Nghiên cứu khả năng đối kháng nấm bệnh ở cây tiêu của một số vi khuẩn được phân lập từ đất trồng tiêu tại tây nguyên

LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Phạm Việt Cường, viện trưởng Viện nghiên cứu KH Miền Trung, Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam tạo điều kiện cho học tập, thực hành thí nghiệm suốt trình thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kim Cúc, ThS Trần Thị Hồng anh chị Phịng Cơng nghệ sinh học, viện Hóa sinh biển Trung tâm sinh học phân tử Nghĩa Đô (Viện nghiên cứu KH Miền Trung) tận tình bảo giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu Tơi xin cảm ơn thầy cô khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội, người truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt thời gian học tập trường Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè ln động viên, khích lệ giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Hồng Hạnh DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT CHỮ VIẾT TẮT TÊN ĐẦY ĐỦ ADN Axit deoxyribonucleotit ARN Axit ribonucleotit Agar Thạch BLAST Basic Local Alignment Search Tool CN Chết Nhanh DNTP Deoxynucleotide triphosphates EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid HTKS Hoạt tính kháng sinh KTST Kích thích sinh trưởng 10 NBCI National Biological Control Institute 11 MPA Meat-Peptone-Agar 12 PCR Polymerase Chain Reaction 13 TAE Tris-acetic acid-EDTA 14 TE Tris-EDTA 15 UV Ultraviolet DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Tên mẫu địa điểm lấy mẫu 17 Bảng 2.2 : Trình tự thơng số cặp mồi để khuếch đại gen 16S rRNA cho vi khuẩn 18 Bảng 2.3 : Thành phần phản ứng PCR cho vi khuẩn 22 Bảng 3.1: Khả kháng nấm F.oxysporum chủng vi khuẩn 24 Bảng 3.2 Khả sinh trưởng môi trường MPA chủng vi khuẩn tuyển chọn 27 Bảng 3.3: Khả kháng nấm R.solani chủng vi khuẩn 28 Bảng 3.4 Khả sinh trưởng môi trường MPA chủng vi khuẩn tuyển chọn 30 Bảng 3.5: Một số đặc điểm hình thái chủng đối kháng 31 Bảng 3.6: Kết xác định tỷ lệ A260/A280 nồng độ ADN (µg/ml) chủng vi khuẩn nghiên cứu 33 DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1: Triệu chứng Tiêu mắc bệnh chết nhanh Hình 1.2: Triệu chứng tiêu mắc bệnh chết chậm Hình 1.3: Triệu chứng cà phê bị bệnh thối rễ tơ 10 Hình 1.4: Triệu chứng cà phê bị bệnh thối rễ cọc 11 Hình 3.1: Khả đối kháng F.oxyporum chủng vi khuẩn phân lập 25 Hình 3.2: Hình thái chủng vi khuẩn đối kháng nấm F.oxyporum 26 Hình 3.3: Khả đối kháng nấm Rhizoctonia solani chủng vi khuẩn phân lập 29 Hình 3.4: Hình thái chủng vi khuẩn phân lập đối kháng với nấm R.solani 29 Hình 3.5: Điện di đồ ADN tổng số chủng vi khuẩn nghiên cứu 33 Hình 3.6: Điện di đồ sản phẩm PCR chủng vi khuẩn VK5 CM5crk, VK10 CM4crk, VK5 CS1trk, BX 101 CS1trk, CF III EH2cđ 34 Hình 3.7 Kết so sánh trình tự 16S rADN chủng VK10 CM4 CrK BLAST 35 Hình 3.9: Kết so sánh trình tự 16S rADN chủng VK5CM5 CrK BLAST 37 Hình 3.10: Cây phát sinh chủng loại VK5CM5 CrK 37 Hình 3.11: Kết so sánh trình tự 16S rADN chủng Vk5CS1 TrK BLAST 38 Hình 3.12: Cây phát sinh loài chủng VK5CS1 Trk 39 Hình 3.13: Kết so sánh trình tự 16S rADN chủng Bx-101 CS1trk BLAST 40 Hình 3.14: Cây phát sinh chủng loại chủng Bx-101 CS1trk 40 Hình 3.15: Kết so sánh trình tự 16S rADN chủng Bx-101 CS1trk BLAST 42 Hình 3.16: Cây phát sinh chủng loại chủng CF III EH2cđ 42 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm số vi nấm gây bệnh thực vật 1.1.1 Khái quát nấm bệnh 1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, chế gây bệnh biểu Fusarium oxysporum 1.