BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN TIỀM NĂNG ĐỐI VỚI VI NẤM GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY NHO Vitis vinifera L.. BÁO CÁO
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐIẠ ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu được tiến hành trong khoảng thời gian từ tháng 1/2019 đến tháng 5/2019 tại Phòng thí nghiệm công nghệ vi sinh, Khoa công nghệ sinh học, trường Đại học mở TP Hồ Chí Minh.
VẬT LIỆU
Thu nhận 5 mẫu lá, quả nho bị bệnh thán thư được lấy trực tiếp từ vườn nho có cây bị bệnh ở ấp Phước Tân, xã Phan, huyện Dương Minh Châu, tỉnh Tây Ninh và xã Phước Thuận, huyện Ninh Phước, tỉnh Ninh Thuận Cây bệnh được xác định dựa trên các dấu hiệu ở phần II, mục 4 Mẫu bệnh sau khi thu thập phải được bảo quản ở môi trường khô ráo, tránh ẩm thấp Tiến hành phân lập nấm bệnh từ mẫu thu thập được trong vòng 8 giờ để tránh tình trạng mẫu bị héo, khô, gây ảnh hưởng đến quá trình phân lập.
THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU
3.1 Thiết bị và dụng cụ
- Pipet (thủy tinh và micropipet)
SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 31
3.2 Hóa chất và môi trường
Môi trường: PDA (Potato Dextrose Agar), NA (Nutrient Agrar), NB (Nutrient Broth)
●Thuốc nhuộm: Lactophenol, Crysto Violet, Safarin O, Lugol
●Hóa chất: Ethanol 96 o , NaCl, Tween 80
PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
Dựa vào mục tiêu nghiên cứu, thí nghiệm được bố trí ở sơ đồ 2.1
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ thí nghiệm
4.2 Phân lập và định danh vi nấm bằng phương pháp sinh học phân tử
Thu nhận mẫu nho bị bệnh Tái phân lập vi khuẩn
Xử lý mẫu và phân lập nấm bệnh Định tính khả năng kháng nấm bệnh của vi khuẩn phân lập được
Nhuộm Gram, quan sát hình thái
Nhuộm lactophenol và quan sát hình thái
Xác định phần trăm kháng nấm bệnh của vi khuẩn
Thử nghiệm khả năng gây bệnh nhân tạo trên lá nho ở mô hình phòng thí nghiệm
Khảo sát khả năng tương thích giữa các chủng tiềm năng Tái phân lập vi nấm gây bệnh Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử
SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 32
Dựa vào các triệu chứng bệnh được mô tả ở phần I mục 4.1, thu nhận mẫu nho và đem về phòng thí nghiệm tiến hành phân lập mẫu Sử dụng túi giấy để lấy giữ mẫu bệnh Mẫu bệnh phải được bảo quản trong điều kiện mát mẻ, khô ráo và không bị tạp nhiễm Đóng gói mẫu cẩn thận để tránh va đập và hơi nước ngưng tụ (Roger và cs., 2005)
Tiến hành phân lập nấm bệnh theo các bước sau:
1 Rửa sạch phần mẫu cây bệnh dưới vòi nước mạnh để trôi hết chất bẩn
2 Rửa mẫu bằng cồn ethanol 70%
3 Ngâm mẫu với NaOCl 1% trong 5-7 phút
4 Ngâm trong ethanol 70% trong 3-5 phút
5 Rửa mẫu với nước cất vô trùng 3 lần
