Nghiên cứu khả năng phân hủy phenol của chủng nấm men tạo màng sinh học phân lập từ các mẫu đất và nước nhiễm dầu thu thập tại quảng ngãi

Lời cảm ơn ! Để hoàn thành luân văn này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Lê Thị Nhi Công, TS Đỗ Thị Tố Un, PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh, phịng Cơng nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu trình học tập thực đề tài nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán nhân viên Phịng Cơng nghệ sinh học Mơi trường, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam đặc biệt ThS Vũ Thị Thanh, ThS Cung Thị Ngọc Mai giúp đỡ q trình thực luận văn Bên cạnh đó, tơi chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội Lãnh đạo viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa Học Công Nghệ Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian học tập, nghiên cứu trường viện Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ vật chất lẫn tinh thần để tơi hồn thành tốt khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Trương Thị Nga Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm phenol 1.2 Nguồn gốc phát sinh phenol 1.2.1 Nguồn gốc tự nhiên 1.2.2 Nguồn gốc nhân tạo 1.3 Tình trạng nhiễm phenol ảnh hưởng phenol 1.3.1 Tình trạng nhiễm phenol 1.3.2 Hậu ô nhiễm phenol 1.4 Các biện pháp xử lý tẩy độc phenol 1.4.1 Phương pháp học 1.4.2 Phương pháp vật lý 1.4.3 Phương pháp hóa học 1.4.4 Phương pháp sinh học 1.5 Màng sinh học 1.5.1 Khái niệm màng sinh học 1.5.2 Sự hình thành cấu trúc màng sinh học 1.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hình thành màng sinh học vi sinh vật 11 1.6 Giới thiệu chung nấm men tình hình nghiên cứu biofilm từ chủng nấm men phân hủy sinh học 13 1.7 Các phương pháp phân loại vi sinh vật 15 1.7.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống 15 1.7.2 Phân loại sinh học phân tử 15 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng 17 Trương Thị Nga KSCNSH 11 - 02 i Khóa luận tốt nghiệp 2.1.1 Nguyên liệu 17 2.1.2 Hố chất, mơi trường nuôi cấy 17 2.1.3 Máy móc thiết bị nghiên cứu 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Thu thập mẫu 18 2.2.2 Phân lập chủng nấm men có khả phân hủy phenol 18 2.2.3 Đánh giá khả tạo màng sinh học chủng nấm men 20 2.2.4 Quan sát hình thái tế bào chủng nấm men lựa chọn 21 2.2.5 Ảnh hưởng điều kiện môi trường đến khả tạo màng sinh học (biofilm) chủng nấm men 21 2.2.6 Đánh giá khả phân hủy phenol màng sinh học nấm men 22 2.2.7 Phân loại, định tên xây dựng chủng nấm men lựa chọn 23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Phân lập tuyển chọn số chủng nấm men vừa có khả phân hủy phenol vừa có khả tạo biofilm 26 3.1.1 Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả phân hủy phenol 26 3.1.2 Khả tạo biofilm chủng nấm men tuyển chọn 28 3.1.3 Hình thái tế bào chủng nấm men lựa chọn 29 3.2 Ảnh hưởng điều kiện mơi trường đến hình thành màng sinh học chủng nấm men lựa chọn 30 3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 30 3.2.2 Ảnh hưởng pH 31 3.2.3 Ảnh hưởng nguồn carbon 32 3.2.4 Ảnh hưởng nguồn nitor 33 3.3 Đánh giá khả phân hủy phenol màng sinh học chủng nấm men lựa chọn 35 3.4 Phân loại phân tử dựa việc xác định trình tự