đánh giá hoạt tính kháng vi nấm neoscytalidium sp gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long của nano bạc tổng hợp bằng phương pháp sinh học sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng arachis pintoi

GÂY BỆNH ĐỐM NÂU TRÊN CÂY THANH LONG CỦA NANO BẠC TỔNG HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC SỬ DỤNG DỊCH CHIẾT CỎ ĐẬU PHỘNG Arachis pintoi KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHIỆP - MÔ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG VI NẤM Neoscytalidium sp

GÂY BỆNH ĐỐM NÂU TRÊN CÂY THANH LONG CỦA NANO BẠC TỔNG HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC SỬ DỤNG

DỊCH CHIẾT CỎ ĐẬU PHỘNG (Arachis pintoi)

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHIỆP - MÔI TRƯỜNG

GVHD: ThS Nguyễn Văn Minh GVĐHD: ThS Nguyễn Phụng Anh SVTH: Lê Thị Bích Hằng

MSSV: 1553010052 Khóa: 2015 - 2019

Bình Dương, tháng 5 năm 2019

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG VI NẤM Neoscytalidium sp GÂY

BỆNH ĐỐM NÂU TRÊN CÂY THANH LONG CỦA NANO BẠC TỔNG HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC SỬ DỤNG DỊCH

CHIẾT CỎ ĐẬU PHỘNG (Arachis pintoi)

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHIỆP - MÔI TRƯỜNG

GVĐHD: ThS Nguyễn Phụng Anh SVTH: Lê Thị Bích Hằng

Khóa: 2015 - 2019

Bình Dương, tháng 5 năm 2019

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Nguyễn Văn Minh và

ThS Nguyễn Phụng Anh đã tận tình truyền đạt cho em nguồn kiến thức và hướng

dẫn, giúp em hoàn thành đề tài trong suốt thời gian qua Đồng thời em cũng xin gửi

lời cảm ơn đến TS Nguyễn Trí tại viện Công nghệ Hóa học đã giúp đỡ, trao cho

em kiến thức và hướng dẫn cách làm việc, làm đề tài một cách đạt nhất

Em xin cảm ơn anh Nguyễn Thương Toàn và anh Trần Kiến Đức tại PTN

Công nghệ Vi sinh đã hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức tinh tế, chỉnh sửa và

góp ý cho em dù những việc nhỏ khi làm thí nghiệm và bài làm của em

Đồng thời, em cũng xin cảm ơn các anh chị, các bạn, các em đã và đang học việc

tại PTN Công nghệ Vi sinh trong thời gian qua đã giúp đỡ, trao dồi cho em những

kiến thức trong phòng thí nghiệm Đặc biệt là cảm ơn bạn Lương Thị Cẩm Vân đã

giúp đỡ em nhiều và thường xuyên hỗ trợ em hoàn thành đề tài

Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời tri ân chân thành đến các thầy cô trường Đại

học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và giúp em được học tập tại một

nơi có uy tín và chuyên môn cao Đặc biệt, cảm ơn ban chủ nhiệm bộ môn công

nghệ sinh học cùng tất cả các thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá

trình học tập tại trường

Em xin cảm ơn các thầy cô Hội đồng chấm bài đã dành thời gian xem xét bài báo

cáo cho em Em rất mong được nhận nhiều ý kiến đóng góp quý báu từ thầy, cô

Cuối cùng, con xin cảm ơn cha mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn

động viên, cổ vũ tinh thần và tạo mọi điều kiện cho con trong suốt quá trình học tập

Xin chúc quý thầy cô và những người đã luôn quan tâm giúp đỡ em thật dồi dào

sức khỏe, thành công trong công việc và cuộc sống

Em xin chân thành cám ơn!

Sinh viên thực hiện

Lê Thị Bích Hằng

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Bảng kết quả đường kính vòng kháng nấm của các mẫu nano bạc 43 Bảng 3.2 Bảng thống kê phần trăm kháng nấm của mẫu AgNPs dd so với đối chứng (DC) qua 5 ngày (%) 44 Bảng 3.3 Bảng thống kê phần trăm kháng nấm của mẫu AgNPs so với đối chứng (DC) qua 5 ngày (%) 48 Bảng 3.4 Bảng thống kê phần trăm kháng nấm của mẫu (2Ag – 1Mn)NPs so với đối chứng (DC) qua 5 ngày (%) 52

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cây thanh long 4

Hình 1.2: Bệnh đốm nâu trên cành và quả thanh long 5

Hình 1.3: Vị trí cấu trúc vùng gen ITS rDNA của nấm 10

Hình 1.4: Cỏ đậu phộng (Arachis pintoi) 15

Hình 3.1: (A) Mặt trước và (B) mặt sau đại thể của nấm Neoscytalidium sp 31

Hình 3.2: Vi thể của nấm Neoscytalidium sp quan sát dưới vật kính 40X của kính hiển vi quang học 32

Hình 3.3: Kích thước bào tử của Neoscytalidium sp 32

Hình 3.4: Kết quả giải trình tự chủng nấm Neoscytalidium sp 34

Hình 3.5: Ảnh BLAST trình tự đã giải trên NCBI của chủng Neoscytalidium sp 35

Hình 3.6: Kết quả dựng cây phả hệ bằng phương pháp Maximum parsimony 36

Hình 3.7: Mẫu AgNPs trước và (B) sau 2h chiếu sáng bằng đèn ánh sáng mặt trời nhân tạo ở 40 ℃ 37

