Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn trên cây đinh lăng có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây nhiễm trùng huyết

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN    NGUYỄN THỊ TRANG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN TRÊN CÂY ĐINH LĂNG CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY NHIỄM TRÙNG HUYẾT LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội – 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN    NGUYỄN THỊ TRANG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN TRÊN CÂY ĐINH LĂNG CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY NHIỄM TRÙNG HUYẾT Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN VĂN HIẾU TS MAI THỊ ĐÀM LINH LỜI CẢM ƠN Lời em xin phép gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Văn Hiếu, Phịng Vi sinh vật Đất, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tận tình bảo em suốt trình học tập, nghiên cứu thực đề tài Đồng thời em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Mai Thị Đàm Linh, Bộ môn Vi sinh vật học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy hướng dẫn em tận tình trình thực đề tài, giúp em vượt qua khó khăn hoàn thành tốt luận văn Đồng thời em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới anh chị, bạn bè Phòng Vi sinh vật Đất, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ủng hộ, giúp đỡ để em hoàn thành tốt đề tài Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn cung cấp cho em kiến thức bổ ích suốt hai năm học vừa qua giúp đỡ em nhiều việc nắm bắt kiến thức động viên em lớn mặt tinh thần Em xin gửi lời cảm ơn hỗ trợ kính phí từ đề tài Nhánh số hợp đồng 27/HĐ-VCNMT: “Đánh giá độ an toàn hạt nano kim loại đến vi sinh vật, tuyến trùng số tiêu quan trọng đất trồng nông nghiệp” thuộc Hợp phần IV: “Nghiên cứu chế tác động đánh giá an toàn sinh học chế phẩm nano nghiên cứu dự án”, mã số: VAST.TĐ.NANO.04/15-18 đề tài “Phân lập chủng xạ khuẩn có khả kháng khuẩn vùng rễ thuốc đinh lăng sâm (núi Giàng, Bắc Giang) định hướng ứng dụng y học mã số: CNSH 2014 Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình thân yêu bạn bè bên, động viên, giúp đỡ em suốt thời gian học tập thực luận văn Hà Nội, ngày 25 tháng 12 năm 2020 Học viên Nguyễn Thị Trang MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Bệnh nhiễm trùng huyết 1.1.1 Tình hình nhiễm trùng huyết giới Việt Nam 1.1.2 Nguyên nhân gây nhiễm trùng huyết 1.2 Xạ khuẩn 1.2.1 Xạ khuẩn – xạ khuẩn nội sinh 1.2.2 Phân lập xạ khuẩn nội sinh 1.2.3 Đặc điểm sinh học xạ khuẩn 1.2.4 Phân loại xạ khuẩn 11 1.2.5 Sự sinh tổng hợp kháng sinh 11 1.2.6 Vai trò xạ khuẩn nội sinh 12 1.2.6.1 Cơ chế nội sinh xạ khuẩn với thực vật 12 1.2.6.2 Vai trò xạ khuẩn 13 1.3 Cây đinh lăng xạ khuẩn nội sinh 15 1.3.1 Cây đinh lăng 15 1.3.2 Tìm kiếm, phân loại xạ khuẩn sinh chất kháng sinh nội sinh đinh lăng 16 1.3.3 Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh 17 1.3.3.1 Nghiên cứu điều kiện lên men 17 1.3.3.2 Thu nhận kháng sinh 19 1.3.4 Tình hình nghiên cứu chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh 19 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 22 2.1.1 Vật liệu 22 2.1.2 Hóa chất 22 2.1.3 Thiết bị 23 2.1.4 Môi trường 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Phân lập xạ khuẩn từ đinh lăng 24 2.2.2 Phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc mọc đĩa thạch .24 2.2.3 Phương pháp khiết bảo quản giống 25 2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn 25 2.2.5 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại xạ khuẩn 26 2.2.6 Xác định