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, chế gây bệnh biểu Rhizoctonia solani 1.2 Tổng quan Tiêu 1.3 Một số bệnh Tiêu 1.3.1 Bệnh chết nhanh 1.3.2 Bệnh chết chậm 1.3.3 Tuyến trùng 1.3.4 Bệnh thối rễ tơ (Tuyến trùng nấm Fusarium spp., Rhizoctonia spp) cà phê 10 1.3.5 Bệnh thối rễ cọc (Tuyến trùng Pratylenchus coffea nấm Fusarium spp) cà phê 10 1.4 Tình hình nghiên cứu loại vi sinh vật gây hại cho tiêu biện pháp phịng trừ ngồi nước 11 1.4.1 Tình hình nghiên cứu loài vi sinh vật gây hại cho tiêu biện pháp phịng trừ ngồi nước 11 1.4.2 Tình hình nghiên cứu lồi vi sinh vật gây hại cho tiêu biện pháp phòng trừ nước 13 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tượng, vật liệu, hóa chất thiết bị 17 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.2 Vật liệu 18 2.1.3 Hóa chất, thiết bị mơi trường ni cấy 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn 20 2.2.2 Phương pháp nhuộm Gram 20 2.2.3 Phương pháp đục lỗ xác định hoạt tính kháng sinh dịch ni 21 2.2.4 Phương pháp sinh học phân tử 21 2.2.4.1 Quy trình tách chiết ADN genom vi khuẩn 21 2.2.4.2 Xác định nồng độ ADN nhờ máy quang phổ tử ngoại 22 2.2.4.3 Kỹ thuật PCR 22 2.2.4.5 Điện di ADN gel agaroza 22 2.2.4.6 Xác định trình tự nucleotit gen 23 2.2.4.7 Xử lý trình tự ADN phân tích số liệu phần mềm máy tính 23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính đối kháng 24 3.2 Tách dịng giải trình tự gen mã hố 16s rADN chủng vi khuẩn tuyển chọn 33 3.2.1 Tách ADN genome từ vi khuẩn 33 3.2.2 Nhân gen 16S ADN riboxom 34 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 LỜI CAM ĐOAN 49 MỞ ĐẦU Hiện nay, giới Việt Nam quan tâm nhiều đến bệnh vi sinh vật gây ra, bệnh gây tổn thất lớn cho nơng nghiệp tồn giới, đặc biệt cho loại nông sản chủ yếu Sản lượng hồ tiêu Việt Nam chiếm khoảng 12% tổng sản lượng nông nghiệp giới Nấm gây hại thực vật có tới hàng chục ngàn lồi, vi rút có tới 1000 lồi 600 lồi vi khuẩn gây bệnh thực vật Thiệt hại nấm hại chiếm khoảng 80% tổng thiệt hại mùa màng, bệnh Fusarium, Rhizoctonia solani gây chiếm tỷ lệ tương đối lớn Đây tác nhân chủ yếu gây nên bệnh chết héo, tắc mạch dẫn thối rễ thối thân nhiều loại trồng : lạc, cà chua, khoai tây, cà phê, tiêu, bông…[28] Đối với nước ta nơng nghiệp chiếm vai trị quan trọng việc phát triển kinh tế nên bệnh vấn đề quan tâm Cây trồng không cung cấp lương thực thực phẩm, trì đời sống cho người dân, mà cịn tạo hàng hóa có giá trị xuất cao, đặc biệt công nghiệp như: tiêu, bông, cà phê…Tuy nhiên suất chất lượng trồng phải đối mặt với nhiều vấn đề khó khăn, đặc biệt bệnh nấm gây Biện pháp người dân chủ yếu sử dụng để phòng, tránh chữa loại bênh biện pháp hóa học Tuy nhiên, biện pháp lại có nhiều mặt tiêu cực, ví dụ loại thuốc hóa học dùng để trừ nấm cho chứa nhiều thành phần độc hại cho môi trường, cho người, gây ảnh hưởng đến đất trồng, chất lượng trồng chi phí cao Ngồi ra, sử dụng lâu dài hóa chất làm cho đất đai bạc màu, ảnh hưởng tiêu cực tới sinh vật có ích, tạo loại sinh vật gây hại kháng thuốc, kết việc sản xuất nông nghiệp rơi vào tình trạng khó khăn Đặc biệt khu vực Miền Trung, tiêu cà phê thường bị thối cổ rễ Fusarium oxysporum, R solani , Phytophthora số tác nhân khác [1] Để khắc phụ đề thuốc hóa học gây ra, nhà khoa học ý đến nguồn tài nguyên lớn – nguồn tài ngun vi sinh vật hữu ích, có tiềm bảo vệ môi trường sinh thái Việc ứng dụng vi sinh vật hữu ích khơng giúp đem lại hiệu tiêu diệt nguồn bệnh cao, an toàn, sản phẩm thu hoạch sạch, không ảnh hưởng tới người sử dụng, có lợi cho cân sinh thái, mà cịn giảm phần lớn lượng thuốc hố học sử dụng Tây Ngun vùng có khí hậu nhiệt đới gió mùa, với đặc trưng nóng ẩm Với lợi đất đai khí hậu, Tây Nguyên vùng phát triển nhiều loại cơng nghiệp ăn có giá trị kinh tế cao cà phê, ca cao, hồ tiêu, sầu riêng Tuy nhiên, ngoại trừ cà phê mẫn cảm với bệnh nấm Phytophthora gây Hiện người dân vùng trồng cơng nghiệp chủ yếu sử dụng hóa chất để phịng chống bệnh cho tiêu, cà phê…Mặc dù hiệu chữa bệnh cao, nhanh chóng để lại tác hại không lường cho môi trường, ảnh hưởng tới chất lượng xuất sản phẩm Vì vậy, biện pháp sử dụng vi sinh vật đối kháng giải pháp tiềm năng, thiết thực để có sản xuất nơng nghiệp bền vững [7] Với ý nghĩa thực tiễn tiến hành thực đề tài: ”Nghiên cứu khả đối kháng nấm bệnh tiêu số vi khuẩn phân lập từ đất trồng Tiêu Tây Nguyên” Mục tiêu nghiên cứu Luận văn: Có chủng vi