Hình 3.8: Ảnh TEM của mẫu AgNPs 37

Hình 3.9: (A) Mẫu (2Ag - 1Mn)NPs trước và (B) sau 2 giờ chiếu sáng bằng đèn ánh sáng mặt trời nhân tạo ở 40 ℃ 38

Hình 3.10: Ảnh TEM của mẫu (2Ag – 1Mn)NPs 39

Hình 3.11: (B) Mẫu AgNPs dd trước và (B) sau 2 giờ chiếu sáng bằng đèn ánh sáng mặt trời nhân tạo ở 40 ℃ 39

Hình 3.12: Ảnh TEM của mẫu AgNPs dd 41

Hình 3.13: Dung dịch nano bạc trước ly tâm, (B) Dung dịch nano bạc sau ly tâm 30 phút (5000v/ph), (C) Dung dịch nano bạc còn 1/10 so với dung dịch nano bạc ban đầu 42

Hình 3.14: Kết quả định tính kháng nấm của 3 mẫu nano bạc: (A) AgNPs dd, (B) AgNPs, (C) (2Ag - 1Mn)NPs 43

Hình 3.27: Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của mẫu (2Ag – 1Mn)NPs ngày thứ 3 54

ngày thứ 4 54

ngày thứ 5 55

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Phổ UV - VIS của mẫu AgNPs dd 40 Biểu đồ 3.2 Phân bố kích thước hạt của mẫu AgNPs dd 41

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 22

MỤC LỤC

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1 Cây thanh long 4

2 Bệnh đốm nâu trên cây thanh long 5

2.1 Tình trạng bệnh 5

2.2 Tác nhân gây bệnh 6

2.3 Triệu chứng bệnh 6

2.4 Cách phòng bệnh 7

2.5 Biện pháp canh tác 7

2.6 Sử dụng giống sạch bệnh 7

2.7 Biện pháp sinh học 8

2.8 Biện pháp hóa học 8

3 Kỹ thuật định danh bằng phương pháp sinh học phân tử (PCR) 8

3.1 Định nghĩa PCR 8

3.2 Nguyên tắc 8

3.3 Vùng ITS5 - ITS4 rDNA 9

4 Tổng quan về nano bạc (AgNPs) 10

4.1 Lợi ích của nano bạc 11

4.2 Tính chất chung của nano bạc 11

4.3 Khả năng kháng vi khuẩn và vi nấm của nano bạc 12

4.4 Các phương pháp tổng hợp nano bạc 13

4.5 Phương pháp hóa học 13

4.6 Phương pháp vật lý 13

4.7 Phương pháp hóa lý 13

5 Tổng hợp nano bạc bằng phương pháp hóa học xanh 14

6 Tổng quan về cỏ đậu phộng 15

7 Tình hình nghiên cứu 16

7.1 Trên thế giới 16

7.2 Trong nước 17

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20

2 Vật liệu 20

3 Thiết bị và dụng cụ 20

3.1 Thiết bị 20

3.2 Dụng cụ 20

3.3 Môi trường, hóa chất, thuốc nhuộm 21

4 Phương pháp thí nghiệm 22

4.1 Kiểm tra, tái phân lập chủng nấm Neoscytalidium sp 22

4.2 Định danh sinh học phân tử 23

4.3 Tổng hợp nano bạc bằng phương pháp sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng làm tác nhân khử và ổn định (kế thừa qui trình tổng hợp nano bạc từ Viện Công nghệ Hóa học) 23

4.3.1 Tổng hợp nano bạc sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng làm tác nhân khử và ổn định (AgNPs) 23

4.3.2 Tổng hợp nano bạc sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng làm tác nhân khử và ổn định, ly tâm tạo dung dịch nano bạc đậm đặc 1/10 dung dịch nano bạc ban đầu (AgNPs dd - nano bạc đậm đặc) 24

4.3.3 Tổng hợp nano bạc sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng làm tác nhân khử và ổn định, bổ sung KMnO4 ((2Ag-1Mn)NPs) 26

4.4 Xác định khả năng kháng nấm Neoscytalidium sp của 3 mẫu nano bạc tổng

hợp ở mục 4.2 bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch 28

4.4.1 Nguyên tắc 28

4.4.2 Cách tiến hành 28

4.4.3 Cách đọc kết quả 29

4.5 Xác định phần trăm kháng nấm Neoscytalidium sp của 3 mẫu nano bạc tổng hợp ở mục 4.2 bằng phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 29

4.5.1 Nguyên tắc 29

4.5.2 Cách tiến hành 29

4.5.3 Đọc kết quả 29

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

1 Kết quả kiểm tra chủng nấm Neoscytalidium sp 31

2 Kết quả định danh sinh học phân tử 33

2.1 Kết quả giải trình tự 33

3 Kết quả tổng hợp nano bạc 36

4 Kết quả định tính bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch 42

5 Kết quả định lượng kháng nấm của 3 mẫu nano bạc qua từng ngày 44

5.1 Kết quả định lượng kháng nấm của mẫu AgNPs dd qua 5 ngày: 44

5.2 Kết quả định lượng kháng nấm của mẫu AgNPs qua 5 ngày: 48

5.3 Kết quả định lượng kháng nấm của mẫu (2Ag – 1Mn)NPs qua 5 ngày: 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

