự hình thành bào tử chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3.
Tạo môi trường thích hợp để sản xuất chế phẩm từ chủng nấm kí sinh côn trùng Isaria fumosorosea Bb-V3.
SVTH: Nguyễn Thanh Triều Trang 25
2.4.2 Nhân nuôi nguồn ruồi đục trái Bactrocera dosalis
Ruồi đục trái Bactrocera dosalis được thu thập từ những trái khế có dấu hiệu bị đục lỗ trên trái, vết thâm đen, bị úng, ứa mũ, đem về phòng thí nghiệm Động vật học, Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở TP HCM, cơ sở 3 Bình Dương sẽ được tiến hành nhân nuôi bằng cách để trái cây vào hộp nhựa có đục lỗ bên trên Ruồi đục trái sẽ trải qua các vòng đời và bắt đầu sinh sản, trong quá trình thành ấu trùng cho chúng ăn sáp mật ong và cần theo dõi vệ sinh hộp đựng sẽ tránh để nhiễm nấm mốc làm chết chúng Tiến hành quan sát sự phát triển của ruồi đục trái qua các tuổi, chụp hình chúng ở các giai đoạn
Hình 2.2 Hình ảnh nhân nuôi lấy nhộng ruồi đục trái từ khế
2.4.3 Quan sát đặc điểm hình thái sinh học của chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3
Nấm kí sinh côn trùng được cấy trên môi trường PDA, ủ ở nhiệt độ phòng Đọc kết quả
Quan sát khóm nấm từ 3- 15 ngày Tùy thuộc vào tốc độ phát triển của chủng Quan sát lại các đặc điểm của nấm như: hình dáng, kích thước (đường kính, chiều dày), dạng
SVTH: Nguyễn Thanh Triều Trang 26 mặt (nhung mượt, mịn, len xốp, dạng hạt, lồi lõm,…), màu sắc khuẩn lạc mặt trên và mặt dưới,…
Ghi nhận các đặc điểm của nấm kí sinh côn trùng như sau:
2.4.4.2 Quan sát trên kính hiển vi
Cách thực hiện: lấy một lame kính sạch, trong, đã sấy khô Cắt một khung giấy lọc hình vuông cạnh 2cm và có độ dày của cạnh khung là 0.3cm Đặt khung giấy lên giữa lam kớnh rồi bơm dịch mụi trường PDA bỏn lỏng ( khoảng 10à) lờn lam kớnh vào giữa khung giấy Tiếp đến cấy nấm vào giữa môi trường đã được bơm vào ( cấy đơn bào tử hay cấy đầu sợi nấm) Đậy lamen lên và đặt lên thanh chữ U trong buồng ấm ( ở đây sử dụng địa petri bên trong có chứa bông gòn ẩm bên trên có đặt thanh chữ U bằng sắt) Để trong hai ngày, sau đó lấy lam kính ra, bỏ khung giấy lọc, tiến hành nhuộm bằng lactophenol và quan sát Quan sát đặc điểm vi thể: dạng bào tử, tơ nấm, cuống bào tử ở vật kính ×100 có dầu soi Chụp ảnh khóm nấm trên đĩa petri và vi thể nấm trên kính
- Cần chú ý thao tác vô trùng tránh nhiễm các vi sinh vật khác làm sai lệch kết quả
- Buồng ẩm và nước cất bơm vào tạo môi trường ẩm đã được hấp khử trùng ở 121℃/1atm trong 20 phút
2.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự hình thành bào tử chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3
2.4.4.1 : Khảo sát sự ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của nấm kí sinh côn trùng
Mục đích: Để đánh giá ảnh hưởng của pH lên sự sinh bào tử của nấm kí sinh côn trùng Isaria fumosorosea Bb-V3 tốt nhất trên môi trường PDA (Potato Dextrose Agar)
SVTH: Nguyễn Thanh Triều Trang 27
Sơ đồ 2.2 Sơ đồ khảo sát sự ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của nấm Isaria fumosorosea Bb-V3
2.4.4.2 : Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển của nấm kí sinh côn trùng Isaria fumosorosea Bb-V3
Mục đích: để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh bào tử của nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 tốt nhất trên môi trường PDA và pH tối ưu từ thí nghiệm 2.4.4.1
Sơ đồ 2.3 Sơ đồ khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển của nấm Isaria fumosorosea Bb-V3
Chuẩn bị chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 thuần