khuẩn đối kháng nguồn bệnh nấm hại tiêu có tiềm sử dụng thực tế Nội dung nghiên cứu Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng cao với nấm F.oxysporum, R.solani từ đất trồng tiêu Tây Nguyên Định danh vi khuẩn phương pháp sinh học phân tử (giải trình tự gen 16S ADN riboxom); nghiên cứu quan hệ phát sinh loài chủng triển vọng CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm số vi nấm gây bệnh thực vật 1.1.1 Khái qt nấm bệnh Các lồi thực vật nhìn chung bị nhiều bệnh nguồn bệnh vi sinh vật khác gây nên Ví dụ số chi vi sinh vật gây bệnh thực vật tiêu biểu như: Phytophthora, Xanthomonas, Erwinia, Pythium, Pseudomonas, Fusarium, Aspergillus, Rhizopus, Rhizoctonia solani Cây trồng thường mắc bệnh giai đoạn trước sau trình thu hoạch Khi trồng bị bệnh, thường gây dịch đại dịch làm ảnh hưởng lớn đến suất chất lượng sản phẩm [10] Hiện có khoảng 80.000 lồi nấm biết có khả gây bệnh cho trồng, phần lớn sống theo kiểu bán hoại sinh, có vài lồi nấm gây hại nhiều loại trồng Nấm sinh vật dị dưỡng, nguồn lượng cần thiết cho hoạt động sống lấy từ chất hữu cơ, chúng tập trung tầng đất phía chất hữu phong phú Nấm chịu tác động yếu tố mơi trường như: nồng độ ion H+, chế độ nước, nhiệt độ, cấu trúc đất Bệnh nấm gây khó phịng trừ chúng có khả tồn lâu đất Hơn nữa, nhiều loại nấm phát triển khoảng pH rộng, từ pH axit pH kiềm cao [4] Trong bệnh có nguồn gốc nấm F.oxysporum, F.solani, Phytophthora sp loài gây thiệt hại cho trồng Chúng có khả sống hoại sinh, chống chịu với hoạt động đối kháng vi sinh vật đất, kết dẫn đến gia tăng số lượng bệnh điều kiện địa lý, sinh thái khác nhau[7] 1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, chế gây bệnh biểu Fusarium oxysporum Đặc điểm hình thái, sinh lý Fusarium oxysporum Chi Fusarium bao gồm 30 loài, lồi F.oxysporum lồi phổ biến loài gây bệnh nguy hiểm trồng F.oxysporum gây tượng tắc mạch dẫn cây, nguyên nhân trực tiếp bệnh thối thân, thối rễ thực vật Bệnh xuất sớm mà thường gây hại mạnh vào giai đoạn sinh trưởng F.oxyporum loại nấm đa bào phân nhánh, màu sắc tản nấm trắng, phớt hồng Trong trình sinh sản chúng sinh hai loại bào tử khác nhau: Bào tử hậu bào tử phân sinh Bào tử hậu có màu sẫm, vỏ dày có hình ovan, hình thành từ sợi nấm hay từ bào tử lớn Bào tử phân sinh có loại: Bào tử loại lớn: có hình lưỡi liềm bầu dục, ngắn thẳng, cong nhẹ, thường có ba ngăn ngang, ổ màu da cam; Bào tử loại nhỏ: dạng đơn bào, hình elip thận, hình thành bọc giả cành đơn nhánh, không màu Cành bào tử nhiều nhánh, bào tử phân sinh mọc thành cụm đến đỉnh cành Kích thước tản phụ thuộc vào nhiệt độ Ở 250C tản phụ có kích thước khoảng 3.5cm, 300 khoảng 2.8cm Tản có màu nhạt tím đậm Nấm mọc 420C môi trường thông thường Dưới 200C nấm mọc phát triển chậm Nhiệt độ tối thích 25 - 300C, phát triển 4-5 ngày độ ẩm cao 90-95% [17] Cơ chế gây bệnh biểu hiện: F.oxysporum loại nấm phạm vi ký chủ rộng, có mặt hầu hết vùng trồng trọt giới Ở Hawaii, vật chủ nấm khoai tây, mía, họ cà phê, hạt tiêu, Chúng gây bệnh đổ rạp nhiều loại thực vật cà phê, hạt tiêu, cọ dừa, lúa, cà chua, dưa chuột Có thể khái quát chế gây bệnh F.oxysporum sau: Sau xâm nhập, F.oxysporum lan tràn khắp thực vật nhờ ống chứa đầy bào tử sợi khuẩn ty Sợi khuẩn ty tiến đến hệ thống xylem, từ chúng tiếp tục lan tới hệ thống gân lá, nhờ dịng nhựa, chúng tới tồn hệ thống mạch thực vật Nấm phát triển mạnh, ảnh hưởng tới việc cung cấp nước chất khoáng khiến cho chuyển sang màu vàng, rễ, thân phía bị thối dần lên phía Quá trình héo rũ lan nhanh ngày qua ngày thực vật đổ rạp xuống kết bị chết Biểu rõ nét suốt giai đoạn từ hoa kết trái.