sinh khối 27 2.2.7 Phân tích trình tự 16S rRNA xạ khuẩn 27 2.2.8 Phương pháp điện di gel agarose 29 2.3 Phương pháp lên men 29 2.3.1 Nhân giống 29 2.3.2 Lựa chọn mơi trường lên men thích hợp 29 2.3.3 Xác định điều kiện lên men sinh tổng hợp kháng sinh 30 2.4 Tách chiết chất kháng sinh từ dịch lên men 30 2.4.1 Xác định khả bền nhiệt độ pH CKS 30 2.4.2 Đánh giá khả chiết dung môi 30 2.4.3 Đo phổ hồng ngoại sản phẩm sau trình tách chiết 31 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn từ mẫu thu thập 32 3.1.1 Phân lập chủng xạ khuẩn từ mẫu đinh lăng .32 3.1.2 Tuyển chọn chủng có hoạt tính kháng khuẩn 34 3.2 Nghiên cứu phân loại chủng xạ khuẩn tuyển chọn 39 3.2.1 Đặc điểm nuôi cấy 39 3.2.2 Đặc điểm hình thái bào tử 44 3.2.3 Khả sử dụng nguồn cacbon 46 3.2.4 Phân loại chủng xạ khuẩn dựa trình tự 16S rRNA 49 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khả sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng xạ khuẩn 15 50 3.3.1 Ảnh hưởng môi trường lên men 50 3.3.2 Ảnh hưởng pH 52 3.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ 54 3.3.4 Ảnh hưởng tỷ lệ giống 55 3.3.5 Ảnh hưởng thể tích dịch lên men 57 3.3.6 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 59 3.4 Tách chiết chất kháng sinh từ dịch lên men chủng Streptomyces sp.15 61 3.4.1 Khả tách chiết kháng sinh dung môi 61 3.4.2 Ảnh hưởng pH nhiệt độ đến đặc tính chất kháng sinh có dịch lên men 63 3.4.3 Kiểm tra phổ hấp thụ hồng ngoại chất kháng sinh 66 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 Kết luận 67 Kiến nghị 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 PHỤ LỤC 75 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Một số thiết bị hay sử dụng nghiên cứu .23 Bảng 2.2 Trình tự đoạn mồi sử dụng phản ứng PCR khuếch đại trình tự 16S rRNA 28 Bảng 3.1 Số lượng xạ khuẩn có mẫu đinh lăng thu thập .32 Bảng 3.2 Số lượng tỷ lệ chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng lại vi sinh vật kiểm định 35 Bảng 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn chủng xạ khuẩn với vi sinh vật kiểm định 36 Bảng 3.4 Kết hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính enzyme có dịch sau lên men chủng xạ khuẩn 38 Bảng 3.5 Đặc điểm nuôi cấy chủng xạ khuẩn sau 14 ngày ni cấy .40 Bảng 3.6 Đặc điểm hình thái bào tử chủng xạ khuẩn sau 14 ngày nuôi môi trường thạch đĩa ISP2 300C 45 Bảng Khả sử dụng nguồn cacbon chủng xạ khuẩn sau thời gian ngày nuôi 300C 48 Bảng 3.8 Kết so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA chủng 15 với gen tương ứng chủng xạ khuẩn đăng ký GenBank 50 Bảng 3.9 Ảnh hưởng môi trường đến khả sinh trưởng sinh hoạt chất kháng khuẩn chủng Streptomyces sp.15 51 Bảng 3.10 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng sinh chất kháng khuẩn chủng Streptomyces sp.15 53 Bảng 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng sinh chất kháng khuẩn chủng Streptomyces sp.15 55 Bảng 3.12 Ảnh hưởng tỉ lệ giống đến sinh trưởng sinh chất kháng khuẩn chủng Streptomyces sp.15 56 Bảng 3.13 Ảnh hưởng độ thơng khí đến sinh trưởng sinh chất kháng khuẩn chủng Streptomyces sp.15 58 Bảng 3.14 Ảnh hưởng thời gian đến sinh trưởng sinh chất kháng khuẩn chủng Streptomyces sp.15 60 Bảng 3.15 Khả chiết chất kháng khuẩn có dịch lên men chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.15 dung môi 62 Bảng 3.16 Ảnh hưởng thời gian nhiệt độ đến độ bền hợp chất kháng khuẩn có dịch sau lên men chủng Streptomyces sp.15 64 Bảng 3.17 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính kháng khuẩn có dịch sau lên men chủng Streptomyces sp.15 65 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Củ đinh lăng 15 Hình 3.1 Các mẫu rễ, thân, đinh lăng dùng nghiên cứu 33 Hình 3.2 Các chủng xạ khuẩn phân lập 33 Hình 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn chủng xạ khuẩn phân lập từ mẫu đinh lăng 34 Hình 3.4 Khả kháng lại vi khuẩn S aureus chủng xạ khuẩn phân lập từ đinh lăng 37 Hình 3.5 Khả kháng khuẩn dịch lên men từ chủng xạ khuẩn phân lập từ đinh lăng hai chủng vi khuẩn S aureus E coli 38 Hình 3.6 Hình thái khuẩn lạc chủng xạ khuẩn sau 14 ngày nuôi cấy môi trường khác 43 Hình 3.7 Hình thái cuống sinh bào tử chủng xạ khuẩn kính hiển vi quang học (x40) 44 Hình 3.8 Hình thái cuống sinh bào tử chủng xạ khuẩn quan sát kính hiển vi điện tử (x 7500) 45 Hình 3.9 Khả sinh trưởng nguồn đường chủng xạ khuẩn sau ngày nuôi nhiệt độ 300C 47 Hình 3.10 Điện di đồ DNA tổng số gen agarose 1% chủng 15 .49 Hình 3.11 Điện di đồ sản phẩm PCR gel agarose 1% Băng M: thang DNA chuẩn; Đường chạy 2: sản phẩm PCR gen 16S rRNA từ DNA tổng số chủng 15 49 Hình 3.12 Ảnh hưởng pH môi trường ISP2 ban đầu đến khả sinh trưởng chủng Streptomyces sp.15 52 Hình 3.13 Khả kháng vi khuẩn S aureus BN1 dịch sau lên men chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.15 nuôi MT ISP2 pH khác 53 Kết thí nghiệm trình bày hình 3.18 3.19, cho thấy 24 đầu, sinh khối chủng tăng nhanh, chủng sử dụng chất dinh dưỡng cho trình phát triển Chất kháng sinh bắt đầu hình thành sau 48 giờ, sau tăng dần đạt cực đại 96 ÷ 120 lên men, với đường kính vịng kháng khuẩn từ 32,15 ÷ 33,01 mm sinh khối thu 5,7 ÷ 5,6 mg/ml Như 96 ÷ 120 thời điểm thích hợp để thu hồi CKS, kéo dài thêm hoạt tính kháng khuẩn chủng bị giảm xuống Theo nghiên cứu khác lên men thu nhận chất kháng sinh chủng xạ khuẩn khẳng định đa số chủng xạ khuẩn, thời gian thu chất kháng sinh ÷ ngày lên men [14, 35, 51], thời gian ÷ ngày lên men chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.15 phù hợp với kết 3.4 Tách chiết chất kháng sinh từ dịch lên men chủng Streptomyces sp.15 3.4.1.Khả tách chiết kháng sinh dung môi Chất kháng sinh xạ khuẩn Streptomyces sp.15 sinh tiết vào MT lên men Để tách chiết chất kháng sinh khỏi dịch lên men tinh phải qua nhiều cơng đoạn có sử dụng dung mơi chất hấp phụ điều kiện pH nhiệt độ khác Khả bền nhiệt pH CKS có ảnh hưởng đến trình tách chiết bảo quản sau Do cần nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ pH, dung mơi tách chiết đến hoạt tính chất kháng sinh có dịch lên men Thử khả hấp phụ số dung môi thường sử dụng tách chiết, tinh sạch, nhả hấp phụ CKS cloroform, ethylacetat Kết xác định hoạt tính kháng khuẩn sau chiết sang dung môi kiểm tra phương pháp khoanh giấy lọc kết trình bày bảng 3.15 Bảng 3.15 Khả chiết chất kháng khuẩn có dịch lên men chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.15 dung mơi Dung mơi Đường kính vịng kháng khuẩn (D-d, mm) (± 0,02 mm) Cloroform 11,27 Isopropyl acohol 14,02 1,4- dioxin 14,01 Ethylacetat 18,55 Aceton 25,39 n-butyl acetone 13,24 Dịch lên men 25,05 Hình 3.20 Khả kháng vi khuẩn S aureus BN1 kiểm định hợp chất thu từ sau chiết dung môi khác Với dung mơi sử dụng cho q trình tách chiết, sau cơng đoạn tinh cịn sử dụng cho trình nhả hấp phụ chất kháng sinh sử dụng chất hấp phụ than hoạt tính, Wofatit KPS, cation, anion diatomit Kết hình 3.20 cho thấy, aceton ethylacetat có khả tách chiết tốt chất kháng sinh từ dịch lên men vào dung mơi với hoạt tính kháng khuẩn cao đường kính vịng kháng khuẩn 25,39 mm Đây dung môi hữu nhẹ, dễ bay hơi, độc hại khơng hút ẩm, dùng rộng rãi làm dung môi cho phản ứng hóa học để thực cơng việc chiết, tinh kháng sinh Dung môi sử dụng thành