Phân lập và xác định các đặc tính sinh học của vi khuẩn VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS gây bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển ở vùng biển hải phòng

VIỆN ĐẠI HỌC MĨ HÀ NỘI KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẠC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUÁN VIBRIO PARAHAEMOLYTICƯS GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN THẬN TRÊN MỘT SĨ LỒI CÁ BIÉN Ở VÙNG BIÊN HẢI PHÒNG Giáo viên hướng dẫn : TS Phạm Thị Tâm Sinh viên thực : Đỗ Thị Vân Anh Lóp: 11-02 Hà Nội-2015 LỊI CẢM ON Trước hết, em xin chân thành câm ơn thầy cô giáo, cán thuộc Khoa Công nghệ sinh học — Viện Đại học Mớ Hà Nội tạo điểu kiện thuận lợi cho em có thê thực tập hoàn thành đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Phạm Thị Tâm Giáng viên Khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại Học Mõ' Hà Nội, người trực tiếp tận tình hướng dan dìu dắt em suốt q trình em thực tập hồn thành đề tài Em không thê quên gửi lời biết ơn sâu sac tới gia đình, người thân, anh chị khóa trước, bạn bè ln bên em, tận tình giúp đỡ, vũ động viên suốt thời gian em thực tập hoàn thiện đề tài Trong q trình thực tập khơng tránh khói sai sót, kính mong thầy giáo, anh chị bạn đóng góp ý kiến đẻ em tiếp thu hoàn thiện Em xin chân thành cám ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Sinh viên Đỗ Thị Vân Anh DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Brain Heart Infusion Broth BHI Broth Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose TCBS Lubria - Bertani LB Kligler Iron Agar KIA Đường kính D Resistant R Intermediate I Susceptible s Giờ H Deoxyribonucleotide Acid DNA Base pair „ Th 1111’ v'iAn Vipn Polymerase Chain Reaction Tế bào BP h no MỎ’ Híì Nơi PCR tb u • MỞ ĐÀU Lý chọn đề tài Việt Nam quốc gia ven biền nằm bên bờ Tây Biển Đông, có bờ biến dài 3.260 km trài dài từ Bắc tới Nam; tạo điều kiện thuận lợi cho hình thành phát triến kinh tế, đặc biệt nghề nuôi trồng thủy hải sàn Nuôi trồng thủy sàn ngành công nghiệp sán xuất thực phấm phát triển nhanh giới, mang lại tiềm to lớn đe dây mạnh chiến lược phát triên kinh tế biến Theo thống kê Tông cục Thủy sàn (Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn), tống sân lượng thủy sàn nuôi trồng tháng đầu năm 2014 ước đạt 543 nghìn tấn, sàn lượng khai thác 244 nghìn tấn, sán lượng ni trồng 299 nghìn tấn, đưa tống sản lượng thúy sản tháng đầu năm xấp xì 4,0 triệu tấn, tăng 4,0%, sản lượng khai thác 1,9 triệu (tăng 4,9%), sàn lượng nuôi trồng 2,1% (tăng 3,1%) Tống cục Thủy sàn cho biết, giai đoạn 2011 - 2015 ngành thủy sán hướng tới phát triển bền vững ngành xuất khấu hàng hóa lớn, có cạnh tranh cao hội nhập vừng giới Hiện nay, đối tượng nuôi mô hình ni thúy sản Việt Nam phong phú.Trong đó, mơ hình ni cá lồng ngày khẳng định vị trí cùa Đây mơ hình áp dụng cho nhiều lồi cá có giá trị kinh tế cao Cá nuôi lồng phái chịu nhiều yếu tố gây stress phải thích nghi