[17] ACGGGTGAGT CTAATACCGC TGAGCCTAGG ACTGGTCTGA AGGCAGCAGT TGAAGAAGGT CTTTGCTGTT GGTAATACAG TTTGTTAAGT AGCTAGAGTA GGAAGGAACA GCGTGGGGAG GCCGTTGGAA AGTACGGCCG ATGTGGTTTA TCCAGAGATG CTCGTGTCGT CAGCACGTTA ATGACGTCAA ACAAAGGGTT CGCAGTCTGC ACGGTGAATA ACCAGAAGTA AATGCCTAGG ATACGTCCTA TCGGATTAGC GAGGATGATC GGGGAATATT CTTCGGATTG TTGACGTTAC AGGGTGCAAG TGGATGTGAA CGGTAGAGGG CCAGTGGCGA CAAACAGGAT TCCTTGAGAT CAAGGTTAAA ATTCGAAGCA GATTGGTGCC GAGATGTTGG TGGTGGGAAC GTCATCATGG GCCAAGCCGC AACTCGACTG CGTTCCCGGG GCTAGTCTAA AATCTGCCTA CGGGAGAAAG TTGTTGGTGA AGTCACACTG GGACAATGGG TAAAGCACTT CGACAGAATA CGTTAATCGG AGCCCCGGGC TGGTGGAATT AGGCGACCAC TAGATACCCT TTTAGTGGCG ACTCAAATGA ACGCGAAGAA TTCGGGAACT GTTAAGTCCC TCTAAGGAGA CCCTTACGGC GAGGTGGAGC CGTGAAGTCG CCTTGTACAC CCTTCGGGAG TTAGTGGGGG CAGGGGACCT GGTAATGGCT GAACTGAGAC CGAAAGCCTG TAAGTTGGGA AGCACCGGCT AATTACTGGG TCAACCTGGG TCCTGTGTAG CTGGACTGAT GGTAGTCCAC CAGCTAACGC ATTGACGGGG CCTTACCTGG CAGACACAGG GTAACGAGCG CTGCCGGTGA CAGGGCTACA TAATCCCATA GAATCGCTAG ACCGCCCGTC GACGGTACCA ACAACGTTTC TCGGGCCTTG CACCAAGGCG ACGGTCCAGA ATCCAGCCAT GGAAGGGCAG AACTCTGTGC CGTAAAGCGC AACTGCATCC CGGTGAAATG ACTGACACTG GCCGTAAACG ATTAAGTTGA GCCCGCACAA CCTTGACATG TGCTGCATGG CAACCCTTGT CAAACCGGAG CACGTGCTAC AAACCGATCG TAATCGTGAA ACACCATGGG CATCGTCGAT GAAAGGAACG CGCTAATAGA ACGATCCGTA CTCCTACGGG GCCGCGTGTG TAAATTAATA CAGCAGCCGC GCGTAGGTGG AAAACTGGCA CGTAGATATA AGGTGCGAAA ATGTCAACTA CCGCCTGGGG GCGGTGGAGC CTGAGAACTT CTGTCGTCAG CCTTAGTTAC GAAGGTGGGG AATGGTCGGT TAGTCCGGAT TCAGAATGTC AGTGGGTTGC GCATGCGTA Sau so sánh trình tự gen 16S rADN chủng VK10 CM4 CrK với sở liệu gen NBCI phần mềm BLAST cho thấy trình tự có độ tương đồng từ 98 -100% với chủng thuộc chi Pseudomonas (hình 3.7) [29] Hình 3.7 Kết so sánh trình tự 16S rADN chủng VK10 CM4 CrK BLAST Trên sở so sánh độ tương đồng trình tự với chủng khác phần mềm BLAST, tiến hành xây dựng phát sinh loài chủng VK10 CM4 CrK với chủng có độ tương đồng cao xếp theo thứ tự ưu tiên 35 phần mềm BLAST Kết xây dựng phát sinh loài chủng VK10 CM4 CrK trình bày hình 3.8 Hình 3.8: Cây phát sinh chủng loại VK10 CM4 CrK Dựa vào kết xây dựng phát sinh loài chủng VK10 CM4 CrK thấy chủng VK10 CM4 CrK có quan hệ gần với chủng Pseudomonas fulva 2-5
Kết giải trình tự gen 16S rADN xây dựng phân loại chủng vi khuẩn Vk5CM5CrK Trình tự rADN 16S chủng Vk5CM5CrK sau giải trình tự xử lý phần mềm Bioedit nhận sau: TCGCTGGGGG CGGCGAGCGG CTGGAAACGG TCTTGCCATC GCGACGATCC AGACTCCTAC CATGCCGCGT GGTGAGGTTA TGCCAGCAGC CGCACGCAGG TTCGAAACTG ATGCGTAGAG CTCAGGTGCG ACGATGTCGA CGACCGCCTG CAAGCGGTGG ATCCAGAGAA TGGCTGTCGT TATCCTTTGT AGGAAGGTGG ACAATGGCGC CGCCTAACCA CGGACGGGTG TAGCTAATAC AGATGTGCCC CTAGCTGGTC GGGAGGCAGC GTATGAAGAA ATAACCTCAT CGCGGTAATA CGGTCTGTCA GCAGGCTAGA ATCTGGAGGA AAAGCGTGGG CTTGGAGGTT GGGAGTACGG AGCATGTGGT CTTTCCAGAG CAGCTCGTGT TGCCAGCGGT GGATGACGTC ATACAAAGAG TGCAAGTCGA AGTAATGTCT CGCATAACGT AGATGGGATT TGAGAGGATG AGTGGGGAAT GGCCTTCGGG CGATTGACGT CGGAGGGTGC AGTCGGATGT GTCTTGTAGA ATACCGGTGG GAGCAAACAG GTGCCCTTGA CCGCAAGGTT TTAATTCGAT ATGGATTGGT TGTGAAATGT TCGGCCGGGA AAGTCATCAT AAGCGACCTC GCGGCAGCGG GGGAAACTGC CGCAAGACCA AGCTAGTAGG ACCAGCCACA ATTGCACAAT TTGTAAAGTA TACCCGCAGA AAGCGTTAAT GAAATCCCCG GGGGGGTAGA CGAAGGCGGC GATTAGATAC GGCGTGGCTT AAAACTCAAA GCAACGCGAA GCCTTCGGGA TGGGTTAAGT ACTCAAAGGA GGCCCTTACG GCGAGAGCAA AAAGTAGCTT CTGATGGAGG AAGAGGGGGA TGGGGTAACG CTGGAACTGA GGGCGCAAGC CTTTCAGCGG AGAAGCACCG CGGAATTACT GGCTCAACCT ATTCCAGGTG CCCCTGGACA CCTGGTAGTC CCGGAGCTAA TGAATTGACG GAACCTTACC ACTCTGAGAC CCCGCAACGA GACTGCCAGT AGTAGGGCTA GCGGACCTCA GCTACTTTGC GGGATAACTA CCTTCGGGCC GCTCACCTAG GACACGGTCC CTGATGCAGC GGAGGAAGGC GCTAACTCCG GGGCGTAAAG GGGAACTGCA TAGCGGTGAA AAGACTGACG CACGCCGTAA CGCGTTAAGT GGGGCCCGCA TACTCTTGAC AGGTGCTGCA GCGCAACCCT GATAAACTGG CACACGTGCT TAAAGTGCGT 36 Kết BLASTn cho thấy, trình tự gen 16S rADN chủng Vk5CM5CrK có độ tương đồng cao với trình tự tương ứng chủng vi khuẩn thuộc chi Enterobacter (hình 3.9) [29] Hình 3.9: Kết so sánh trình tự 16S rADN chủng VK5CM5 CrK BLAST Trên sở so sánh độ tương đồng trình tự với chủng khác phần mềm BLAST, tiến hành xây dựng phát sinh loài chủng Vk5CM5CrK với chủng có độ tương đồng cao xếp theo thứ tự ưu tiên phần mềm BLAST Kết xây dựng phát sinh loài chủng VK5CM5CrK trình bày hình 3.10 Hình 3.10: Cây phát sinh chủng loại VK5CM5 CrK 37 Dựa vào kết xây dựng phát sinh loài chủng Vk5CM5CrK thấy chủng Vk5CM5CrK có quan hệ gần với chủng Enterobacter sp CZGRN4