công tách chiết dịch chất kháng sinh từ xạ khuẩn vài báo cáo trước [4, 7, 11,14] Đặc biệt aceton cho tỷ lệ tách chiết thành cơng cao dung mơi cịn lại nghiên cứu, hoạt tính sinh học hợp chất có dịch lên men xạ khuẩn Streptomyces sp.15 bền dung môi 3.4.2 Ảnh hưởng pH nhiệt độ đến đặc tính chất kháng sinh có dịch lên men Khả bền nhiệt pH CKS có ảnh hưởng đến trình tách chiết, tinh bảo quản sau Do cần nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ pH đến đặc tính chất kháng sinh có dịch sau lên men nhiệt độ 30, 45; 80 100oC thời gian 120 phút Các pH điều chỉnh bao gồm 3; 10 sau giữ nhiệt độ 60oC thời gian 60 phút Kết thử hoạt tính kháng khuẩn có dịch lên men nhiệt độ thời gian trình bày bảng 3.16; 3.17 hình 3.21 3.22 Bảng 3.16 Ảnh hưởng thời gian nhiệt độ đến độ bền hợp chất kháng khuẩn có dịch sau lên men chủng Streptomyces sp.15 Thời gian (phút) Đường kính vịng kháng khuẩn (D-d, mm) (± 0,02 mm) hợp chất kháng khuẩn trì nhiệt độ khác (0C) 30 45 80 100 32,12 32,16 32,07 32,01 30 32,09 32,25 32,18 30,07 60 32,16 32,19 32,14 30,11 90 32,23 32,38 31,00 28,59 120 32,06 32,17 30,16 26,26 Hình 3.21 Khả kháng vi khuẩn S aureus BN1 kiểm định chất kháng khuẩn có dịch lên men chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.15 nhiệt độ khác theo thời gian Kết bảng 3.16 cho thấy, chất kháng sinh có dịch lên men chủng Streptomyces sp.15 bền với nhiệt, nhiệt độ 45oC sau hoạt tính gần khơng thay đổi, nhiệt độ 80oC sau hoạt tính giảm khoảng gần (7%) so với ban đầu Kết thử đánh giá độ bền pH cho thấy, chất kháng sinh có dịch lên men bền pH axit đến trung tính, pH 10 hoạt tính kháng khuẩn cho thấy giảm nhanh lại 50% sau Bảng 3.17 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính kháng khuẩn có dịch sau lên men chủng Streptomyces sp.15 Hình 3.22 Khả kháng vi khuẩn S aureus BN1 kiểm định hợp chất có dịch lên men chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.15 pH khác theo thời gian 3.4.3.Kiểm tra phổ hấp thụ hồng ngoại chất kháng sinh Chất kháng sinh tách chiết làm sơ từ MT lên men cho chạy phổ hồng ngoại (IR) Phổ hồng ngoại ghi dạng viên nén KBr máy FT–IR Impact 410 đo Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Kết chạy phổ hồng ngoại cho thấy, đỉnh (pic) liên kết có cấu trúc chất kháng sinh thể hình 3.23 96 90 85 424.69cm-1 80 3797.86cm-1 75 % T 70 2355.22cm-1 1034.55cm-1 2067.81cm-1 3849.65cm-1 607.84cm-1 1398.16cm-1 65 666.96cm-1 60 55 3644.56cm-1 1650.33cm-1 3385.02cm-1 50 49 4000 3500 3000 2500 2000 1750 cm-1 1500 1250 1000 750 500 400 Hình 3.23 Phổ hồng ngoại chất kháng sinh có dịch sau lên men chủng Streptomyces sp.15 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ 12 mẫu rễ, thân đinh lăng phân lập 20 chủng xạ khuẩn, sàng lọc chủng xạ khuẩn 3.6.1; 12.2; 12.3 15 có hoạt tính kháng khuẩn kháng lại nhiều vi khuẩn gây nhiễm trùng đường huyết Bốn chủng xạ khuẩn nghiên cứu phân loại gồm đặc điểm sinh trưởng, khả sử dụng nguồn cacbon, đặc điểm bào tử cho thấy chủng thuộc chi Streptomyces Chủng 15 phân tích trình tự 16S rRNA cho thấy có độ tương đồng cao 99% với chủng: Streptomyces parvulus; Streptomyces costaricanus; Streptomyces olivaceus; Streptomyces tendea; Streptomyces limocidini Đã nghiên cứu quy mô phịng thí nghiệm khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces sp.15 cho thấy: Mơi trường thích hợp cho sinh kháng sinh ISP2; nhiệt độ 30 ÷ 37°C; pH ÷ 8; tỉ lệ tiếp giống 2%; thể tích mơi trường lên men 80 ml/500 ml thời gian thích hợp 96 Bước đầu tách chiết chất kháng sinh từ dịch lên men chủng Streptomyces sp.15 cho thấy hiệu cao dung mơi aceton, chất kháng