Cấy vào đĩa petri có 5 mức dộ pH 5; 5,5; 6; 6,5; 7
Nuôi ở điều kiện tối, nhiệt độ phòng Đo đường kính khuẩn lạc và ghi chép số liệu sau 12 ngày
Pha môi trường PDA vào 5 bình erlen Điều chỉnh pH bằng máy đo pH
Pha môi trường PDA vào 5 bình erlen Đem hấp 121°C ( 1atm) trong 30 phút Để nguội đổ môi trường đĩa petri Đo đường kính khuẩn lạc và ghi chếp số liệu sau 12 ngày nuôi cấy
Chuẩn bị chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 thuần
Cấy nấm vào đĩa petri
PDA có pH tối ưu ở thí nghiệm 2.4.4.1
SVTH: Nguyễn Thanh Triều Trang 28
2.4.4.3 : Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự phát triển của nấm kí sinh côn trùng Isaria fumosorosea Bb-V3
Mục đích: để đánh giá ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự sinh bào tử của nấm kí sinh côn trùng Isaria fumosorosea Bb-V3 tốt nhất trên môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) và pH tối ưu từ thí nghiệm 2.4.4.1 và nhiệt độ tối ưu từ thí nghiệm 2.4.4.2
Sơ đồ 2.4 Sơ đồ khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Isaria fumosorosea Bb-V3
❖ Phương pháp chung cho cả 3 thí nghiệm trên:
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri ỉ 90, đĩa petri được hấp khử trựng ở 121 0 C (1 atm) trong 30 phỳt sau đó đi sấy khô và đổ môi trường PDA đã hấp sẵn
Chỉ tiêu theo dõi sự phát triển của nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 :
• Tốc độ phát triển trung bình (mm/ngày): đo độ dài đường kính trên 2 trục của khuẩn lạc sau các ngày nuôi cấy theo công thức ( Trịnh Xuân Thu và Lê Tuấn Anh, 2016): d = 𝒅𝟏 ×𝒅𝟐
Chuẩn bị chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 thuần
Cấy nấm vào đĩa petri
PDA có pH tối ưu ở thí nghiệm 2.4.4.1
Nuôi cấy nấm ở nhiệt độ tối ưu ở thí nhiệm 2.4.4.2
Theo dõi sự phát triển của nấm sau 6, 8,10, 12 ngày Đo đường kính khuẩn lạc và đếm mật độ bào tử Ghi chép số liệu
SVTH: Nguyễn Thanh Triều Trang 29
Trong đó: d1 và d2 là độ dài 2 dường kính chéo phần khuẩn lạc phân bố trên đĩa petri
Mật độ bào tử/ml mẫu được tính ở thời điểm 6, 8, 10, 12 ngày sau khi nuôi cấy theo phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm Thoma:
Trong đó: a là số bào tử có trong thể tích huyền phù ứng với diện tích ô nhỏ ( 1/400mm 2 ) × độ sâu 0.1 mm, b: hệ số pha loãng
Mật độ bào tử/ml mẫu = số bào tử (bào tử/ml)/ diện tích khuẩn lạc
2.4.5 Khảo sát hiệu lực tiêu diệt nhộng ruồi đục trái Bactrocera dosalis của dịch bào tử nấm từ chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 ở mật độ bào tử khác nhau trong điều kiện phòng thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí với 3 nồng độ dịch bào tử nấm, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần và nghiệm thức đối chứng phun nước Mỗi nghiệm thức là 20 nhộng ruồi đục trái
Bactrocera dosalis bằng tuổi ( ở giai đoạn ấu trùng chuyển sang giai đoạn nhộng sau 1 ngày)
- Đối chứng: ĐC- phun nước
- Nghiệm thức 1: NT1- phun với nồng độ 10 7 bào tử/ ml
- Nghiệm thức 2: NT2- phun với nồng độ 10 8 bào tử/ ml
- Nghiệm thức 3: NT3- phun với nồng độ 10 9 bào tử/ ml
SVTH: Nguyễn Thanh Triều Trang 30
Sơ đồ 2.5 Sơ đồ khảo sát hiệu lực tiêu diệt nhộng ruồi đục trái Bactrocera dosalis của dịch bào tử nấm từ chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 trong điều kiện phòng thí nghiệm
❖ Phương pháp cho thí nghiệm:
- Đánh giá hiệu quả tiêu diệt nhộng ruồi đục trái theo công thức Abbot:
Trong đó: - E: Tỷ lệ (%) nhộng ruồi đục trái chết
- C: Số nhộng ruồi đục trái sống ở lô đối chứng
- T: Số nhộng ruồi đục trái sống ở lô thí nghiệm
Chuẩn bị các hộp nhựa được hấp khử trùng có lót giấy thấm