Kết giải trình tự gen 16S rADN xây dựng phân loại chủng vi khuẩn VK5CS1TrK Trình tự rADN 16S chủng VK5CS1TrK sau giải trình tự xử lý phần mềm Bioedit sau: ATGACTTGAC GTTCCCCGGC CCCAACATTT AAGGCACCAA CGTTGCATCG AGTTTTAACC CACGCCTCAA CTAATCCTGT CCTTCGCCAC CCCCCCTCTA GATTTCACAT ACGCTTGCAC CGGGTAACGT TTACAACCCG TGCAATATTC GCTGGTCATC GTCATCCCCC CTAAACCGCT CACAACACGA TCCATCTCTG AATTAAACCA TTGCGGCCGT GGGCACAACC TTGCTCCCCA CGGTATTCCT CGAGACTCAA CCGACTTGAC CCTCCGTATT CAATCGACGC AAGGCCTTCT CCCACTGCTG CTCTCAGAAT ACACCTTCCT GGCAACAAAG GCTGACGACA GAAAGTTCTG CATGCTCCAC ACTCCCCAGG TCCAAGTCGA CGCTTTCGCA CCAGATCTCT GCCTGCCAGT AGACCGCCTG ACCGCGGCTG GGTTATTAAC TCATACACGC CCTCCCGTAG CGTATCGTAC CCCAGTTTAT GATAAGGGTT GCCATGCAGC TGGATGTCAA CGCTTGTGCG CGGTCGACTT CATCGTTTAC CCTGAGCGTC ACGCATTTCA TTCGGATGCA CGTGCGCTTT CTGGCACGGA CGCATCGCCT GGCATGGCTG GAGTCTGGAC GTACCGTAGT CAACTGGCAG GCGCTCGTTG ACCTGTCTCA GACCAGGGTA GGCCCCCGTC AACGCGTTAG GGCGTGGACT AGTCTTCGTC CCGCTACACC GTTCCCAGGT ACGCCCAGTA GTTAGCCGGT TCCTCCCCGC CATCAGGCTT CGTGTCTCAG CAATGGCA TCTCCTTTGA CGGGACTTAA CAGTTCCCCG AGGTTCTTCG AATTCATTTG CTCCGGAAGC ACCAGGGTAT CAGGGGGCCG TGGAATTCTA TGAGCCCGGG ATTCCGATTA GCTTCTTCTG TGAAAGTACT GCGCCCATTG TTCCAGTGTG Sau so sánh trình tự gen 16S rADN chủng VK5CS1TrK sở liệu gen NBCI phần mềm BLAST cho thấy chúng có độ tương đồng đến 99% với số chủng vi khuẩn thuộc chi Enterobacter, Salmonella Escherichia (hình 3.11) [29] Hình 3.11: Kết so sánh trình tự 16S rADN chủng Vk5CS1 TrK BLAST 38 Trên sở so sánh độ tương đồng trình tự với chủng phần mềm BLAST, tiến hành xây dựng phát sinh loài chủng VK5CS1TrK với chủng có độ tương đồng cao xếp theo thứ tự ưu tiên phần mềm BLAST Kết xây dựng phát sinh lồi chủng VK5CS1TrK trình bày hình 3.12 D ự Hình 3.12: Cây phát sinh loài chủng VK5CS1 Trk Dựa vào kết xây dựng phát sinh lồi chủng VK5CS1TrK thấy chủng VK5CS1TrK có quan hệ gần với chủng Enterobacter sp CZBSD2
Kết giải trình tự gen 16S rADN xây dựng phân loại chủng vi khuẩn Bx-101 CS1trk: AGTTTATCAC GGTTGCGCTC CAGCACCTGT CAAGACCAGG CGGGCCCCCG TTAACGCGTT ACGGCGTGGA TCAGTCTTCG CACCGCTACA CAGTTCCCAG TTACGCCCAG GAGTTAGCCG CTTCCTCCCC TGCATCAGGC ACCGTGTCTC TGGCAGTCTC GTTGCGGGAC CTCACAGTTC TAAGGTTCTT TCAATTCATT AGCTCCGGAA CTACCAGGGT TCCAGGGGGC CCTGGAATTC GTTGAGCCCG TAATTCCGAT GTGCTTCTTC GCTGAAAGTA TTGCGCCCAT AGTTCCAGTG CTTTGAGTTC TTAACCCAAC CCGAAGGCAC CGCGTTGCAT TGAGTTTTAA GCCACGCCTC ATCTAATCCT CGCCTTCGCC TACCCCCCTC GGGATTTCAC TAACGCTTGC TGCGGGTAAC CTTTACAACC TGTGCAATAT TGGCTGGTCA CCGGCCTAGC ATTTCACAAC CAATCCATCT CGAATTAAAC CCTTGCGGCC AAGGGCACAA GTTTGCTCCC ACCGGTATTC TACGAGACTC ATCCGACTTG ACCCTCCGTA GTCAATCGAC CGAAGGCCTT TCCCCACTGC TCCTCTCAGA CGCTGGCAAC ACGAGCTGAC CTGGCAAGTT CACATGCTCC GTACTCCCCA CCTCCAAGTC CACGCTTTCG CTCCAGATCT AAGCCTGCCA ACAGACCGCC TTACCGCGGC GCGGTTATTA CTTCATACAC TGCCTCCCGT CCA AAAGGATAAG GACAGCCATG CTGTGGATGT ACCGCTTGTG GGCGGTCGAC GACATCGTTT CACCTGAGCG CTACGCATTT GTTTCGGATG TGCGTGCGCT TGCTGGCACG ACCGCATCGC GCGGCATGGC AGGAGTCTGG Sau so sánh trình tự gen 16S rADN chủng Bx-101TrK sở liệu gen NBCI phần mềm BLAST cho thấy chúng có độ tương đồng đến 99% với nhiều chủng khác hình 3.13 [29] 39 Hình 3.13: Kết so sánh trình tự 16S rADN chủng Bx-101 CS1trk BLAST Sử dụng phần mềm MegAlign (của DNASTAR Lasergene.v7.1.0 PROPEREDGE) lập phân loại chủng Bx-101 CS1trk : Hình 3.14: Cây phát sinh chủng loại chủng Bx-101 CS1trk Kết hình 3.14 cho thấy chủng Bx-101 CS1trk quan hệ gần với chủng thuộc chi Enterobacter 40