sinh có dịch lên men bền nhiệt độ 80 100°C thời gian Kiến nghị Tiếp tục tối ưu hóa điều kiện lên men để nâng cao khả sinh tổng hợp kháng sinh Tìm quy trình tách chiết tinh tối ưu để thu nhận chất kháng sinh tinh khiết để xác định cấu trúc TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trịnh Thới An (2014), “Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh chất kháng nấm Pythium sp”, Tạp chí Khoa học Phát triển, 12(5), tr 656-664 Bệnh viện Nhiệt Đới Trung Ương, Khoa xét nghiệm, tài liệu giám sát năm 2012 Biền Văn Minh, Kiều Hữu Ảnh, Phạm Ngọc Lan, Phạm Hồng Sơn, Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị Thu Thủy (2006), Vi sinh vật học, NXB Đại học Huế Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 1, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2007), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Nữ Kim Thảo (2006), “Các nhóm vi khuẩn chủ yếu”, http://vietsciences.free.fr Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 2, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Bùi Đại, Nguyễn Văn Mùi, Nguyễn Hoàng Tuấn (2002), “Nhiễm trùng huyết sốc nhiễm khuẩn” Bệnh học truyền nhiễm Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 11-16 Lê Đăng Hà Phạm Văn Ca (1999), “Tình hình kháng thuốc số vi khuẩn gây bệnh Đơng Nam Á năm 1997” Sự kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh, Viện Y học lâm sàng bệnh nhiệt đới NXB y học Hà Nội, tr 3-6 10 Nguyễn Thị Hà, Phạm Hồng Nhung (2017), Tình hình nhiễm nấm máu Bệnh viện Bạch Mai từ tháng 1/2016 đến tháng 10/2016, Tạp chí Nghiên cứu Y học, 2, tr 15-21 11 Bùi Thị Việt Hà (2006), “Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam”, Luận án Tiến sĩ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội 12 Bùi Khắc Hậu nhóm tác giả (2008); “Dịch tễ học phân tử chủng Pseudomonas aeruginosa đa kháng thuốc nhiễm trùng bệnh viện Hà Nội”; Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp Bộ Y Tế, Đại học Y Hà Nội 13 Trần Văn Hưng - Trần Hữu Luyện “Tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn nặng bệnh viện trung ương Huế 1997-1998” Một số công trình NCKH độ nhạy cảm vi khuẩn với thuốc kháng sinh 1997-1999, Tạp chí y Học Lâm sàng, tr 122-124 14 Lê Gia Hy (1994), “Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập Việt Nam”, Luận án phó tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Trung tâm Khoa học Tự nhiên Công nghệ Quốc gia, Hà Nội 15 Dương Minh Lam, Đặng Ngọc Quang Nguyễn Thị Hà (2013), “Tách chiết, tinh nghiên cứu đặc điểm kháng sinh từ xạ khuẩn Streptomyces sp QN63 chống Staphylococcus aureus nhờn kháng sinh”, Tạp chí Khoa học cơng nghệ, 51(5), tr 555-563 16 Phạm Thị Lan (2017) “Đặc điểm trường hợp nhiễm khuẩn huyết liên quan đường tĩnh mạch trung tâm Bệnh viện Đại học Y dược Thành Phố Hồ Chí Minh năm 2017” Hội Y học Thành phố Hồ Chí Minh, tr 35-39 17 Đỗ Tất Lợi (2015), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Nhà xuất Thời Đại, tr 828-830 18 Cao Minh Nga (2009), "Các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết đề kháng kháng sinh", Tạp chí Y học TpHCM 13, tr 256-261 19 Vũ Thị Hạnh Nguyên, Chu Kỳ Sơn, Phí Quyết Tiến (2018), “Phân loại nghiên cứu đặc tính xạ khuẩn nội sinh YBQ75 phân lập từ quế Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 16(1), tr 149-155 20 Đồn Mai Phương cộng (2010), "Đặc điểm tác nhân gây nhiễm trùng máu bệnh viện Bạch Mai năm 2008", Tạp chí Y học lâm sàng, 48, tr 32-38 21 Lê Thị Thu Thảo (2001), "Một số đặc điểm dịch tễ, lâm sàng vi trùng học nhiễm trùng huyết Gram âm", Tạp chí Y học thực hành, 2, tr 6-11 22 PhanThị Hồng