6 Đặt trên giấy hấp vô trùng để thấm khô mẫu
7 Cắt mẫu bệnh thành từng miếng cấy nhỏ khoảng 2 x 2 mm tại điểm tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe Đặt từ 3 - 4 miếng cấy lên môi trường PDA có chứa khỏng sinh Chloramphenicol (100 àg/ml) Ủ tại nhiệt độ 25 o C ± 2 Quan sỏt đĩa cấy hàng ngày Khi thấy xuất hiện sợi nấm, cấy chuyển ngay sang môi trường PDA mới, ủ tiếp tại nhiệt độ trên
8 Để đạt được mẫu nấm thuần, không lẫn tạp có thể dùng phương pháp cấy đơn bào tử hoặc cấy đỉnh sợi nấm từ các tản nấm mọc lên từ lần phân lập đầu tiên (Roger và cs., 2005)
Vi nấm được cấy trên đĩa PDA, ủ ở nhiệt độ phòng
Quan sát khóm nấm từ 3 – 10 ngày Đối với một số chủng phát triển chậm hoặc có cơ quan sinh sản hữu tính, thời gian quan sát sẽ kéo dài hơn có thể đến 1 tháng
SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 33
Màu sắc và sự thay đổi màu sắc ở mặt phải và mặt trái của khóm nấm trên đĩa Petri
Hình dạng khóm nấm (sợi bông, nhung, sợi ướt, bột, trơn láng,…)
Tạo sắc tố ra môi trường
Tạo các giọt tiết trên bề mặt khóm nấm
Các đặc điểm khác (Nguyễn Đức Lượng, 2003)
Dựa vào mô tả hình thái đại thể của nấm theo khóa phân loại của Sutton (1980), Simmonds (1965) và CABI (2018) để so sánh, đối chiếu
Quan sát vi thể: tiến hành làm tiêu bản nấm mốc, rồi quan sát hình thái học dưới kính hiển vi ở vật kính 10X, 40X
Cách làm tiêu bản nấm mốc như sau:
Lấy một lam kính sạch, trong đã sấy khô Cắt một khung giấy lọc hình vuông cạnh 2 cm và có độ dày của cạnh khung là 0,3 cm Đặt khung giấy lên giữa lam kính rồi bơm dịch mụi trường PDA bỏn lỏng (khoảng 10àL) lờn lam kớnh vào giữa khung giấy
Tiếp đến cấy nấm lên trên môi trường vừa mới bơm vào (cấy đơn bào tử hay cấy đỉnh sợi nấm) Đậy lame lên và đặt lên thanh chữ U trong buồng ẩm (ở đây sử dụng đĩa petri bên trong có chứa bông gòn ướt bên trên có đặt thanh chữ U bằng thủy tinh) Để trong 2 ngày, lấy lam kính ra bỏ khung giấy lọc, tiến hành nhuộm bằng lactophenol và quan sát dưới kính hiển vi (Nguyễn Đức Lượng, 2011)
Dựa vào mô tả hình thái vi thể của nấm Cao Ngọc Điệp (2014), Agrios (2005), Mai văn Hào và cs (2005), Jamadar (2007), Shanmughvelu và cs (1989), Barnett và Hunter (1998), Pamela và cs (1992), Padman và Janardhna (2011) để so sánh và đối chiếu với các chủng nấm đã phân lập được
SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 34
- Cần chú ý thao tác vô trùng tránh nhiễm sinh vật khác làm sai lệch kết quả
- Buồng ẩm và nước cất bơm vào tạo môi trường ẩm đã được hấp khử trùng ở
Để đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng nấm phân lập được, tiến hành thử nghiệm gây bệnh nhân tạo trên cây nho trong điều kiện phòng thí nghiệm Thiết kế thử nghiệm theo dạng ngẫu nhiên hoàn toàn, với 3 lần lặp.