Kết giải trình tự gen 16S rADN xây dựng phân loại chủng vi khuẩn CF III EH2cđ: CGTCAGACGA TGCTCCCTGA GGGATAACTC CATAAAAGGT GAGGTAACGG TGGGACTGAG GACGAAAGTC TGTTGTTAGG GAAAGCCACG CGGAATTATT GGCTCAACCG ATTCCACGTG TCTCTGGTCT CCTGGTAGTC GCTGCAGCTA AGGAATTGAC AGAACCTTAC GGCAGAGTGA TCCCGCAACG GACTGCCGGT GACCTGGGCT AGCCAATCCC CTGGAATCGC CACACCGCCC GGAGCCAGCC ACGCTGGCGG TGTTAGCGGC CGGGAAACCG GGCTTCGGCT CTCACCAAGG ACACGGCCCA TGACGGAGCA GAAGAACAAG GCTAACTACG GGGCGTAAAG GGGAGGGTCA TAGCGGTGAA GTAACTGACG CACGCCGTAA ACGCATTAAG GGGGGCCCGC CAGGTCTTGA CAGGTGGTGC AGCGCAACCC GACAAACCGG ACACACGTGC ACAAATCTGT TAGTAATCGC GTCACACCAC GCCGAAGTGG CGTGCNTAAT GGACGGGTGA GGGCTAATAC ACCACTTACA CGACGATGCG GACTCCTACG ACGCCGCGTG TGCCGTTCAA TGCCAGCAGC GGCTCGCAGG TTGGAAACTG ATGCGTAGAG CTGAGGAGCG ACGATGAGTG CACTCCGCCT ACAAGCGGTG CATCCTCTGA ATGGTTGTCG TTGATCTTAG AGGAAGGTGG TACAATGGAC TCTCAGTTCG GGATCAGCAT GAGAGTTTGT GACAGATGAT ACATGCAAGT GTAACACGTG CGGATGGTTG GATGGACCCG TAGCCGACCT GGAGGCAGCA AGTGATGAAG ATAGGGCGGC CGCGGTAATA CGGTTTCTTA GGGAACTTGA ATGTGGAGGA AAAGCGTGGG CTAAGTGTTA GGGGAGTACG GAGCATGTGG CAATCCTAGA TCAGCTCGTG TTGCCAGCAT GGGATGACGT AGAACAAAGG GATCGCAGTC GCCGCGGTGA AACACCCGAA TGGGGTG CGAGCGGACA GGTAACCTGC TCTGAACCGC CGGCGCATTA GAGAGGGTGA GTAGGGAATC GTTTTCGGAT ACCTTGACGG CGTAGGTGGC AGTCTGATGT GTGCAGAAGA ACACCAGTGG GAGCGAACAG GGGGGTTTCC GTCGCAAGAC TTTAATTCGA GATAGGACGT TCGTGAGATG TCAGTTGGGC CAAATCATCA GCAGCGAAAC TGCAACTCGA ATACGTTCCC GTCGGTGAGG GATGGGAGCT CTGTAAGACT ATGGTTCAGA GCTAGTTGGT TCGGCCACAC TTCCGCAATG CGTAAAGCTC TACCTAACCA AAGCGTTGTC GAAAGCCCCC GGAGAGTGGA CGAAGGCGAC GATTAGATAC GCCCCTTAGT TGAAACTCAA AGCAACGCGA CCCCTTCGGG TTGGGTTAAG ACTCTAAGGT TGCCCCTTAT CGCGAGGTTA CTGCGTGAAG GGGCCTTGTA TAACCTTTTA Chúng tơi sử dụng chương trình BLAST để so sánh trình tự đoạn gen chủng CF III EH2cđ với trình tự gen 16S ADN riboxom vi khuẩn khác đăng ký Ngân hàng gen quốc tế Kết cho thấy đoạn gen có độ tương đồng cao với gen 16S ADN riboxom chủng vi khuẩn Bacillus subtillis ( 100%) hinh 3.15 [29] 41 Hình 3.15: Kết so sánh trình tự 16S rADN chủng Bx-101 CS1trk BLAST Sử dụng phần mềm MegAlign (của DNASTAR.Lasergene.v7.1.0 PROPER EDGE) lập phân loại chủng CF III EH2cđ: Bacillus subtilis strain DmB55.seq CLû 301.seq CF III EH2cđ Bacillus subtilis strain DmB4 seq Bacillus sp LS-508.seq Bacillus subtilis strain K3-9.seq Bacillus subtilis strain S12.seq Bacillus subtilis strain 263ZG9.seq 172.4 160 140 120 100 80 60 40 Nucleotide Substitutions (x100) 20 Hình 3.16: Cây phát sinh chủng loại chủng CF III EH2cđ Kết hình 3.16 cho thấy chủng CF III EH2cđ có quan hệ gần với chủng Bacillus subtilis DmB4 DmB55 Chủng Bacillus subtilis DmB55 chủng có khả ức chế tăng trưởng Beauveria bassiana, tác nhân gây bệnh ngô phân lập Argentina Như vậy, số chủng tuyển chọn để định danh đến loài phương pháp giải trình tự gen 16S rADN, có 1chủng thuộc chi Pseudomonas (chủng VK10 CM4 CrK) chủng thuộc chi Bacillus (chủng CF III EH2cđ) Ba chủng 42 lại có trình tự gen 16S rADN tương đồng cao với trình tự gen 16S chủng vi khuẩn thuộc chi Enterobacter Pseudomonas spp vi khuẩn định cư hiệu rễ thực vật nhân tố kiểm soát sinh học chúng sản sinh kháng sinh chất trao đổi chống nấm hydrogen cyanide, siderophore gắn sắt, enzymes gluconase, enzymes phân hủy cellulose chitin Chủng P fluorescens khai thác để ức chế nguồn bệnh thực vật Chủng P aeruginosa chứng minh sinh chất diệt nấm HCN Chủng Pseudomonas sp biết sinh hợp chất bay Hiệu ức chế nhiều nguồn bệnh chủng Pseudomonas huỳnh quang báo cáo, có nguồn bệnh nấm Fusarium, Rhizoctonia [16,25] Bacillus subtilis biết đến vi sinh vật tiêu biểu có khả đối kháng tốt với nấm bệnh Hoạt tính đối kháng nghiên cứu thành cơng nhiều nước giới nghiên cứu Fernando đồng tác giả (2013) tác động B subtilis nấm bệnh, xác định điều kiện tăng sinh vi khuẩn Bacillus subtilis có hoạt tính kháng nấm Fang đồng tác giả (2013), ứng dụng B subtilis kiểm soát bệnh thối trái Gajbhiye đồng tác giả (2013) hay nghiên cứu chọn lọc tăng sinh B subtilis có khả đối kháng nấm bệnh Islam đồng tác giả (2012) Kết nghiến cứu Nguyễn Lý Nhơn Nguyễn Như Nhứt (2013) cho thấy bốn chủng B subtilis Ba02, Ba06, Ba39, Ba40 phân lập từ tự nhiên Việt Nam có hoạt tính đối kháng tốt với chủng nấm bệnh phổ biến (Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, F.oxysporum Phytopthora