Tiếng Việt 59

Tiếng Anh 60

Internet 63

PHỤ LỤC 64

DANH MỤC VIẾT TẮT

1/10 so với dung dịch nano bạc ban đầu

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ở nước ta, thanh long được sản xuất tập trung tại 3 tỉnh Bình Thuận, Tiền Giang

và Long An Trong đó, Bình Thuận là tỉnh có diện tích thanh long lớn nhất cả nước, với 26.026 ha, với diện tích cho thu hoạch là 21.349 ha và sản lượng thanh long hàng năm của Bình Thuận đạt trên 550.000 (Trần Thị Thu Hà và cs., 2017) Huyện Hàm Thuận Bắc, Bình Thuận là nơi có thời tiết thay đổi thất thường, tạo điều kiện thuận lợi để bệnh đốm nâu phát triển Toàn huyện hiện có trên 74 ha thanh long nhiễm đốm nâu (tỷ lệ bệnh là 5 - 10%) Diện tích nhiễm bệnh ngày càng tăng cao qua các tuần, đặc biệt là những vườn năm trước đã bị nhiễm bệnh, vườn không

thoát được nước và vệ sinh kém tạo điều kiện phát triển bệnh đốm nâu - một trong

số bệnh nặng nhất (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2018)

Neoscytalidium dimidiatum được xác định là tác nhân gây bệnh đốm nâu trên thanh

long (Võ Thị Thu Oanh và cs., 2014) Hiện tại các loại thuốc hóa học như Nativo, RidomilGold, Cabrio Top…được sử dụng nhiều nhưng chưa thật sự hiệu quả, còn khiến bệnh ngày càng lan rộng, giảm đa dạng hệ sinh thái nông nghiệp, ảnh hưởng đến sức khỏe con người

Gần đây, có nhiều hướng nghiên cứu mới dùng nano bạc trong y học, công nghiệp và đặc biệt là nông nghiệp để phòng trừ các loại nấm gây bệnh trên cây trồng Theo nghiên cứu của Ngoc và cs., 2018 đã nghiên cứu chế tạo nano bạc –

chitosan ức chế nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây

thanh long Việc tổng hợp nano bạc bằng phương pháp hóa học gây độc hại và tạo

ra nhiều sản phẩm phụ, gây ảnh hưởng lớn đến môi trường, trong khi tổng hợp nano bạc bằng phương pháp vật lý lại làm tiêu tốn năng lượng Khi đó phương pháp hóa học xanh sử dụng các thực thể sinh học như vi sinh vật, chiết xuất thực vật hoặc sinh khối thực vật để sản xuất các hạt nano, giúp khắc khục những hạn chế của phương pháp hóa học và vật lý, thân thiện với môi trường (Ahmed và cs., 2016)

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cỏ đậu phộng (Arachis pintoi) là loại cỏ

dại dễ mọc, hơn nữa trong quá trình nghiên cứu đã tìm ra các hợp chất polyphenol, flavonoid… có khả năng làm tác nhân khử và ổn định trong quá trình tổng hợp nano

bạc Tổng hợp nano bạc bằng phương pháp hóa học xanh sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng làm tác nhân khử và ổn định do cỏ đậu phộng là nguyên liệu dễ tìm thấy, tiết kiệm chi phí sản xuất, tận dụng nguồn tài nguyên sẵn có Chính vì thế, việc tìm ra phương pháp sản xuất nano bạc thân thiện với môi trường, có khả năng ức chế vi

nấm bệnh Neoscytalidium sp giúp kiểm soát tình trạng bệnh đốm nâu trên cây

thanh long

Từ những lý do trên, tôi thực hiện đề tài “Đánh giá hoạt tính kháng vi nấm

Neoscytalidium sp gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long của nano bạc tổng

hợp bằng phương pháp sinh học sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng (Arachis

pintoi)” nhằm hướng đến tạo ra sản phẩm nano bạc tổng hợp bằng phương pháp

hóa học xanh nhằm kiểm soát được bệnh đốm nâu trên cây thanh long và góp phần đưa ra một phương pháp phòng trừ bệnh thân thiện với môi trường

Nội dung nghiên cứu:

⮚ Kiểm tra, tái phân lập và định danh sinh học phân tử nấm Neoscytalidium sp

gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long

⮚ Tổng hợp hợp nano bạc có kích thước nhỏ có khả năng ức chế nấm

Neoscytalidium sp bằng phương pháp sinh học sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng

làm chất khử và ổn định

⮚ Định tính khả năng kháng vi nấm Neoscytalidium sp gây bệnh đốm nâu trên

cây thanh long của nano bạc bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch

⮚ Định lượng khả năng kháng vi nấm Neoscytalidium sp gây bệnh đốm nâu

trên cây thanh long của nano bạc bằng phương pháp nồng độ ức chế tối thiểu đĩa thạch

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Cây thanh long

Hình 1.1: Cây thanh long

Thanh long là một loài cây của họ xương rồng, thuộc chi Hylocereus, có nguồn

gốc từ Mexico, Trung và Nam Mỹ Cây thanh long cũng được trồng ở các nước Đông Nam Á cũng như Việt Nam và Malaysia (Zainoldin, 2009)