Bỏ vào mỗi hộp nhựa 20 nhộng ruồi đục trái
Chuẩn bị chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 được cấy trong ống nghiệm môi trường PDA nghiêng sau 12 ngày
Pha loãng các ống nghiệm với nước cất vô trùng có bổ sung TWEEN 80 với nồng độ 10 7 ,
Tiến hành vortex trong khoảng 30s để dịch bào tử nấm trộn đều với nhau
Phun dịch bào tử nấm ở 3 nồng độ
10 7 , 10 8 , 10 9 vào các hộp (2ml/ hộp)
Theo dõi số nhộng chết sau 6, 8,
10, 12 ngày ở cả ba nồng độ
Nhộng chết lấy ra bỏ vào các hũ nhỏ có bông gòn thấm nước để theo dõi nấm kí sinh
Ghi chép lại số liệu và tính toán
SVTH: Nguyễn Thanh Triều Trang 31
- Đánh giá tỉ lệ nấm kí sinh côn trùng
2.4.6 Tạo môi trường thích hợp để sản xuất chế phẩm từ chủng nấm kí sinh côn trùng Isaria fumosorosea Bb-V3
Quy trình sản xuất chế phẩm nấm kí sinh côn trùng:
- Cách thực hiện nhân nuôi giống cấp 1: Ngâm 1kg thóc trong 12h, đem rửa nước + 3% vôi (nhằm giảm pH có trong thóc) Sau đó đun sôi thấy vỏ thóc nứt vừa phải Ngưng lại để ráo cho thêm 1g KH2PO4, 1g MgSO4, 3% cám bắp và 3% cám gạo Chia đều vào các hộp nhựachịu nhiệt (dài 16,5 cm; rộng 11,5 cm; cao 7 cm) đem đi hấp ở 121 0 C/1atm trong 30 phút Sau đó cấy nấm thuần chủng nuôi cấy trên môi trường PDA vào môi trường
- Cách thực hiện nhân nuôi giống cấp 2: Xay và trộn đều nguyên liệu theo tỉ lệ 40% cám gạo + 20% cám bắp + 30% bột đậu nành + 10% vỏ trấu Cân khối lượng 500g chia đều cho các bịch nhựa kích cỡ 1,5 kg đem đi hấp khử trùng 121 0 C/1atm trong 30 phút Sau đó để nguội
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Mô tả đặc điểm hình thái sinh học của chủng nấm I fumosorosea Bb-V3
Khi nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 xâm nhiễm, cơ thể vật chủ bị bao phủ một lớp nấm màu trắng sau chuyển sang xám nhạt hoặc xám tro Thể bình dài chiều dài trung bỡnh 5,2 ± 1,1 àm và đường kớnh 1,8 ± 0,3 àm ở nơi phỡnh to Đường kớnh thể bỡnh từ đỉnh đến cổ trung bỡnh 0,4 ± 0,1 àm dạng bào tử hỡnh trụ hoặc hỡnh thoi Bào tử trưởng thành dài trung 4,3 ± 0,5 àm và đường kớnh 2,2 ± 0,2 àm Thành sợi nấm dinh dưỡng dày, trơn nhẵn trong suốt đường kớnh 1,5 ± 0,3 àm Cựng với nhau, cỏc đặc điểm hỡnh thái này phù hợp với các loại nấm côn trùng trong chi Isaria (= Paecilomyces) (Samson, 1974; Humber, 1998)
Hình 3.1 kích thước bào tử bề dọc (A), bề ngang (B) và sợi nấm (C) của chủng nấm
Isaria fumososea Bb-V3 được nuôi cấy trên môi trường PDA sau 15 ngày
Hình 3.2 Đặc điểm khuẩn lạc của chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 ở mặt trên (A) và mặt dưới (B) đĩa petri
Sau khi tiến hành quan sát các đặc điểm đại thể và vi thể của chủng nấm kí sinh côn trùng Isaria fumosorosea Bb-V3 nhận thấy: nấm có dạng bào tử hình elip; tơ nấm
SVTH: Nguyễn Thanh Triều Trang 38 trắng ngà, mịn, khi cấy trên môi trường thạch PDA trong đĩa petri thấy mặt dưới đĩa petri có màu trắng đục, mặt trên đĩa petri có màu trắng ngà; cuống sinh bào tử có sợi nấm mảnh, không có vách ngăn bào tử mọc thành chùm.
Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự hình thành bào tử của chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3
3.2.1 Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành bào tử của chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3
Bảng 3.1 pH ảnh hưởng đến đường kính khuẩn lạc và sự phát triển bào tử của chủng nấm I fumosorosea Bb-V3 sau 12 ngày nuôi cấy
Mức độ pH Đường kính khuẩn lạc (cm) Mật độ bào tử ( 10 9 /cm 2 )
Trong cùng một cột, các số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 0,05 (P