Thảo, Nguyễn Vũ Mai Linh, Nguyễn Thị Hồng Liên, Nguyễn Kiều Băng Tâm, Nguyễn Văn Hiếu (2016), “Xạ khuẩn nội sinh Streptomyces parvulus HNR3X4 bưởi Diễn Hà Nội tiềm sinh tổng hợp chất kháng khuẩn” Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 32 (1S), tr 327-333 23 Trần Thị Thanh Thư, Phùng Nguyễn Thế Nguyên (2018) “Vi khuẩn tính đề kháng kháng sinh trẻ em nhiễm khuẩn huyết khoa cấp cứu-hồi sức tích cực chống độc Bệnh viện Nhi Đồng 1”, Hội nghị khoa học Nhi khoa Toàn quốc, Y học lâm sàng, tr 14-17 24 Trịnh Thị Trang, Kim Văn Vạn, Trương Đình Hồi, Nguyễn Thanh Hải, Nguyễn Văn Giang, Nguyễn Ngọc Tuấn (2016), “Phân loại đánh giá hoạt tính kháng khuẩn xạ khuẩn nội cộng sinh màng tang (Litsea cubeba) vi khuẩn gây bệnh cá chép rô phi” Tạp chí KH Nơng nghiệp Việt Nam, 14 (12), tr 1886-1893 25 Đào Tuyết Trinh, Nguyễn Vũ Trung (2009), “Nghiên cứu nguyên vi khuẩn, nấm gây nhiễm khuẩn huyết tính nhạy cảm với kháng sinh chủng phân lập viện bệnh truyền nhiễm nhiệt đới quốc gia từ 1/2007 – 12/2007”, Tạp chí Y học thực hành số 4, tr 31-33 26 Nguyễn Vũ Trung (2009), Acinetobacter, Vi khuẩn y học, NXB Giáo dục Việt Nam, Hà Nội, tr 319-336 27 Khưu Phương Anh Yến (2016), “Nghiên cứu xạ khuẩn có khả đối kháng nấm gây bệnh đạo ôn lúa phân lập từ đất huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang”, Tạp chí khoa học Trường Đại học An Giang, 11(3), tr 72-82 Tiếng Anh 28 Bacon C W., White J F (2000), “Microbial endophytes”, Marcel Dekker, New York 29 Berg G., Hallmann J (2006), "Control of plant pathogenic fungi with bacterial endophytes", Springer Berlin Heidelberg, Berlin, Heidelberg, pp 53-69 30 Bressan W., Borges M T (2004), "Delivery methods for introducing endophytic bacteria into maize", Biocontrol, 49(3), pp 315-322 31 Chamberland S., Julie L., Celine L., Marthe B., Pierre P., Michel G B (1992), “Antibiotic susceptibility profiles of 941 Gram negative bacteria isolated from septicemie patients throughout Canada”, Clinical Infectious Diseases, 15 (4), pp 615-628 32 Chiang T.M., Chang T.Y (1991), “Pediatric bacteremia strains grow in blood culture media”, Zhonghua Yi Xue Za Zhi (taipei), 47(1), pp 39-44 33 Gangwar M., Dogra S., Sharma N (2011), “Antagonistic Bioactivity of Endophytic Actinomycetes Isolated from Medicinal Plants”, Journal of Advanced Laboratory Research in Biology, 2(4), pp 154-157 34 Gangwar M., Urmila G P S D., Ravindra N K (2014), “Diversity and biopotential of endophytic actinomycetes from three medicinal plants in India”, African Journal of Microbiology Research, 8(2), pp 184-191 35 Gulve R.M., A.M Deshmukh (2012), “Antimicrobial activity of the marine actinomycetes”, International Multidisciplinary Research Journal, 2(3), pp 16-22 36 Hadacek F., Greger H (2000), “Testing of antifungal natural products: methodologies, comparability of results and assay choice”, Phytochemcal Analysis, 11, pp 137-147 37 Hallmann J (2001), "Plant interactions with endophytic bacteria", in Jeger M.J., Spence N.J., Editors, Biotic interactions in plant-pathogen associations, CABI Publishing, Wallingford, UK, pp 87-119 38 Hallmann J., Davies K G., Sikora R (2009), "Biological control using microbial pathogens, endophytes and antagonists", in Perry R.N., Moens M., Starr J.L., Root-knot nematodes, CABI Publishing, GB 39 Hallmann J., Quadt H., A Mahafee W.F., Kloepper J.W (1997), "Bacterial endophytes in agricultural crops ", Cannadian Journal Microbiology, 43, pp 895-914 40 Hilmar W., Tammy B., Sandra M T., Harald S., Richard P W., Michael B E (2004), “Nosocomial Bloodstream Infections in US Hospitals: Analysis