Có ba loài thanh long thuộc chi Hylocereus và một loài thuộc chi Selenicereus Các giống Hylocereus guatemalensis, Hylocereus polyrhizus và Hylocereus undatus

cũng như các giống lai của ba loài này được trồng thương mại trên toàn thế giới

Hylocereus undatus quả có thịt trắng với vỏ hồng, Hylocereus polyrhizus quả có thịt

đỏ vỏ hồng trong khi Selenicereus megalanthus quả có thịt trắng vỏ vàng

2 Bệnh đốm nâu trên cây thanh long

Hình 1.2: Bệnh đốm nâu trên cành và quả thanh long

đốm nâu cũng được phát hiện và báo cáo đầu tiên là do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra (Lan và cs., 2011) Theo nghiên cứu của Mohd và cs., 2013, tại Malaysia, bệnh đốm nâu trên cây thanh long do vi nấm Neoscytalidium dimidiatum

gây ra

Tại Việt Nam, bệnh đốm nâu xuất hiện rải rác vào năm 2008 ở Bình Thuận với diện tích và tỉ lệ nhiễm rất ít Đến đầu mùa mưa năm 2012 bệnh lây lan mạnh với diện tích gần 1.000 ha, tỉ lệ nhiễm nặng từ 10 % trở lên chiếm trên 80 % và bệnh đã

có mặt ở khắp 3 vùng trồng thanh long tập trung của Việt Nam là Bình Thuận, Tiền Giang và Long An Theo báo cáo của ngành nông nghiệp các địa phương, tháng 6/2013 diện tích nhiễm bệnh đốm nâu đã lên đến gần 3.000 ha, tỉ lệ gây hại từ 20 đến 50 % (Nguyễn Hữu Cầu, 2013) Tính đến tháng 7/2015, toàn tỉnh có 6.846 ha

thanh long nhiễm bệnh đốm nâu, tăng 2.309 ha so với tháng 6/2015 và tăng 5.668

ha so với cùng kỳ năm 2014 (Theo chi cục BVTV tinh Bình Thuận báo Dân Việt

Theo mô tả của Mohd và cs., (2013) đại thể nấm có đặc điểm như sau: lông hoặc

lông mịn, tản nấm có màu xám và hình thành sắc tố đen trên PDA Neoscytalidium dimidiatum phát triển rất nhanh và xâm chiếm các đĩa trong vòng 3 ngày Tốc độ

tăng trưởng là 3 cm/ngày trên môi trường PDA Bào tử hình elip, hình trứng, hình que hoặc hình tròn, có màu trong suốt, khi trưởng thành có màu nâu và hình thành hai vách ngăn với kích thước 10,99 ± 0,35 × 5,02 ± 0,44 µm Đối với sợi nấm, các sợi nấm phân nhánh, hình thành vách ngăn và tự tách ra thành bào tử đốt Bào tử đốt hình thành rất nhanh chỉ sau 2 ngày nuôi cấy, có màu nâu nhạt đến nâu sẫm, có 0 - 1

vách ngăn

2.4 Triệu chứng bệnh

Qua nghiên cứu của Mohd và cs 2008 và 2009 của thanh long ở Malaysia, bệnh

xuất với vết trũng tròn nhỏ trên bề mặt cả thân và quả, tạo ra những vết màu cam và dẫn đến thối mục thân Theo mô tả của Lan và cs., 2012, bệnh xuất hiện nhiều đốm nhỏ trên cành Tại Việt Nam, theo mô tả của Viện Cây Ăn Quả Miền Nam, triệu chứng bệnh trên cành khi mới xuất hiện, vết bệnh là những chấm li ti (như vết kim châm) nhỏ hơi lõm vào bề mặt bẹ hoặc trái và chuyển sang màu trắng sau khoảng 3

- 4 ngày Về sau vết bệnh xuất hiện những chấm nhỏ màu cam ở vị trí trung tâm được bao bọc bởi vòng tròn màu vàng sau 10 đến 20 ngày và dần dần vết bệnh nổi lên thành đốm tròn màu nâu sau 18 đến 20 ngày Khi gặp điều kiện thời tiết thuận lợi, các vết bệnh phát triển lan rộng ra, liên kết nhau thành từng mảng lớn làm sần sùi bề mặt cành Trên quả, bệnh tấn công và gây hại ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng của quả, đặc biệt ở giai đoạn sau trổ hoa và giai đoạn chuẩn bị chín Triệu chứng bệnh gây hại trên quả cũng tương tự như trên cành

Theo Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2016 từ năm 2014, bệnh đốm nâu trên cây thanh long phát triển mạnh và gây thiệt hại lớn cho người trồng trong cả nước, nhất là tại Bình Thuận, Tiền Giang và Long An Tại Bình Thuận, đỉnh điểm

có gần 50 % diện tích thanh long bị nhiễm bệnh Trong đó thanh long là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao ở nhiều tỉnh thành, bệnh đốm nâu do nấm

Neoscytalidium dimidiatum gây ra làm giảm giá trị thương phẩm của trái thanh

long nghiêm trọng (Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2014)