đoạn gen ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 chủng nấm men lựa chọn 37 3.4.1 Tách chiết DNA tổng số chủng nấm men 37 Trương Thị Nga KSCNSH 11 - 02 ii Khóa luận tốt nghiệp 3.4.2 Nhân đoạn gen ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 kỹ thuật PCR 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC 45 Trương Thị Nga KSCNSH 11 - 02 iii Khóa luận tốt nghiệp BẢNG CHỮ VIẾT TẮT Bp : Base pair (cặp bazơ) DNA : Deoxyribonucleic acid dNTPs : deoxy Nucleoside Triphosphates EC50 : Median Effective Concentration (Nồng độ gây hại 50% quần thể điều kiện thực nghiệm quan sát rõ ràng Đơn vị EC50 nồng độ % hay mg/l) EPS : Extracellular polymeric substance (các hợp chất ngoại bào) GAC : Granular Activated Carbon (than hoạt tính dạng hạt) nM : Nanomet OD : Opitical Density (mật độ quang học) PAC : Powered Activated Carbon (than hoạt tính dạng bột) PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) Ppm : đơn vị phần triệu (mg/l) RNA : Ribonucleic acid rRNA : Ribosomal ribonucleic acid US-EPA : United State Environmetal Protection Agency (cục bảo vệ mơi trường Hoa Kỳ) µg, kg, mg : Micrograms, kilograms, miligrams µl, ml, l : Microlit, mililit, lít µm, mm : Micromet, milimet Trương Thị Nga KSCNSH 11 - 02 iv Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần chức thành phần mạng lưới ngoại bào 10 Bảng 1.2: Một số phương pháp phân loại vi sinh vật 15 Bảng 2.1: Các loại môi trường nuôi cấy 17 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng nấm men mơi trường khống Gost có bổ sung 50 ppm phenol với mẫu làm giàu khơng có glucose có glucose 27 Trương Thị Nga KSCNSH 11 - 02 v Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Một số hình ảnh phenol Hình 1.2 Sự hình thành màng sinh học Hình 3.1 Mẫu làm giàu vsv mơi trường muối khống Gost chứa 50ppm phenol khơng bổ sung Glucose(A) có bổ sung Glucose (B) 26 Hình 3.2 Tập đồn vsv mơi trường khống Gost thạch (A) mẫu làm giàu khơng có Glucose, (B) mẫu làm giàu có Glucose 27 Hình 3.3 Khả sinh trưởng chủng nấm men mơi trường khống Gost dịch có bổ sung 50 ppm phenol 28 Hình 3.4 Khả bắt giữ tím tinh thể màng sinh học chủng nấm men sau 48h nuôi cấy 29 Hình 3.5 Khả tạo màng sinh học chủng nấm men 29 Hình 3.6 Hình thái tế bào nấm men chủng nấm men YQNP1 kính hiển vi quét 30 Hình 3.7 Khả bắt giữ tím tinh thể màng sinh học chủng YQNP1 nhiệt độ khác sau 48h nuôi cấy 30 Hình 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả tạo màng sinh học chủng nấm men YQNP1 31 Hình 3.9 Khả bắt giữ tím tinh thể màng sinh học chủng YQNP1 pH khác sau 48h nuôi cấy 31 Hình 3.10 Ảnh hưởng pH đến khả tạo màng sinh học chủng nấm men YQNP1 32 Hình 3.11 Khả bắt giữ tím tinh thể màng sinh học chủng YQNP1 nguồn carbon khác sau 48h nuôi cấy 32 Hình 3.12 Ảnh hưởng nguồn carbon đến khả tạo màng sinh học chủng nấm men YQNP1 33 Hình 3.13 Khả bắt giữ tím tinh thể màng sinh học chủng YQNP1 nguồn nitor khác sau 48h 34 Hình 3.14 Ảnh hưởng nguồn nitor đến khả tạo màng sinh học chủng nấm men YQNP1 34 Trương Thị Nga KSCNSH 11 - 02 vi Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.15 Khả phân hủy phenol màng sinh học chủng nấm men YQNP1 nồng độ phenol khác 35 Hình 3.16 Biểu đồ mật độ quang đánh giá khả phân hủy phenol