of 24,179 Cases from a Prospective Nationwide Surveillance Study”, Clinical Infectious Diseases, 39, pp 309 - 317 41 Hamilton Miller J M (1973), “Chemistry and biology of the polyene macrolide antibiotics”, Bacteriological reviews, 37(3), pp 166-196 42 Ismet A., Bukhari N.A., Perveen K., Bakir M A (2012), “Antifungal activity of some actinomycetes isolated from riyadh soil, Saudi Arabia: An evaluation for their ability to control Alternaria caused tomato blight in green house pot trial”, African Journal of Agricultural research, 7(3), pp 20422050 43 Jingle L., Zhinan X., Tongfeng L., Jianping L., Peilin C (2008), “Effects of cultivation conditions on the production of natamycin with Streptomyces gilvosporeus LK196”, Enzyme Microbial Technology, 42(2), pp 145-150 44 Jason P , Younsuck K., Bin D., Yao Q.T., Jigeeshu V D., Cheng C T., Charles D G., Mohammad O F., Babu R S., Nguyen G B., Yaseen M A., Nawal S., Bambang W., Mei L.T., Ahmad Y H A W., Akmal A H., Masaji N., Mark P., Yiong H C., MOSAICS Study Group (2011), "Management of severe sepsis in patients admitted to Asian intensive care units: prospective cohort study", British Medical Journal, 3, pp 342-345 45 Jeffrey E J., Guy T C (2010), "Biosynthetic potential of phylogenetically unique endophytic actinomycetes from tropical plants", Applied Environmental microbiology, 76(13), pp 4377-4386 46 Jóeph M., Juliana L M., Mark F., John R P., Amelia A L., Robert P D., George P (2009), “Mortality, length of hospitalization and costs associated with invasive fungal infections in high-risk patients”, American Society of Health-System Pharmacists, 66, pp 1711 - 1717 47 McInroy J A., Kloepper J W (1995), "Survey of indigenous bacterial endophytes from cotton and sweet corn", Plant and Soil, 173(2), pp 337342 48 Miliute I., Buzaite O., Baniulis D., Stanys V (2015), "Bacterial endophytes in agricultural crops and their role in stress tolerance: a review", Zemdirbyste-Agriculture, 102(4), pp 465-478 49 Nonomura H (1974), “Key for classification and identification of 458 spieces of the Streptomyces included in ISP”, J Ferment Technol, 52 (2), pp 78-92 50 Oliveira M N., Thiago M A S., Helson M M V., Júlio C D., Alexander P C., Alessandra B F., Paulo S B M., Marcos R T., Maurício D C., Célia A M., Arnaldo C B (2013), "Endophytic microbial diversity in coffee cherries of Coffea arabica from Southeastern Brazil", Canadian Journal Microbiology, 59(4), pp 221-230 51 Pournejati R., Karbalaei H, Hamid R (2020), “Optimization of Fermentation Conditions to Enhance Cytotoxic Metaboites Production by Bacillus velezensis Strain RP137 from the Persian Gulf”, Avicenna journal of medical biotechnology, 12(2), pp 116-123 52 Pridham T G., Gottlieb D (1948), “The utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as an aid for species determination”, Journal Bacterol, 56, pp 107-114 53 Qin S., Jie L., Hua H.C., Guo-Zhen Z., Wen Y Z., Cheng L J., Li H.X., Wen-Jun L (2009), "Isolation, diversity, and antimicrobial activity of rare actinobacteria from medicinal plants of tropical rain forests in Xishuangbanna, China", Applied Environmental Microbiology, 75(19), pp 6176-6186 54 Qinyuan Li, Xiu C., Yi J., Chenglin J (2015), “Morphological Identification of Actinobacteria”, Applications Actinobacteria – Basics and Biotechnological 55 Segupta S., Arnab, Abhraajyoti G., Maitree B (2015), “Antimicrobial activities of actinomycetes isolated from unexplored regions of Sundarbans mangrove ecosystem”, BMC Microbiology, 15, pp 170 56 Shirling E.B., Gottlieb D (1966), “Methods for characterization