2.5 Cách phòng bệnh

Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn - Cục bảo vệ thực vật, 2014 để phòng chống bệnh đốm nâu trên cây thanh long hiệu quả phải sử dụng biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp bao gồm: các biện pháp canh tác, sử dụng giống sạch,

biện pháp sinh học, biện pháp hóa học

Cắt bỏ những cành, quả bị bệnh, thu gom và xử lý tiêu hủy bằng chế phẩm sinh học

Cắt bỏ những cành non ra trong mùa mưa, cắt tỉa cành già hợp lý để tạo độ thông thoáng, giảm nơi tích lũy nguồn bệnh và giảm ẩm độ trong vườn

Sử dụng giống sạch bệnh

Sử dụng giống sạch bệnh để trồng, tuyệt đối không sử dụng cành bị bệnh để

trồng, không sản xuất giống ở khu vực thanh long đã bị nhiễm bệnh

Biện pháp sinh học

Sử dụng chế phẩm vi sinh trộn với phân hữu cơ bón vào đất để tăng khả năng

kiểm soát nguồn bệnh trong đất

Biện pháp hóa học

Rắc vôi bột khử trùng trên mặt đất với liều lượng 1 – 2 tấn/ha

Thường xuyên kiểm tra vườn, phát hiện bệnh sớm khi mới chớm xuất hiện kịp thời để ngăn ngừa bệnh phát tán Tạm thời sử dụng các thuốc chứa hoạt chất gốc

đồng, hỗn hợp chất Azoxitrobin + Difenoconazole để phòng trừ bệnh đốm nâu

3 Kỹ thuật định danh bằng phương pháp sinh học phân tử (PCR) 3.1 Định nghĩa PCR

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction Phương pháp này được Kary Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988 PCR là kỹ thuật phản ứng khuếch đại các đoạn DNA trong ống nghiệm (in vitro) số bản sao nhân lên hàng triệu lần trong vòng vài giờ thông qua 20 – 30 chu kỳ nhiệt, mỗi chu kỳ bao gồm ba mức nhiệt độ: biến tính ở 90 – 95 oC, bắt cặp với mồi ở 40 – 65 oC hoặc hơn và tổng hợp mạch mới nhờ DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase) ở 70

học, chọn giống và trong nhiều lĩnh vực khác (Nguyễn Hoàng Lộc và cs., 2007)

3.2 Nguyên tắc

PCR là quá trình khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu trong điều kiện in vitro dưới xúc tác của enzyme DNA polymerase PCR cho phép khuếch đại theo cấp số nhân các đoạn DNA khuôn mẫu Đoạn DNA khuôn mẫu đã khuếch đại được nhận diện bằng cặp mồi đặc hiệu: mồi xuôi và mồi ngược có chiều dài khoảng 18 –

25 nucleotide Sự khuếch đại này được thực hiện nhờ các chu kì nhiệt lặp lại Mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn: biến tính (denaturation), bắt cặp (annealing), kéo dài (extension) được lặp lại khoảng 20 – 35 chu kì:

− Giai đoạn biến tính DNA (denaturation): Hỗn hợp phản ứng được nâng nhiệt

phút Ở nhiệt độ này các liên kết hydro của phân tử DNA bị đứt làm tất cả các mạch xoắn kép của DNA đề được tách ra tạo thành các sợi đơn dùng làm khuôn cho các đoạn mồi và DNA polymerase

mồi) cho phép các mồi bắt cặp với DNA mục tiêu theo nguyên tắc bổ sung Trong

dài trình tự mồi và mức độ đặc hiệu cần thiết cho từng phản ứng PCR cụ thể

− Giai đoạn kéo dài: nhiệt độ nâng lên khoảng 72 oC, ở nhiệt độ này DNA polymerase hoạt động tốt nhất kéo dài các mạch DNA Thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài khoảng 0 giây đến vài phút Mỗi phản ứng PCR gồm nhiều chu kì liên tục, sản phẩm tạo ra ở chu kì trước là khuôn cho chu kì tiếp theo, nên số lượng bản sao tạo thành tăng theo cấp số nhân Nếu một phản ứng PCR được thực hiện trong 30 chu kì thì số bản sao DNA tạo

ra lên đến 2 mũ 30

Theo Masratul và cs., 2103 từ chủng nấm đã phân lập được qua kiểm tra quan sát

nghiên cứu khác của Đỗ Thị Thanh Dung và cs., 2018, từ chủng nấm phân lập được

từ cây thanh long qua sàng lọc bằng cách kiểm tra hình thái và định danh ở vùng

ITS1 - ITS4, kết quả độ tương đồng 100 % so với nấm Neoscytalidium dimidiatum

Từ những dữ liệu nghiên cứu đã thu thập được, chúng tôi nhận thấy rằng, vùng gen ITS5 - ITS4 có mức độ bảo tồn cao và có thể phân biệt được đến mức độ loài của

chi nấm Neoscytalidium Do đó, trong nghiên cứu này tôi tiến hành định danh nấm Neoscytalidium sp dựa trên vùng ITS5 - ITS4 , vì trong vùng này chứa cả vùng gen

ITS1

3.3 Vùng ITS5 – ITS4 rDNA

Một trong những phương pháp được coi là một khái niệm mới để xác định nhanh chóng và chính xác mẫu nấm chưa biết là mã vạch DNA Mã vạch DNA là một vùng DNA ngắn, biến đổi cao và tiêu chuẩn hóa với chiều dài khoảng 700 nucleotide, được sử dụng như một mô hình độc đáo để xác định các sinh vật sống Vùng DNA được sao chép nội bộ (ITS) của DNA nhân (rDNA) đã trở thành vùng

sử dụng giải trình tự nhiều nhất để xác định phân loại nấm ở cấp loài và thậm chí trong loài Vùng ITS là vùng không mã hóa đa hình cao với đủ đơn vị phân loại Do