màng sinh học chủng nấm men YQNP1 35 Hình 3.17: Biểu đồ thể khả phân hủy phenol màng sinh học chủng nấm men YQNP1 36 Hình 3.17 Điện di đồ DNA tổng số chủng nấm men YQNP1 37 Hình 3.18 Điện di đồ sản phẩm nhân đoạn gen mã hóa ITS1, 5.8 rRNA, ITS2 chủng nấm men YQNP1 38 Hình 3.19 Điện di đồ sản phẩm PCR chủng nấm men YQNP1 sau tinh 39 Trương Thị Nga KSCNSH 11 - 02 vii Khóa luận tốt nghiệp ĐẶT VẤN ĐỀ Khu công nghiệp Dung Quất, tỉnh Quảng Ngãi khu cơng nghiệp lọc hóa dầu nước ta, tập trung nhiều ngành công nghiệp có quy mơ lớn, gắn liền với cảng biển nước sâu Dung Quất sân bay quốc tế Chu Lai Tuy nhiên, bên cạnh nguồn lợi kinh tế mà khu công nghiệp mang lại, hiểm họa ô nhiễm môi trường gây không nhỏ, đặc biệt ô nhiễm hợp chất hữu khó phân hủy độc có thành phần nước thải số ngành công nghiệp Trong số hợp chất này, phenol hợp chất vịng thơm độc, khó phân hủy, gây mùi khó chịu, ảnh hưởng lớn đến sản xuất nơng nghiệp, gia tăng bệnh tật tỷ lệ người mắc bệnh nồng độ thấp, tác nhân tiềm ẩn gây ung thư nhiều bệnh nguy hiểm cho người Vì vậy, việc loại bỏ phenol khỏi nguồn nước vấn đề cấp thiết Có nhiều phương pháp để xử lý nhiễm phenol sử dụng hóa chất, vật liệu hấp phụ, lắng đọng… Tuy nhiên phương pháp đòi hỏi chi phí lớn gây nhiễm thứ cấp Qua thử nghiệm thực tế, phương pháp xử lý phenol công nghệ sinh học khẳng định tính ưu việt giá thành rẻ, hiệu cao, tiến hành thuận lợi điều kiện tự nhiên, độ an toàn cao, thân thiện với mơi trường… Q trình phân hủy sinh học phenol hợp chất hydrocacbon thơm đa nhân vi sinh vật thường xảy với tốc độ chậm, vậy, việc tạo điều kiện thích hợp cho tập đồn vi sinh vật phát triển tốt đạt hiệu phân hủy cao coi chìa khóa cơng nghệ phân hủy sinh học Trong số biện pháp phân hủy sinh học ứng dụng xử lý phenol, màng sinh học từ vi sinh vật xem biện pháp cho hiệu xử lý cao chi phí thấp Hiện có nhiều nghiên cứu chủng vi khuẩn tạo màng sinh học phân hủy phenol Tuy nhiên, nước ta chưa có nhiều nghiên cứu chủng nấm men tạo màng nhằm ứng dụng xử lý phenol Bên cạnh đó, nghiên cứu giới cho thấy nhiều chủng nấm men có khả phân hủy phenol cho hiệu cao an tồn với mơi trường sinh thái chủng vi khuẩn Xuất phát từ sở tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu khả phân hủy phenol chủng nấm men tạo màng sinh học phân lập từ mẫu đất nước nhiễm dầu thu thập Quảng Ngãi” Trương Thị Nga KSCNSH 11 - 02 Khóa luận tốt nghiệp Mục tiêu nghiên cứu Tuyển chọn chủng nấm men vừa phân hủy phenol cao vừa tạo màng sinh học tốt từ mẫu đất nước nhiễm dầu lấy khu công nghiệp Dung Quất Quảng Ngãi nhằm nâng cao hiệu phân hủy phenol có đất nhiễm dầu Nội dung nghiên cứu - Phân lập tuyển chọn chủng nấm men có khả phân hủy phenol - Sàng lọc chủng nấm men tạo màng sinh học tốt - Nghiên cứu số điều kiện nhiệt độ, pH, nguồn Carbon Nitor có ảnh hưởng tới khả tạo màng chủng nấm men - Đánh giá khả phân hủy phenol chủng nấm men lựa chọn - Phân loại định tên chủng nấm men Đề tài thực phịng Cơng nghệ sinh học mơi trường-Viện Cơng nghệ sinh học-Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trương Thị Nga KSCNSH 11 - 02 Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.8: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả tạo màng sinh học chủng nấm men YQNP1 