với môi trường sống mới, tập quán sinh sàn kiếm ăn bị đảo lộn, sức đề kháng bị ánh hướng Vì thế, cá ni lồng thường mắc số bệnh vi khuẩn virus gây Đáng lưu ý bệnh hoại từ gan thận cá biền chúng vi khuầnVibrio parahaemolyticus gây ra, làm thiệt hại khơng nhị đến người ni cá biến Bệnh hoại tử gan thận xuất hầu hết loài cá biển (cá mú, cá chèm, cá giờ, cá hồng, cá bớp ), đặc biệt cá nuôi lồng, xuất cá nước Khi vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus xâm nhập vào cá biến, gây hoại tử lên nội quan cá (đặc biệt gan, thận), lở loét kýp biếu bì Gan thận bị hoại tử gan từ màu xám nâu chuyến thành màu vàng, làm cho cá biền chết hàng loạt Bệnh thường xày giai đoạn cá, tìm phương pháp phịng trị bệnh hạn chế ton that dịch bệnh gây cần thiết Thực tế nuôi trồng thủy sán, người dân thường sứ dụng nhiều hóa chất kháng sinh để khống chế vi khuẩn này, song việc sử dụng kháng sinh có thồ gây tượng nhờn thuốc không mang lại hiệu cao Vi khuẩn có tạo màng bảo vệ (biofilm) trước thuốc diệt khuấn kháng sinh Chính thế, dịch bệnh thường bùng phát trờ lại nhanh sau thuốc hết tác dụng Mặt khác, dư lượng kháng sinh sản phấm từ cá biển có thề gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng thịt cá sức khỏe cùa người Đế giám thiểu việc sử dụng kháng sinh điều trị bệnh đảm bảo chất lượng sán phẩm từ cá biển, việc nghiên cứu loại vắc-xin phòng bệnh tương đối cần thiết Bước để tạo vắc-xin phâi phân lập sàng lọc chủng có tính đại diện kháng nguyên để làm sở cho việc tạo chúng có tạo kháng bão hộ Xuất phát từ thực trạng nêu trên, tiến hành thực đề tài: “ Phân lập xác định đặc tính sinh học vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tủ’ gan thận số lồi cá biến ỏ’ vùng biến Hải Phịng” làm sở ban đầu hướng đen việc sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tứ gan thận cá biên quy mô công nghiệp Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu chung Phân lập chủng vi khuấn Vibrio parahaemolyticus từ mẫu bệnh phẩm số loài cá biến (cá mú, cá hồng, cá bớp) bị bệnh hoại tứ gan thận vùng biên Hải Phòng 2.2 Mục tiêu cụ thể - Phân lập 6- chúng vi khuấn Vibrio parahaemolyticus từ mầu bệnh phâm số loài cá biển (cá mú, cá hồng, cá bớp) bị bệnh hoại tử gan thận -Xác định đặc tính sinh học điển hình vi khuấn Vibrio parahaemolyticus: đặc điếm hình thái, đặc điểm sinh hóa, gây bệnh, tính kháng kháng sinh Nội dung nghiên cúm - Phân lập chùng vi khuân Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận so loài cá biên (cá mú, cá hồng, cá bớp) từ mầu bệnh phâm - Xác định đặc tính sinh học chùng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh phân lập - Đánh giá mức độ kháng kháng sinh đặc tính gây bệnh số loài cá biền cúa chùng vi khuẩn chọn lọc Ý nghĩa đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học - Kết xác định đặc tính sinh học cũa chùng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận cá sở khoa học nghiên cứu dịch tễ xây dựng giải pháp phòng trị bệnh 4.2 Ý nghĩa thực tiễn - Là sở khoa học nghiên cứu tạo chủng vi khuan Vibrio parahaemolyticus giám độc lực đế sàn xuất vắc-xin bệnh hoại tử gan thận cá vắc-xin giải pháp hữu hiệu việc hạn chế dịch bệnh làm tăng hiệu kinh tế sán xuất cá biên PHẦN I TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 lình hình ni trồng thủy hải sản giói Việt Nam 1.1.1 Trên giói Ngành nuôi trồng thúy hài sản giới có từ lâu ngành ni trồng thủy hài sàn theo hướng đại thực đời từ năm 1930, chi thật bùng nồ từ năm 80 tôm giống sàn xuất với số lượng lớn cung cấp cho người nuôi Hiện giới ngành nuôi trồng thủy sản phát triển, có thổ kể đến nước đứng đầu sản lượng nuôi trồng thủy sàn theo thứ tự gồm: Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam, Thái Lan, Indonesia, Bangladesh, Chile Nhật Bàn, Na Uy Philippines Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy hái sàn bị gây trở ngại bới nạn dịch bệnh lây lan khắp nơi Các dịch bệnh thường xảy thũy hài sản bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng, bệnh CỊỈ,.L tơm ni, bệnh xuất huyết viruSj bệnh índivirus cá, bệnh nhóm Vibrio sp., nấm gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành nuôi trồng thùy hãi sản.[27] Một tác nhân gây bệnh đáng quan tâm bệnh nhóm vi khuẩn Vibriosp Gây cho động vật thủy hài sán (tôm, cá) Chúng gây bệnh qua tất giai đoạn động vật thùy sản xem nguồn gốc gây thiệt hại nghiêm trọng trôn giống thúy hải sàn Nhiều trường hợp nhiễm bệnh phát Australia, Àn Độ, Indonesia, Philippines, Đài Loan, Thái Lan nhiều loài thủy hải sản khác Các giảm sút gần ngành nuôi trồng thủy hãi sàn Việt Nam, Án Độ, Bangladesh Philippines Trung Quốc yếu tác động cùa nhóm vi khuẩn Vibriosp [27] Theo dự báo cùa Trung tâm Thuý sản Thế giới, đến năm 2020, nước phát triển chiếm tới 77% tồng tiêu thụ thuỷ sản toàn cầu 79% tổng sản lượng thuỳ sản giới Như là, từ năm 1997 đến năm 2020, tiêu thụ thuỹ sản nước phát triển tăng từ 62,7 triệu lên 98,6 triệu (57%), nước phát triền chi tăng 4%, từ 28,1 triệu lên 29,2 triệu [27] 1.1.2 Tại Việt Nam Việt Nam quốc gia giới có nghề ni thúy sán phát triển nước có lịch sử ni trồng thúy hải sàn lâu đời Nghề nuôi thủy sán truyền thống bắt đau từ thập niên 1960, nhiên vịng 10 năm nay, nghề ni thủy sán có tốc độ phát triển nhanh chóng Trong năm qua, ngành thuy sản khắng định ngành kinh tế mũi nhọn có đóng góp quan trọng cho phát triển kinh tế - xã hội nước nhà Tạo công ăn việc làm cho hàng trăm ngàn lao động, cung cấp thực phấm thúy sản cho đời sống người dân, phẩn đẩu trở thành ngành sán xuất hàng hóa lớn, sản phấm thủy sàn có sức cạnh tranh cao thị trường đề tiếp tục phát triển nhanh, ổn định bền vững Thực phấm thuỷ hải sản giữ vai trò an ninh lương thực quốc gia góp phần xố đói giảm nghèo Thực phẩm thuỳ hâi sàn đánh giá nguồn cung cấp đạm dộng vật cho người dân Việt Nam.