đó, nó có thể tách các trình tự thành cấp loài Mặc dù ITS ribosome như một điểm đánh dấu mã vạch phổ quát cho nấm vẫn bị cản trở bởi một vài hạn chế, ITS sẽ vẫn

là lựa chọn chính để xác định nấm Vùng ITS kéo dài từ ITS5 qua 5.8S, ITS2, đến ITS4 đủ dài, chứa đủ các vị trí biến động để xác định mức độ loài (Fajarningsih, 2016)

Hình 1.3: Vị trí cấu trúc vùng gen ITS rDNA của nấm

4 Tổng quan về nano bạc (AgNPs)

Bạc (Ag) là nguyên tố thứ 47 trong hệ thống tuần hoàn, thuộc chu kỳ 5, phân nhóm IB Mạng tinh thể lập phương tâm mặt, nhiệt độ nóng chảy 961,8 ℃ Là kim loại màu sáng trắng, mềm, dát mỏng, có khả năng dẫn diễn và dẫn nhiệt tốt, có khả năng phản xạ ánh sáng cao và đặc biệt có khả năng kháng nấm và kháng khuẩn rất tốt khi ở kích thước nano

Hạt nano bạc (Ag Nano Particles - AgNPs) có kích thước nằm trong khoảng từ 1 đến 100 nm Cho đến thế kỷ XIX, bạc được coi là một tác nhân kháng khuẩn Từ

đó, tính chất kháng khuẩn của bạc đã được nghiên cứu (Abkhoo và cs., 2017) Công nghệ nano đã và đang được nghiên cứu các cách để sản xuất các hạt nano một cách

tiết kiệm chi phí cũng như tận dụng nguồn nguyên liệu có giá trị thấp tạo ra lợi ích lớn và có thể được buôn bán, sử dụng phổ biến trên thị trường Các hạt nano có diện tích bề mặt tiếp xúc lớn và các đặc tính hóa lý hữu ích (Qureyshi và cs., 2016) Công nghệ nano đang hứa hẹn là một lĩnh vực phát triển nhanh chóng với ứng dụng trong khoa học và công nghệ Hạt nano bạc là vật liệu quan trọng đã được nghiên cứu rộng rãi Ngày càng có nhiều nhu cầu phát triển một phương pháp thân thiện với môi trường để tổng hợp các hạt nano không sử dụng các hóa chất độc hại (Nahar và cs., 2015)

4.1 Lợi ích của nano bạc

Các hạt nano bạc (AgNPs) ngày càng được sử dụng trong các lĩnh vực khác nhau, gồm trong y học, thực phẩm, chăm sóc sức khỏe, người tiêu dùng và trong mục đích công nghiệp nhờ các tính năng vật lý và hóa học độc đáo của nó (Zhang

và cs., 2016)

Do tính chất đặc biệt của chúng, chúng đã được sử dụng cho một số ứng dụng, bao gồm làm chất kháng khuẩn, trong các sản phẩm công nghiệp, gia dụng và chăm sóc sức khỏe, trong các sản phẩm tiêu dùng, sơn thiết bị y tế, cảm biến quang học

và mỹ phẩm, trong ngành dược phẩm, ngành công nghiệp thực phẩm, trong chẩn đoán, chỉnh hình, cung cấp thuốc, như tác nhân chống ung thư, và cuối cùng đã tăng cường hiệu quả tiêu diệt khối u của thuốc chống ung thư (Zhang và cs., 2016)

4.2 Tính chất chung của nano bạc

Các cấu trúc nano kim loại quý thu hút nhiều sự quan tâm vì các tính chất độc đáo của chúng, bao gồm các cải tiến trường quang lớn dẫn đến sự tán xạ mạnh và hấp thụ ánh sáng Sự tăng cường tính chất quang và quang của hạt nano kim loại quý phát sinh từ sự dao động cộng hưởng của các electron tự do của chúng khi có ánh sáng, còn được gọi là cộng hưởng plasmon bề mặt cục bộ Sự cộng hưởng của plasmon có thể phát ra ánh sáng, thể hiên tính quang học và cảm biến sinh học, hình ảnh hoặc nhanh chóng được chuyển thành nhiệt (hấp thụ) Các ví dụ về ứng dụng của cấu trúc nano kim loại quý được cung cấp ở đây có thể dễ dàng khái quát hóa cho các lĩnh vực sinh học và y học khác vì vật liệu nano plasmon thể hiện phạm vi lớn, tính linh hoạt và khả năng điều chỉnh hệ thống của các thuộc tính quang học

của chúng (Jain và cs., 2008) Bên cạnh đó ứng dụng có thể thấy cũng rất phổ biến

là kháng nấm, kháng khuẩn được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghệ dệt may, thiết bị y tế, đồ gia dụng…( Wijnhoven và cs., 2009)