Quan sát hình 3.8, chủng YQNP1 có khả tạo màng tốt nhiệt độ 37oC sau 48h Tuy nhiên, nhiệt độ 30oC 40oC chủng nấm men có khả tạo màng tốt Với khí hậu nhiệt đới nước ta, khoảng nhiệt độ thích hợp để chủng nấm men YQNP1 phát triển hình thành màng sinh học 3.2.2 Ảnh hưởng pH Nấm men thường sinh trưởng tốt khoảng axit đến gần trung tính [5] Để xác định pH thích hợp cho hình thành màng sinh học chủng YQNP1, tiến hành nuôi tĩnh chủng nấm men điều kiện nhiệt độ tối ưu 37oC mơi trường Hansen dịch có pH từ 4,5,6,7,8,9 Kết thể hình 3.9 3.10 ĐC Hình 3.9: Khả bắt giữ tím tinh thể màng sinh học chủng YQNP1 pH khác sau 48h nuôi cấy Trương Thị Nga KSCNSH 11 - 02 31 Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.10: Ảnh hưởng pH đến khả tạo màng sinh học chủng nấm men YQNP1 Quan sát hình 3.10 cho thấy, chủng YQNP1 có khả tạo màng tốt dải pH từ 6-8, có khả tạo màng tốt pH 3.2.3 Ảnh hưởng nguồn carbon Để khảo sát nguồn carbon vi sinh vật dễ sử dụng, sinh trưởng tạo màng tốt tiến hành ni tĩnh chủng YQNP1 mơi trường Hansen có nguồn carbon khác (glucose, maltose, saccharose, lactose) nhiệt độ 37oC, pH mô tả phần 2.2.3 Kết thu thể hình 3.11 3.12 ĐC Glucose Lactose Saccarose Mantose Hình 3.11: Khả bắt giữ tím tinh thể màng sinh học chủng YQNP1 nguồn carbon khác sau 48h nuôi cấy Trương Thị Nga KSCNSH 11 - 02 32 Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.12: Ảnh hưởng nguồn carbon đến khả tạo màng sinh học chủng nấm men YQNP1 Quan sát hình 3.11 3.12 cho thấy, chủng nấm men YQNP1 có khả tạo màng sinh học nguồn carbon nhiên chủng nấm men có khả tạo màng tốt mơi trường có bổ sung nguồn carbon đường saccarose Kết giải thích đường saccarose cấu tạo từ gốc đường đơn glucose fructose nên thể sinh vật dễ dàng hấp thu chuyển hóa 3.2.4 Ảnh hưởng nguồn nitor Trong trình sinh trưởng phát triển vi sinh vật, nitor nguyên tố để tạo nên thành phần tế bào Trong hình thành màng sinh học, nitor cần thiết việc tạo hợp chất ngoại bào - thành phần quan trọng tạo nên màng sinh học Để xác định nguồn nitor chủng YQNP1 sử dụng tốt nhất, sử dụng nguồn nitor vô hữu gồm: cao men, KNO3, (NH4)2HPO4, pepton, (NH4)2SO4 để nghiên cứu Kết thể hình 3.13 3.14 Trương Thị Nga KSCNSH 11 - 02 33 Khóa luận tốt nghiệp ĐC (NH4)2SO4 Peptone (NH4)2HPO4 KNO3 Cao men Hình 3.13: Khả bắt giữ tím tinh thể màng sinh học chủng YQNP1 nguồn nitor khác sau 48h Hình 3.14: Ảnh hưởng nguồn nitor đến khả tạo màng sinh học chủng nấm men YQNP1 Từ hình 3.13 3.14 cho thấy, chủng nấm men YQNP1 có khả tạo màng tốt nguồn nitor vô hữu cơ, nhiên chủng nấm men có khả tạo màng tốt bổ sung nguồn nitor cao men Nguồn nitor cao nấm men loại dịch tự phân tế bào nấm men đặc lại Thành phần cao men giàu dinh dưỡng, chứa chất đạm hữu cơ, vitamin nhóm B, đường nên thích hợp cho vi sinh vật sử dụng cho trình sinh trưởng, phát triển, đặc biệt trình hình thành màng sinh học Do đó, chủng nấm men YQNP1 bổ sung nguồn nitor cao men hình thành màng sinh học tốt Như vậy, điều kiện tối ưu cho hình thành màng sinh học chủng nấm men YQNP1 nhiệt độ 37oC, pH 6, nguồn carbon saccarose nguồn nitor cao men Trương Thị Nga KSCNSH 11 - 02 34 Khóa luận tốt nghiệp 3.3 Đánh giá khả phân hủy phenol màng sinh học chủng nấm men lựa chọn Để đánh giá khả