[27] Thư vịện Viện f)ại học Mở Hà Nội 1.1.3 Một sổ khó khăn ni trồng thủy hải sản Vai trị cùa nuôi thủy sàn rat to lớn việc cung cấp thực phấm, y học, công nghiệp, nông nghiệp hay giúp xố đói, giảm nghèo phát triển kinh tế - xã hội nói chung cùa nhiều quốc gia Tuy nhiên, với thâm canh hoá ngày cao độ, nghề nuôi đối mặt với nhiều thách thức lớn nhiễm mơi trường, suy thối nguồn lợi, dịch bệnh thúy sản, an toàn vệ sinh thực phẩm, phân cách mâu thuẫn xã hội Các mơ hình chiến lược phát triến thời gian tới gồm: Ni thâm canh với hệ thống hồn chinh; ni tuần hồn, ni kết hợp nuôi lồng biên khơi Nhằm phát triển bền vững nghề nuôi thúy sản, nay, nhiều tố chức nô lực lớn việc phát triển phương thức - qui tắc quản lý tổng hợp nghề nuôi thủy sản bước đau ứng dụng nhiều nơi như: nuôi sạch, thực hành qn lý tốt hơn, ni có trách nhiệm 1.2 Lịch sủ’ phát bệnh vi khuẩn Vibrio 1.2.1 Trên giói Nhóm vi khuẩn Vibrio xác định tác nhân gây bệnh phố biến loài cá biền giới Theo Peggy and Ruth (2009), tỳ lệ cá chết nhiễm Vibrio có thề 50% đợt dịch, cá có dấu hiệu mê, màu sắc biến đồi xuất vùng hoại tứ Khi cá bệnh nặng nội quan có the xuất huyết bên chứa đầy dịch lóng [29] Vibrio anguillarum loài vi khuần thuộc giống Vibriođược phát gây bệnh cá phân lập từ cá chình ni Địa Trung Hải bời Cancstrini vào năm 1883 Và năm tiếp sau đó, người ta cho rang tác nhân gây bệnh Vibriosis lồi vi khuấn ngun nhân Tuy nhiên, quan tâm ngày nhiều đối nghề nuôi cá giới giúp cho vấn đề dịch bệnh hiếu cách rõ ràng vùng nuôi, hệ thống nuôi vai trị cùa lồi vi khuẩn bùng nổ cùa dịch bệnh Chẳng hạn, V alginolyticusăược xác định tác nhân thứ cấp tham gia gây bệnh cá tráp (Sparus aurata) ni Israel lồi cá nàỵ bị thương tổn (Colorni cộng 1981) Trong đó, V.vulnificus tác nhân gây bệnh cho cá chình Nhật bàn thơng báo bời Muroga cộng năm 1979 Bioscas vào năm 1991 Cùng với Vibrio anguillarum, v.ordalii (Schiewe et al 1981) v.salmonicida (Egidius et al 1986) xuất tác nhân gây bệnh nguy hiêm cho cá hồi ni Thái Bình Dương Đại Tây Dương Qua trình tồn phát triền, giống lồi Vibrio gây bệnh có biến đơi cấu trúc gen khác so với ban đầu, việc dẫn den tượng kháng thuốc, có tác hại nghiêm trọng phát triển nghề nuôi thuỷ sán nói chung ni cá biền nói riêng [27] V parahaemolyticus Fujino phát lần vào mùa hè năm 1951 vùng ven biển Nhật Bán sau vụ ngộ độc ăn cá, hàu Người ta xác định đuợc 21 loài thuộc giống Vibrio, có lồi thuộc tác nhân gây bệnh cho người gồm: V cholera, V parahaemolyticus, V vulnificus, V a/ginoỉyticus[28] V cholera phân bố rộng khắp với số lượng lớn lan lới chân Mỹ, gây bệnh dịch tà cho inột số vùng châu Á, Ấn Độ Đông Nam Á Chúng gây đại dịch lây truyền qua tiếp xúc, nước, sữa, thực phẩm côn trùng V parahaemolyticus vi sinh vật biến, tồn tự nhiên nước biến, thường gặp loại hâi sàn loại nhuyễn thề giáp sát nước biến Năm 2001, Vibrio alginolyticus xác định tác nhân gây bệnh cá blip có dấu hiệu lờ loét Đài Loan (Rajan et al 2001) Đến năm 2006 Vibrio vulnificus xác định nguyên nhân gây bệnh cá bóp Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu thức cá