4.3 Khả năng kháng vi khuẩn và vi nấm của nano bạc

Bạc được biết đến với khả năng diệt khuẩn rất cao có khả năng tiêu diệt hơn

650 vi sinh vật bao gồm vi khuẩn (gram âm và gram dương), nấm, tuy nhiên, nano bạc không gây ra các tác dụng độc hại đối với cơ thể người và động vật nếu được sử dụng với liều lượng phù hợp Mặc khác, hiện nay cơ chế kháng vi sinh vật

vẫn chưa được hiểu biết một cách rõ ràng (Malarkodi và cs., 2013)

Đối với các ứng dụng y sinh, được thêm vào băng vết thương, kem bôi, thuốc xịt

và vải sát trùng, chức năng bạc là chất khử trùng và hiển thị tác dụng diệt khuẩn rộng đối với vi sinh vật thông qua sự phá vỡ màng đơn bào của chúng do đó làm xáo trộn các hoạt động enzyme của chúng (Ahmed và cs., 2015)

Các hạt nano được sử dụng cho tất cả các lĩnh vực, các hạt nano kim loại có tiềm năng nhất vì chúng có đặc tính kháng khuẩn vượt trội do diện tích bề mặt lớn

dụng trong khử trùng các vi sinh vật gây hại khác nhau Bên cạnh đó nano bạc được biết đến với hoạt tính kháng nấm gây bệnh cây trồng - một nhu cầu cần thiết để phòng trừ bệnh cho cây và phát triển để ứng dụng tốt hơn tăng hiệu quả ức chế bệnh Từ một số nghiên cứu chứng minh rằng khi trong nước chứa oxy, chứa hàm lượng bạc cao sẽ xúc tác và phá hủy hoàn toàn tế bào vi sinh vật (Kim và cs., 2012)

đơn vị ribosome, cũng như làm vô hiệu hóa một số protein tế bào và enzyme cần

hưởng đến chức năng của màng các enzyme, chẳng hạn như các enzyme trong chuỗi hô hấp (Bragg và cs., 1974, McDonnell và cs., 2001), ion bạc có khả năng liên kết mạnh với peptidoglycan - thành phần cấu tạo nên thành tế bào của vi khuẩn

và ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế bào, từ đó dẫn đến làm ức chế

hoạt động của vi khuẩn (Dakal và cs., 2016)

N-dimethylformamide (DMF) và copolyme poly (ethylene glycol) được sử dụng để

thành các cụm oligomeric Những cụm này cuối cùng dẫn đến sự hình thành các hạt bạc keo kim loại (Iravani và cs., 2014)

Phương pháp vật lý

Phương pháp này dùng các tác nhân vật lý như điện tử, sóng điện từ năng lượng cao (như tia gamma, tia tử ngoại, tia laser) khử ion bạc thành hạt nano bạc Dưới tác nhân vật lý, những quá trình biến đổi của dung môi và các chất phụ gia trong dung môi sẽ sinh ra các gốc hóa học có tác dụng khử ion bạc thành bạc kim loại để chúng kết tụ tạo thành các hạt nano bạc Việc không có ô nhiễm dung môi trong các màng mỏng đã chuẩn bị và tính đồng nhất của phân phối nano bạc là những lợi thế của phương pháp tổng hợp vật lý so với các quá trình hóa học Tổng hợp vật lý các nano bạc sử dụng lò ống ở áp suất khí quyển có một số nhược điểm như: lò ống chiếm một không gian rộng, tiêu thụ một lượng năng lượng lớn trong khi tăng nhiệt độ môi trường xung quanh vật liệu nguồn và cần nhiều thời gian để đạt được ổn định nhiệt Hơn nữa, một lò ống đòi hỏi mức tiêu thụ điện năng hơn vài kilowatt và thời

gian làm nóng trước vài chục phút để đạt được nhiệt độ hoạt động ổn định (Iravani

và cs., 2014)

Phương pháp hóa lý

Đây là phương pháp kết hợp giữa hai phương pháp hóa học và vật lý Dùng phương pháp điện phân kết hợp với siêu âm để tạo hạt nano Phương pháp điện

phân thường chỉ có thể tạo được màng mỏng kim loại Các nguyên tử kim loại sau điện phân sẽ tạo các hạt nano bám lên điện cực âm trước khi xảy ra sự hình thành màng Lúc này người ta tác dụng một xung siêu âm đồng bộ với xung điện phân thì hạt nano kim loại sẽ tách khỏi điện cực và đi vào dung dịch Sự tổng hợp các hạt nano theo phương pháp hóa học, vật lí hay hóa lý bằng các tác nhân nêu trên đắt tiền và nguy hiểm (Zhang, 2016) Vì vậy trong những năm gần đây, tổng hợp nano bạc cũng theo phương pháp hóa học nhưng sử dụng các chất có trong tự nhiên thân thiện với môi trường, không độc hại và có giá thành thấp làm tác nhân khử, điển hình là sử dụng dịch chiết từ thực vật đang được quan tâm rất nhiều (hay còn gọi là

“phương pháp hóa học xanh – Greensynthesis”, hay “phương pháp sinh học - Biosynthesis”) Bên cạnh đó có thể kết hợp với chiếu sáng hay gia nhiệt để tăng hiệu quả của quá trình hình thành AgNPs