phân hủy phenol màng sinh học, tiến hành nuôi chủng nấm men YQNP1 môi trường Hansen dịch điều kiện tối ưu nhiệt độ 37oC, pH 6, có bổ sung đường saccarose cao men Sau 48 nuôi cấy điều kiện tĩnh màng sinh học hình thành, ta tiến hành hút dịch ni cấy nhẹ nhàng để tránh làm vỡ màng rửa lần nước cất với lượng thể tích tương ứng Sau bổ sung vào lọ tương ứng gồm: 20 ml khoáng Gost, 0,1%vitamin phenol nồng độ 50ppm, 100ppm, 150ppm, 200ppm 250 ppm Đem nuôi tĩnh tủ ấm 37oC Sau 24 nuôi cấy, hút ml dịch để tiến hành đo OD bước sóng 600 nm vịng ngày Sau ngày, thu kết thể hình 3.15 3.16 Hình 3.15: Khả phân hủy phenol màng sinh học chủng nấm men YQNP1 nồng độ phenol khác Hình 3.16: Biểu đồ mật độ quang đánh giá khả phân hủy phenol màng sinh học chủng nấm men YQNP1 Quan sát hình 3.15 3.16 cho thấy, chủng nấm men có khả phát triển tốt tất nồng độ phenol Tuy nhiên, chuyển hóa phenol chủng nấm men Trương Thị Nga KSCNSH 11 - 02 35 Khóa luận tốt nghiệp YQNP1 tốt nồng độ 200 ppm sau ngày ni cấy Vì vậy, chọn nồng độ 200 ppm phenol để gửi mẫu phân tích khả phân hủy phenol màng sinh học phương pháp đo quang Viện Hóa phân tích Kết thể hình 3.17 Hình 3.17: Biểu đồ thể khả phân hủy phenol màng sinh học chủng nấm men YQNP1 Kết phân tích cho thấy hàm lượng phenol cịn lại sau ngày mẫu đối chứng khơng có màng sinh học 199,8 mg/l, cịn mẫu có màng sinh học chủng nấm men YQNP1 118,11 mg/l (so với mẫu ban đầu 200 mg/l) Từ chúng tơi tính hiệu suất phân hủy phenol màng sinh học chủng nấm men YQNP1 41% Sở dĩ, hàm lượng phenol mẫu đối chứng sau ngày giảm so với mẫu đối chứng ngày 0,2 mg/l, trình thử nghiệm phenol bị phân hủy phần nhờ điều kiện tự nhiên như: ánh sáng, bay Theo tác giả Mrinalini cộng (2011), chủng nấm men Rhodosporidium torulides phân lập từ vùng ô nhiễm dầu mỏ Vellore, Ấn Độ, phân hủy 75% tổng số hydrocarbon dầu diesel vòng 15 ngày Phân tích sắc kí cho thấy suy giảm rõ rệt thành phần hydrocarbon dầu mỏ Hàm lượng tương đối thành phần hydrocarbon thử nghiệm chủng Rhodosporidium toruloides giảm từ khoảng 50 ppm xuống cịn 27 ppm mẫu thí nghiệm[28] Vào năm 2011, Preethy Chandran cộng tiến hành tạo màng sinh học từ chủng nấm men Candida tropicalis cố định giá thể Trương Thị Nga KSCNSH 11 - 02 36 Khóa luận tốt nghiệp cám lúa mì phân hủy tới 98% dầu diesel so với 80% thử nghiệm tế bào dạng tự thời gian ngày Ngoài ra, màng sinh học nấm men hình thành sỏi phân hủy 97% dầu diesel thời gian 10 ngày [33] So sánh với chủng nấm men khác giới khả hủy phenol chủng nấm men YQNP1 tốt Điều hoàn toàn phù hợp chủng nấm men nghiên cứu có thời gian ni cấy lâu (15 ngày), nồng độ phenol ban đầu không cao (50 ppm) cố định giá thể (cám lúa mì), chủng nấm men YQNP1 nuôi thử nghiệm sau ngày lượng phenol ban đầu cao 200 mg/l Do vậy, chủng nấm men góp phần làm phong phú thêm số lượng chủng nấm men có khả phân hủy sinh học hợp chất hydrocarbon thơm Chủng lưu giữ nghiên cứu sâu thêm để tăng cường hiệu xử lý hợp chất nhiễm ngồi trường 3.4 Phân loại phân tử dựa việc xác định trình tự đoạn gen ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 chủng nấm men lựa chọn 3.4.1 Tách chiết DNA tổng số chủng nấm men Tách chiết làm DNA tổng số nấm men xem khâu quan trọng việc phân loại phân tử chất lượng DNA ảnh