capsici) [5] Patkowska đồng tác giả (2014) thấy rằng, tác nhân kiểm soát sinh học vi khuẩn xạ khuẩn kết hợp, biểu gen kiểm soát sinh học chúng đối kháng tốt Như kết hợp vi khuẩn chi Bacillus / Paenibacillus xạ khuẩn Streptomyces làm tăng hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh thực vật lên nhiều [20] Ngoài ra, nghiên cứu số nhà khoa học giới Tenorio et al (2013); Babuet et al (2013) cho thấy, chủng vi khuẩn đối kháng thuộc chi Pseudomonas, Bacillus quan tâm chúng tổng hợp số chất trao 43 đổi ngoại bào có khả ngăn cản phát triển hệ sợi nấm Pythium sp., F.oxysporum Rhizoctonia solani Pseudomonas tổng hợp hơp chất ngoại bào syringomycin, syringostatin, syringotoxin, cepacin A, cepacin B, phenazine pyrrolnitrin Bacillus tổng hợp hợp chất surfacin, bacilysin, bacillomycin, mycobacillin Những hợp chất có hoạt tính kháng nấm chống lại R.solani F.oxysporum [23,24] Hiện sản phẩm sinh học từ chủng vi khuẩn đối kháng ngày nhà sản xuất quan tâm để kiểm soát nguồn bệnh nấm gây hại cho trồng Từ kết nghiên cứu cho thấy: năm chủng vi khuẩn tuyển chọn có khả ức chế phát triển số nấm gây bệnh thực vật F.oxysporum, F.solani Tuy nhiên để định hướng sử dụng chủng vi khuẩn đối kháng cho việc sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh hại tiêu cho mục đích khác cần phải có nghiên cứu độ an toàn chế phẩm khả sống sót bảo tồn hoạt tính chúng sau thời gian bảo quản 44 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ  Kết luận: Từ mẫu đất rễ khác tiêu bị bệnh đất trồng tiêu Tây Nguyên, phân lập 42 chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng với loại nấm bệnh F.oxysporum Rh.solani Trong số 42 chủng phân lập, 26 chủng có hoạt tính kháng F.oxysporum, 32 chủng kháng Rhizoctonia solani Đã tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng đồng thời nguồn nấm bệnh với đường kính vịng ức chế sinh trưởng nấm gây bệnh từ… đến … mm Các chủng tuyển chọn định danh đến loài kỹ thuật giải trình gen 16S rADN Kết nhận cho thấy chủng VK10 CM4CrK thuộc loài Pseudomonas fulva; chủng CFIII EH2cđ thuộc loài Bacillus subtilis; ba chủng VK5 CM5Crk, VK5 CS1TrK Bx-101 CS1 thuộc chi Enterobacter  Kiến nghị: Nghiên cứu sâu hai chủng VK10 CM4CrK CFIII EH2cđ nhằm đưa chúng vào sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng cho hồ tiêu Tây Nguyên để kiểm soát nấm gây bệnh nâng cao suất 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Cục Bảo vệ Thực vật (2007), Báo cáo tình hình sản xuất hồ tiêu ảnh hưởng loại dịch hại quan trọng tới sản xuất Việt Nam, Hội thảo sâu bệnh hại tiêu biện pháp phịng trừ, Đắc Nơng, tháng 7/2007 Cục xúc tiến thương mại(2011), Vị trí địa lý điều kiện tự nhiên Vùng kinh tế Tây Nguyên – Phần Đồn Nhân Ái (2007), Một số ngun tắc phịng trừ bệnh chết nhanh tiêu, Diễn Đàn khuyến nông công nghệ lần thứ 5, chuyên đề giải pháp kỹ thuật nâng cao suất, chất lượng giá trị hồ tiêu, tr 92-107 Ngô Vĩnh Viễn (2007), Báo cáo dịch hại hồ tiêu biện pháp phòng trừ, Hội thảo sâu bệnh hại tiêu biện pháp phịng trừ, Đắc Nơng, tr 1-8 Nguyễn Lý Nhơn, Nguyễn Như Nhứt (2013), “Khảo sát khả đối kháng nấm bệnh trồng ảnh hưởng điều kiện tăng sinh số chủng phân lập Việt Nam”, Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2013, 2, tr 445-449 Nguyễn Tăng Tôn ( 2005), Báo cáo tổng kết đề tài cấp Nhà nước: Nghiên cứu giải pháp khoa học công nghệ thị trường để phát triển vùng hồ tiêu nguyên liệu phục vụ chế biến xuất khẩu, mã số KC.06.11.NN, thuộc Chương trình KC06 Phạm Thị Thúy Hoài (2012), đề tài “Nghiên cứu sản xuất sử dụng số chế phẩm sinh học nhằm nâng cao suất hồ tiêu Quảng Trị” Phạm Thanh Sơn (2004), Xác định loài tuyến trùng Meloidogyne rễ hồ tiêu tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu phòng trị Meloidogyne spp phân hữu cơ, Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Đại học Nơng lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Tuyến tập sách “Sâu hại trồng 101 câu hỏi thường gặp sản xuất nông nghiệp- tập 