bớp bị lở loét nuôi Đong Bằng Sông Cửu Long Trong báo này, chúng tơi trình bày kết q phân lập, đặc điếm sinh lý, sinh hóa vi khuẩn xác định độ nhạy số loại kháng sinh vi khuấn phân lập nhằm cung cấp thông tin cho việc phịng trị bệnh hiệu [29], Ngồi người dân sống ven sông vùng duyên hài Canada thường có thú đào vớt nghêu sị Tuy nhiên người ý thức loại thủy sàn mối đe dọa sức khoe Cũng lọài thủy sàn khác, sị ốc bị nhiễm loại vi khuẩn E coli spp, Salmonella spp, Vibrio vulniculus, Vibrio parahaemolyticus loại virus virus Norwalk( Norovirus) virus bệnh viêm gan A Bệnh viêm ruột V parahaemolyticus bệnh truyền nhiễm cấp tính lây theo đường ăn uống Vi khuẩn V parahaemolyticus gây hai hội chứng lâm sàng khác biệt tiêu chày kiểu tá nhẹ tiêu chảy phân có nhiều máu, kèm theo đau bụng sốt, kiểu lỵ trực khuẩn Thơng thường bệnh nhẹ nguy hiểm, song phát chậm không điều trị kịp thời có the gây tử vong Hiện nay, V parahaemolyticus xác nhận nguyên nhân gây nhiều vụ ngộ độc thức ăn ăn cá biên hái sản Trong khoảng 50 năm qua, người ta nghiên cửu nhiều loại vi khuẩn Các nhà khoa học lo ngại biến đối khí hậu, nhiệt độ tăng lên dẫn đến tăng vọt bất ngờ đột ngột cùa V parahaemolyticus - loại vi khuân thời có vè chi gây nhiễm khuẩn nhẹ Dịch tề học cùa vi khuẩn 3.3.3 pH pH mơi trường có ý nghĩa to lớn sinh trưởng phát triển cùa vi sinh vật, lồi vi sinh vật có giới hạn pH thích hợp lon H+ OH - hai ion hoạt động lớn tất cà ion, biến đơi dù nhó nồng độ chúng có ánh hường đến sinh trưởng phát triền vi sinh vật Vì mục đích việc ni cấy vi khuấn độ pH khác điều kiện dinh dưỡng, độ mặn 0,5% nhiệt độ 28"c đế xác định độ pH thích họp cùa vi khuẩn Kct tốc độ tăng trường vi khuẩn độ pH qua đồ thị sau: Đồ thị 3.4: Ảnh hướng pH đến khả tăng trưởng vi khuẩn Dựa vào đồ thị cho thấy vi khuẩn có khả sinh trướng phát triến hai môi trường có tính acid mơi trường có tính kiềm, mơi trường kiềm mơi trường thích hợp cho tăng trường gây bệnh loài với mật độ vi khuân cao đạt 107 tb/ml pH 8,5 Trong mơi trường có tính acid vi khuấn sinh trưởng phát triển tốt pH 6,5 Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội 3.4 Kot thử khả kháng kháng sinh Trong thí nghiệm này, đánh giá khả kháng kháng sinh cùa chùng vi khuẩn phân lập A3.3, A3.13, LBT6, HH3.30, HH3.34, N18.1.I, N20.M2(2) với loại kháng sinh cho phép sử dụng động vật thúy sản là: Ampicilin 25 pg, Gentamycin 3()pg, Norfloxacin l()pg, Enroíloxacin 5pg, Erythromycin 15pg Kết thứ nghiệm kháng sinh thề (Bảng 3.3)và (Hình 3.8) Bảng 3.3: Kết khả kháng kháng sinh chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Kết Kháng sinh A3.3 D A3.13 LBT6 HH3.30 HH3.34 N18.1.1 D D D D D R ,A0 lện Đại học Ampicilin 25pg i1 Gentamycin30pg 14 R 15 R R Norfloxacin lOpg 18 I 18 I 24 s 18 I Enrofloxacin5pg 16 22 s 17 I 23 Erythromycin 15pg 0 R 14 R 12 6., 11 • viẹ R N20.M2(2) D R R R 15 R R 24 s 18 R s R R R R 14 R R R rfà Nọi S: Nhạy (>20 mm), I: Nhạy trung bình (15-19 mm), R: Kháng (