hưởng đến hiệu thí nghiệm khác DNA tổng số nấm men YQNP1 tách theo mô tả Harju cộng (2004) trình bày mục 2.2.5 DNA tổng số sau tách điện di kiểm tra gel agarose 1%, phổ điện di thể hình 3.17 DNA tổng số Hình 3.18: Điện di đồ DNA tổng số chủng nấm men YQNP1 Kết điện di cho thấy, DNA tổng số chủng nấm men YQNP1 có độ tinh cao, hàm lượng lớn, băng gọn, đủ điều kiện cho thí nghiệm Trương Thị Nga KSCNSH 11 - 02 37 Khóa luận tốt nghiệp 3.4.2 Nhân đoạn gen ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 kỹ thuật PCR Hiện nay, việc xác định trình tự phần đoạn gen ITS, 5.8S rRNA, ITS2 nấm men giúp phân loại, định tên xác định mối quan hệ tiến hóa chủng nấm men Sau tách chiết DNA tổng số chủng nấm men YQNP1, sử dụng DNA tổng số làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi ITS1 ITS4 để khuyếch đại đoạn gen ITS1, 5.8 rRNA, ITS2 chủng YQNP1 Sản phẩm điện di gel agarose kết điện di thể hình 3.18 550 bp 500 bp Hình 3.19: Điện di đồ sản phẩm nhân đoạn gen mã hóa ITS1, 5.8 rRNA, ITS2 chủng nấm men YQNP1 Chú thích: M: Thang DNA chuẩn, kích thước 100 bp; YQNP1: Sản phẩm PCR chủng nấm men YQNP1; K: Đối chứng âm Hiện nay, có hai phương pháp để xác định trình tự dựa vào phương pháp tách dịng đọc trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR Phương pháp thứ hai thường sử dụng sản phẩm PCR có kích thước khoảng 500 bp Trong nghiên cứu này, phương pháp xác định trình tự trực tiếp chúng tơi sử dụng Tuy nhiên, để xác định trình tự theo phương pháp thứ hai sản phẩm PCR phải loại bỏ tạp chất phản ứng PCR lại như: mồi dư, thành phần phản ứng khác Sản phẩm PCR khuyếch đại đoạn gen ITS1, 5.8 rRNA, ITS2 chủng YQNP1 tinh kit AccuPrep PCR Purification theo quy trình nhà sản xuất Bioneer trình bày mục 2.2.6 Sản phẩm điện di kiểm tra gel agarose 1% Kết thể hình 3.19 Trương Thị Nga KSCNSH 11 - 02 38 Khóa luận tốt nghiệp 550 bp Hình 3.20: Điện di đồ sản phẩm PCR chủng nấm men YQNP1 sau tinh Quan sát kết điện di cho thấy sản phẩm PCR tinh hồn tồn, khơng bị nhiễm tạp chất đem gửi để xác định trình tự máy xác định trình tự tự động ABIPRISM 3100 Avant Data Collection phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trương Thị Nga KSCNSH 11 - 02 39 Khóa luận tốt nghiệp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ mẫu bùn thải khu công nghiệp Dung Quất phân lập chủng nấm men có khả sử dụng phenol, chủng YQNP1 vừa có khả phân hủy phenol tốt vừa có khả tạo màng sinh học tốt Trên môi trường Hansen thạch, chủng nấm men YQNP1 có khuẩn lạc trịn, lồi, ướt, trắng đục, đường kính khoảng 1,5 - mm Dưới kính hiển vi điện tử qt có độ phóng đại 15000 lần, tế bào có dạng hình cầu, kích thước tế bào khoảng (0,50,6) x (0,9-1,2) µm Khả tạo màng sinh học chủng nấm men YQNP1 tốt nhiệt độ 37oC, pH 6, nguồn carbon thích hợp đường saccarose nguồn nitor tốt cao men Màng sinh học chủng YQNP1 tạo điều kiện tối ưu, có hiệu phân hủy phenol đạt 41% sau ngày nuôi cấy Đã nhân đoạn gene ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 chủng nấm men YQNP1 Kiến nghị So sánh mức độ tương đồng chủng nấm men YQNP1 với chủng công bố trước xây dựng phát sinh chủng loại chủng nấm men Trương Thị Nga KSCNSH 11 - 02 40 Khóa luận tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Lê