4” 10 Tôn Nữ Tuấn Nam (2007), Một số giải pháp kỹ thuật để phát triển sản xuất hồ tiêu bền vững vùng Tây Nguyên, Diễn Đàn khuyến nông công nghệ 46 lần thứ 5, chuyên đề giải pháp kỹ thuật nâng cao suất, chất lượng giá trị hồ tiêu, tr: 43-50 11 Trần Kim Loang ( 2007), Một số ý kiến phòng trừ sâu, bệnh hại rễ hồ tiêu Tây Nguyên, Tài liệu Hội thảo sâu bệnh hại tiêu biện pháp phòng trừ, Cục Bảo vệ Thực vật, Dak Nơng 12 Trích từ “Tổng quan dịch hại tiêu phát sinh từ đất” Viện khoa học kĩ thuật nông nghiệp miền Nam Tài liệu tiếng Anh: 13 A Study on Pollen viability of Piper colubrinum Link, Journal of Agricultural Science and Technology B (2012) 1177-1183 Earlier title: Journal of Agricultural Science and Technology, ISSN 1939-1250 14 Achievements, challenges & solution in black (Piper nigrum L.) production in Viet Nam, Bui Chi Buu, Institute of Agricultural Sciences for Southern Vietnam, 2014 15 Babu G P and Paramageetham C (2013), “Biocontrol of Sclerotium rolfsii – a polyphagous plant pathogen by Pseudomonas aeruginosa isolated from forest litter International”, Journal of Research in Plant Science 3: 1-4 16 Barbara, S., Andre, D ( 2001), Practical guide to detection and identification of Phytophthora spp., version 1.0, CRC for Tropical Plant Protection, Brisbane, Australia 17 Djebi, M (1990), “Characterization of Fusarium oxysporum f.sp albedinis, the causal agent of bayoudh disease on the basis of vegetative compatibility”, In: Proceedings of the Eighth Congress of the Mediterranean Phytopahological Union, Agadir, Moroco, p.533 18 Eng, L ( 2001), Biological control of root-knot nematodes, (Meloidogyne species) on black pepper (Piper nigrum L.) in Sarawak, PhD thesis The University of Reading, UK 19 Eng, L (2002), Viral disease and root-knot nematode problems of black pepper (Piper nigrum L.) in Sarawak, Malaysia Paper presented at the Symposium on Pests and Diseases on Pepper Sarawak, Malaysia 47 20 Patkowska E., Konopiński M (2014), “Antagonistic bacteria in the soil after cover crops cultivation”, Plant Soil Environ, Vol 60, No 2: 69–73 21 Pathogen profile created by Paulo Ceresini as one of the requirements of the course PP - 728 Soilborne Plant Pathogens, offered on Spring 1999 22 Prasanna Kumar C [2012], “Culture independent survey of marine bacterial community from OMZ of southeast coast of India”, Submitted (05-JUN2012) Center of Advanced Study in Marine Biology, Faculty of Marine Science, Annamalai University, Annankovil Road,Parangipettai, Tamil Nadu 608502, India 23 Tenorio-Salgado S, Raunel Tinoco, Rafael Vazquez-Duhalt, Jesus CaballeroMellado and Ernesto Perez-Rueda (2013), “Identification of volatile compounds produced by the bacterium Burkholderia tropica that inhibit the growth of fungal pathogens”, Bioengineered 4: 236–243 24 Tsao, P.H and Alizadeh, A (1988), “Recent advances the taxonomy and nomenclature of the so- called ‘Phytophthora palmivora’ MF4 occurring on cocoa and other tropical crops”, In: Proceedings of the 10th International Cocoa Research Conference, Santo Domingo, pp: 17-23 25 Tsao, P.H., Kasim, R and Mustika, I (1985), “Morphology and identity of black pepper isolates in Indonesia”, FAO Plant Protection Bulletin (33): 61-66 26 Tran Thi Thu Ha (2007), Interactions between biosurfactant-producing Pseudomonas and Phytophthora species PhD thesis Wageningen University, The Netherland 27 Wong, Mee-Hua ( 2002), Fungal diseases of black pepper and their management in Sarawak, Malaysia Paper presented at the Symposium on Pests and Diseases on Pepper Sarawak, Malaysia  Trang web tham khảo: 28 http://www.caytieuvn.com 29 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 48 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết số liệu nghiên cứu trình bày luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ việc thực luận văn cảm ơn, thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Sinh viên Nguyễn Hồng Hạnh 49