of Streptomyces species”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 16, pp 313-340 57 Smith R.L., Schank S.C., Bouton J.H., Quesenberry K.H (1978), "Yield increases of tropical grasses after inoculation with Spirillum lipoferum", Ecological Bulletins, 26, pp 380-385 58 Stefaw R., Paul B., Brandi S (2008), “Timing of specimen collection for blood culture from febrile patients with bacteremia”, Journal Clinical Microbiology, 46(4), pp 1381-1385 59 Tsering D.C., Chanchal L., Pal R., Kar S (2011), “Bacteriological profile of septicemia and the risk factors in neonates and infants in Sikkim”, Journal Global Infectious Diseases, 3(1), pp 42-45 60 Usam R A., Tanja G., Srikkanth B., Mohamed S K., Ronald J Q., Ute H (2015), “Elicitation of secondary metabolites in actinomycetes”, Biotechnol Advances, (33), pp 798-811 61 Watve M., Tickoo R., Jog M M., Bhalachandra D B (2001), ”How many antibiotics are produced by the genus Streptomyces?”, Archives of Microbiology, 176 (5), pp 386-390 62 Williams S., Sharpe M., Holteds J.G (1978), “Numerical classification of Streptomyces and related genera”, Journal of Genetic Microbiology, 129, pp.1743-1813 63 Witt D., Stackebbandt E (1990), “Unification of the genera Streptomyces and Streptoverticillium and amendation of Streptomyces Waksman and Henrici 1443”, Systematic Applied Microbiology, 13, pp 361- 371 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Trình tự phần đoạn gen 16S rRNA chủng xạ khuẩn 15 có hoạt tính đăng tải NCBI Genbank >1st_BASE_XK15 GCCATGCGTGCTACCCATGCAGTCGACGAGGAACCATTCGCTTGGGCATTAGTTGGCAAACGGGTGAGTA ACACGTATGCAATCTACCCTGCACTCTGGGACAAGACCTGCAAACGAAGTCTAATACAGGACACTGACCT TCACGGGCATCAGTGAAGGTCAAAATCTCCCGCCGTGCATGATGAGCCCGCGACCTATCATCTTGTTGGT GAGGTAATAGATCACCACCGCGACGACGATTAGCCGGCCTGATAAGGCGACCACCCACCCTGCTACTAAT AAACCGCCCACACTCCTACTGCAGGAAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGAGCGAAAACCTCATGCACCA ACGCCGCCTGAGGGATGACGAACGTCTGCTTGTAAACCTCTTTCATCATGCAAAAAGAAAAAGTGACGGC ACCTACAGAAGAAGCACCAGCTAACTACATGACTACAGCCGCGGTAACACCTAGGGCGCAAGCGTTGTCC GGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCCGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCTTGGCTTAACCCC GGGTCTGCCCCGATACGGGCAGGCTACATGTCTGATGAGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGAGGTGAAATG AACAGATATCATGAGGAACACCTGTGGCGAATGCGGATCTCTACCCCTAGACTGACGCTGACGATCGAAC AATATGGAGCTAATGGATAAATACGCTGGATATACACGATTAAACGGTGGGTACTAGTGTGGTAACAATC ACACTACCGTGCGCATTATTCATTAGTACCCGCTAGGGAGTAAGTCACAGGCTAAACTACAGGATTGACG GGGCCCCACAACTGCGAGCAGTGCTTATTCGCACACGTGAAAACTTACTAGGCTTGAATACCTGCAACTC CGAGTGGGCGCCCCTGTGACAGTGACAGTCGTGCATGCTACGTCACTCGTGCGCGAGTGTTCGTCAGTCC GCACGAGAGTACCTTATCCTGGTGCAGCAGCCTTGTCTGTGGGATCCCAGAAACCCCAGGTCATTCGAGA AAGTGGGACAAGTCAGTATCTGCCCTTATTTGGGTTGAAAGGCTCAAGGCGGACATGACTGCAAACGTAG GGGACCAATCTAAAACTCTCAATCTATTGGGCGGACCCCCCCATATGGGAGCCAGAAACCAAAAAATTGC TTGGAAACTTCCAGGTTTCAACNCCGCACCCCCAAAACTGAAACCAATCGGGCACCCCTTGAGGAAGTCA AGGGCTTATTTGAAAGAAAAA ...  NGUYỄN THỊ TRANG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN TRÊN CÂY ĐINH LĂNG CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY NHIỄM TRÙNG HUYẾT Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN... từ mẫu đinh lăng Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao có khả ức chế số vi khuẩn gây nhiễm trùng huyết Phân loại chủng xạ khuẩn phân lập phương pháp truyền thống sinh học phân tử... khả ức chế số vi khuẩn gây nhiễm trùng huyết? ?? Mục tiêu nghiên cứu: Tuyển chọn chủng xạ khuẩn nội sinh thuốc có hoạt tính kháng sinh có tiềm ứng dụng Nội dung nghiên cứu: Phân lập chủng xạ khuẩn