Đình Lương Nấm men-đối tượng cổ điển đại cơng nghệ sinh học Tạp chí hoạt động khoa học, 12-1990 Lê Gia Hy (2010) " Giáo trình vi sinh vật học", NXB Khoa Học Cơng Nghệ Lương Đức Phẩm (2006), Nấm men công nghiệp, nhà xuất khoa học kỹ thuật Nguyễn Văn Hiệu Hồn thiện quy trình sản xuất bánh men cố truyền ứng dụng sản xuất rượu Luận án phó tiến sĩ, Hà nội, 1992 Phạm Hương Sơn, Đặng Xuyến Như, Phạm Văn Ty, 1999 Một vài đặc điểm sinh học khả phân hủy hydrocarbon chủng nấm men Candida tropicalis HS -10 HS – 35 Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc: 170-176 Trương Thế Kỷ (2000), Hóa hữu 1: Hợp chất hữu đơn chức đa chức, Nhà xuất y học Tiếng anh Aggelis G, Ehaliotis C, Nerud F, Stoychev I, Lyberatos G and Zervakis G I (2002), “Evaluation of white rot fungi for detoxification and decolorization of effluents from green olive debittering process”, Applied Microbial and Biotechnol, Vol59(2-3), pp.353-360 Allen S, Allen C (1997), “Phenol concentrations in air and water samples collected near a wood preserving facility”, Bull Environ Contam Toxicol, pp.59-72 Ana I A, Francisco R V, Jesus G M, Silvia G.A (1999), “Use of 16S-23S ribosomal genes spacer region in studies of prokaryotic diversity”, Journal Microbiol Methods, vol36, pp.55-64 10 Anderson S., Dalhammar G., Land C J., Kuttuva R G (2009), "Characterization of extracellular polymeric substances from denitrifying organism Comamonas denitrificans", Application Microbiology Biotechnology, 82(3), pp 535-543 11 APHA (1998), Standard methods for the examination of water and wastewater, 20th Edition, American Public Health Association Trương Thị Nga KSCNSH 11 - 02 41 Khóa luận tốt nghiệp 12 Bendinger B.,Rijnaards H H M., Altendorf K., Zehnder A J B (1993), “Physicochemical cell surface and adhesive properties of coryneform bacteria related to the presence and chain length of mycolic acid”, Applied and Environmental Microbiology, 59, pp 3973- 3977 13 Bidleman T, Walla M, Roura R., et al (1993), “Organochlorine pesticides in the atmosphere of the southern ocean and Antarctica, January-March, 1990”, Marine Pollution Bulletin, Vol26(5), pp.258-262 14 Bruce R, Santodonato J, Neal (1987) “ summary review of the health effects associated with phenol”, Toxicol indust Health, pp.3535 15 Czaczyk K.M K (2007) "Biosynthesis of Etracellular Polymeric Substances (EPS) and Its Role in Microbial BiofilmFormation", Polish Journal of Environmental Studies, 16, pp 799-806 16 Cheng K C., Demirci A., Catchmark J M (2010), “Advances in biofilm reactors for production of value – added products”, Applied Microbiology and Biotechnology, 87, pp 445-456 17 Dubouzet J., Shinoda K (1999), “Relationships among old and New world Alliums according to ITS DNA sequence analysis”, Theoretical and Applied Genetics, 98, pp 422-433 18 Garrett R T., Bhakoo M., Zhang Z (2008), “Review: Bacterial adhesion and biofilms on surface”, Natural Science, 18, pp 1049-1056 19 Hajru S., Fedosyuk H., Peterson K R (2004), “Rapid isolation of yeast genomic DNA: Bust n’ Grab”, BMC Biotechnology, 4(8) 20 Herald P J., Zottola E A (1988), “Attachment of Listeria monocytogenes to stainless steel surface at various temperatures and pH values”, Journal