- Nghiệm thức T: bổ sung chủng nấm nghi ngờ gây bệnh cho cây nho
- Nghiệm thức T-DC: không bổ sung chủng nấm gây bệnh
Nấm bệnh được đưa vào chậu theo các bước sau:
1 Cấy nấm trên môi trường thạch PDA ủ ở 30 o C trong 72 giờ
2 Cho vào ống nấm nước muối 0,85% có chứa 0,05% Tween 80, dùng que cấy cạo nhẹ trên mặt khóm nấm để lấy bào tử
3 Dùng buồng đếm hồng cầu để đếm số bào tử với mật độ là 1 x 10 6 CFU/mL
4 Nấm đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút
5 Dùng mũi mác gây tổn thương lên lá Sau đó tiêm dịch nấm đã thử nghiệm và ủ trong 28 o C trong 5 ngày
6 Lá đối chứng sẽ được nhỏ nước cất vô trùng (Lan và cs, 2012)
7 Sau 3-5 ngày, kiểm tra những mẫu nho thí nghiệm Lựa chọn những mẫu nho bị bệnh để tái phân lập
4.2.5 Tái phân lập vi nấm từ lá bệnh đã được gây nhiễm
Tiến hành tái phân lập lại nấm gây bệnh từ mẫu lá nho đã được gây nhiễm trước đó (có triệu chứng bệnh nặng nhất và tương tự với mô tả về bệnh thán thư) tương tự các bước như ở phần II mục 4.2
4.2.6 Định danh vi nấm bằng phương pháp sinh học phân tử
SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 35
Vi nấm sau khi làm thuần được gửi đi định danh dịch vụ tại Công ty CP Công nghệ TBR Kết quả giải trình tự được BLAST trên phần mềm NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ) để so sánh với các trình tự của chi
Thu nhận trình tự nucleotide của vùng gen 28S rDNA của các vi nấm khác thuộc chi Colletotrichum spp và các vi nấm thuộc nhóm ngoại từ Genbank trên NCBI ở định dạng FASTA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)
Sử dụng phần mềm Annhyb và Clustalx để sắp gióng cột trình tự đã giải với các trình tự cơ sở dữ liệu
Dò tìm mô hình tiến hóa Xác định mô hình tiến hóa phù hợp nhất để dựng cây Maximum likelihood bằng chức năng Find Best DNA/Protein Models (ML) trong MEGA 6.0 Mô hình có điểm số BIC score thấp nhất là model tốt nhất để dựng cây
Xây dựng cây phả hệ bằng phần mềm Mega 6.0
4.3 Tái phân lập các chủng vi khuẩn tiềm năng
Sau khi nhận giống vi sinh vật từ phòng thí nghiệm công nghệ vi sinh Trường Đại học Mở Tp.HCM tiến hành cấy phân lập trên đĩa môi trường NA
Bằng mắt thường, hay dùng kính lúp cầm tay nhận xét về kích thước, màu sắc, hình thái,… của khuẩn lạc trên đĩa NA
Phương pháp nhuộm Gram vi khuẩn
Sự khác biệt về thành phần vách tế bào của vi khuẩn Gram dương và Gram âm dẫn đến sự khác biệt trong khả năng bắt màu đối với thuốc nhuộm, tạo nên hai nhóm vi khuẩn riêng biệt.
Việc nhuộm Gram được thực hiện như sau:
SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 36
Nhỏ giọt nước lên một phiến kính sạch Tạo huyền phù với vi khuẩn cần nhuộm, hơ nóng nhẹ phiến kính cho đến khô
Phủ hoàn toàn vết bôi với Crystal violet Để yên 1 – 2 phút rồi nhẹ nhàng rửa trôi thuốc nhuộm dư bằng nước
Nhỏ dung dịch Lugol trong khoảng 30 giây rồi lại rửa nhẹ nhàng với nước Tẩy cồn 96 o từ 15 – 30 giây, sau đó rửa nước Phủ hoàn toàn vết bôi với Safranin
O và để yên trong 1 phút Rửa với nước
Thấm khô phiến kính với giấy thấm Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 100X Đọc kết quả
Tế bào vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím
Tế bào vi khuẩn Gram (–) bắt màu hồng
Cách sắp xếp, hình thái
Vi khuẩn có bào tử, bào tử trong suốt không bắt màu
4.4 Sàng lọc các chủng vi khuẩn tiềm năng
4.4.1 Thử nghiệm ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật có khả năng kiểm soát nấm bệnh
Chuẩn bị dịch thử nghiệm
Dịch nấm: ống nấm giống được pha với nước muối sinh lý 0,85% sau cho dịch nấm có mật độ là 2x10 6 CFU/ mL (xác định mật độ bằng buồng đếm hồng cầu) Dịch khuẩn: ống chủng vi khuẩn được pha với nước muối sinh lý 0,85%, so với ống chuẩn 0,5 McFarland để được dịch khuẩn có nồng độ 1-2x10 8 CFU/ mL Tiến hành: dùng tăm bông chấm dịch nấm và dịch vi khuẩn thử nghiệm vào 2 vị trí cách nhau 3 cm trên đĩa petri chứa môi trường PDA (đường kính 90 mm) ở 27 o C trong 6 ngày (Nguyễn Đức Lượng và cs., 2011)