of Food Science, 53,pp 1549-52 21 Jomeo T (2008), "Bacterial biofilms", Current Topics in Microbiology and Immunology, Atlanta-United States of American, pp.322 22 Katayama – Hirayama K, Tobita S and Hirayama K, (1991), "Metabolic pathway of phenol in Rhodotorula rubra", The Journal of General and Applied Microbiologyl., Vol 37, pp.379-388 Trương Thị Nga KSCNSH 11 - 02 42 Khóa luận tốt nghiệp 23 Krallish I., Gonta S., Savenkova L., Bergauer P., Margesin R (2006), “Phenol degradation by immobilized cold-adapted yeast strains of Cryptococcus terreus and Rhodotorula creatinivora”, Extremophiles, 10, pp 441-449 24 Kurtzman C P., Fell J W (2006), “Yeast Systematics and Phylogeny”, Biodiversity and Ecophysiology of Yeast Handbook, 11-30 25 Leonard D and Lindley N.D, (1998) “Carbon and energy flux constraints in continuous cultures of Alcaligens eutrophus grown on phenol”, Enzyme and microbiol technology, Vol.144, pp.241-248 26 Makimura K., Murayama S Y., Yamaguchi H (1994), “Detection of a wide range of medically important fungi by the polymerase chain reaction”, Journal of Medical Microbiology, 40, pp 358-364 27 Morikawa M, Kagihiro S, Haruki M, Takano K, Branda S, Kolter R, Kanaya S (2006) “Biofilm formation by a Bacillus subtillis train that produces gamma-polyglutamate”, Microbiology, 152, pp 2801-7 28 Mrinalini K and Jayanthi A (2011) "Biodegradation of Diesel Oil using Yeast Rhodosporidium toruloides", Research Journal of Environmental Toxicology, 5, pp 369-377 29 Mullis K B., Saiki R K., Scharf S., Faloona F., Arnheim N (1985), “Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site anylysis for diagnosis of sickle cell anemia”, Science, 230(4732), pp 1350-4 30 Munnazza AJAZ, Nabeela Noor, Sheikh AJAZ A.Khan (2004), “Phenol resistant Bacteria from Rasool and Shakeel soil: Identification – Characterization and genetical studies”, Pakistan Journal of Botany, Vol36(2), pp.415-424 31 O’Toole G A., Heidi K B., Kolter R (2000), “Biofilm formation as microbial development”, Annual Review of Microbiology, 54, pp 49-79 32 O’Toole GA, Kolter R (1998) “Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development”, Molecular Microbiology, 30, pp 295-304 Trương Thị Nga KSCNSH 11 - 02 43 Khóa luận tốt nghiệp 33 Preethy C., Ninanjana D (3/4/2011), " Degradation of diesel oil by immobilized Candida tropicalis and biofilm formed on gravels", Biodegradation, 22, pp 1181-1189 34 Shi X and Zhua X., (2009), “Biofilm formation and food safery in food industries”, Trends in Food Scinece & Technology 35 Steyn B (2005) "Proteomic analysis of the biofilm and biofilm – asociated phenotypes of Pseudomonas aeruginosa cultured in batch", PhD dissertation, The Faculty of Natural and Agricultural Sciences, Universiry of Pretoria, Pretoria 36 Swarts M, Verhagen F, Field JWijnberg J (1998), “Trichlorinated phenols from Hypholoma elongatum”, Phyto - Chem, Vol3, pp.49-203 37 Walker K., Skelton H., Smith K (2002), “Cutaneous lesions showing giant yeast forms of Blastomyces dermatitidis”, Journal of Cutaneous Pathology, 29(10), pp 616-618 Trương Thị Nga KSCNSH 11 - 02 44 Khóa luận tốt nghiệp PHỤ LỤC - Bảng kết phân tích hàm lượng phenol Trương Thị Nga KSCNSH 11 - 02 45