5 Tổng hợp nano bạc bằng phương pháp hóa học xanh

Trong thập kỷ qua, một số phương pháp vật lý và hóa học đã được phát triển để tổng hợp hạt nano kim loại (Sahu và cs., 2016) Tổng hợp nano bạc bằng phương pháp hóa học, sử dụng độc hại, dẫn đến sinh ra nhiều sản phẩm phụ gây ảnh hưởng đến môi trường; đối với tổng hợp nano bạc bằng phương pháp vật lý tiêu tốn nhiêu năng lượng Do đó, việc tổng hợp nano bạc bằng phương pháp hóa học xanh đang tiến triển như một hướng quan trọng của công nghệ nano, khi sử dụng các thực thể sinh học như vi sinh vật, chiết xuất thực vật hoặc sinh khối thực vật để sản xuất các hạt nano đây là giải pháp thay thế cho phương pháp hóa học và vật lý với mục tiêu chính là thân thiện với môi trường (Ahmed và cs., 2015)

Để tránh hoặc giảm thiểu ảnh hưởng của các tác chất độc hại, gần đây giới khoa học đã bắt đầu áp dụng xu hướng sử dụng hóa học xanh trong việc điều chế nano bạc, với hai tiêu chí luôn phải đảm bảo tính kinh tế và thân thiện với môi trường (Sharma và cs., 2009) Trong số các phương pháp hóa học xanh, phương pháp điều chế nano bạc từ phản ứng giữa tiền chất bạc với các vi chất hữu cơ hoặc chiết xuất

từ thực vật ngày càng nhiều tiềm năng và ưu thế do đây là những tác chất có giá thành thấp, hoạt tính hóa học cao với quy trình sử dụng đơn giản và thân thiện với

môi trường (Rajan và cs., 2015)

Như đã đề cập ở trên, phương pháp này cho phép sử dụng các tác nhân khử

và ổn định dung dịch là các dịch chiết của lá hoặc quả các loại thực vật để tổng hợp dung dịch bạc có kích thước nano với chi phí thấp và thân thiện môi trường như: lá bàng (Linh, 2013), lá tre (Yasin và cs., 2013), tỏi (Rastogi và cs., 2013), nho và cà chua (Zia và cs., 2016), vỏ chuối (Ibrahim và cs., 2015), hạt lựu (Chauhan và cs., 2011), nha đam (Lê Tiến Khoa, 2017),…Theo các tác giả (Makarov và cs., 2014), quá trình khử ion bạc từ dung dịch bạc nitrate và tác nhân khử sẽ xảy ra quá trình chuyển đổi anthraquinone keto-enol tạo thành AgNPs Ngoài việc đóng vai trò như

là một tác nhân khử thì dịch chiết thực vật còn đóng vai trò như một chất ổn định

dung dịch nano bạc được hình thành (Ibrahim, 2015) Trong nghiên cứu này, sử

dụng cỏ đậu phộng - vật liệu dễ tìm, tiết kiệm chi phí và tự nhiên

6 Tổng quan về cỏ đậu phộng

Hình 1.4: Cỏ đậu phộng (Arachis pintoi)

Cỏ đậu phộng (đậu phộng dại) hay còn gọi là lạc dại với tên khoa học là Arachis pintoi thuộc cây họ Đậu Fabaceae Là một loại thực vật có hệ thống thân ngầm và

hạt nằm sâu trong đất, có rễ cọc ăn sâu vào lòng đất và tạo thành thảm dày từ thân

bò, sinh trưởng vô hạn, hoa có màu vàng tươi, hạt nhỏ màu nâu nhạt, rễ có nhiều nốt sần chứa các vi khuẩn cộng sinh có khả năng cố định đạm từ nitơ khí trời rất tốt Thân lá cây cỏ đậu phộng mọc bò có thể dài tới 2 m, phụ thuộc vào môi trường

và cách quản lý, xanh tốt quanh năm, nhất là khi được cắt định kỳ củ đậu phộng dại nhỏ, chui sâu vào đất, ít khi được thu hoạch (Huỳnh Hữu Đoàn, 2017)

Đậu phộng dại dễ trồng, sinh trưởng, phát triển tốt, sinh khối lớn, có khả năng nhân giống vô tính Cây có khả năng sinh trưởng tốt hơn khi được trồng dưới cây

che bóng hơn là khi được trồng ở nơi nắng đầy đủ Đậu phộng dại sống dưới tán

cây, không cạnh tranh ánh sáng với cây trồng chính, cây sinh trưởng quanh năm nên duy trì độ che phủ tốt hạn chế cỏ dại phát triển, chống xói mòn vào mùa mưa và duy trì độ ẩm ổn định trong vườn bưởi vào mùa nắng đây là yếu tố quan trọng giúp cho cây bưởi sinh trưởng và phát triển tốt Đậu phộng dại có thể thích ứng với nhiều loại đất từ đất xấu bạc màu, nghèo dinh dưỡng đến vùng đất phù sa và có khả năng chịu hạn tốt, chịu úng cao, có thể trồng được quanh năm (Huỳnh Hữu Đoàn, 2017)

Cỏ đậu phộng là một loại cây đầy tìm năng có thể sử dụng như: mùn sống trong các cánh đồng trồng rau và vườn cây ăn trái, thức ăn gia súc thức ăn và che phủ mặt đất dọc theo đường cao tốc và vỉa hè (Kartika và cs., 2009)

Đặc biệt qua nhiên cứu của viện Công nghệ Hóa học trong cỏ đậu phộng có các hợp chất polyphenol, flavonoid…có khảng năng làm tác nhân khử và ổn định trong quá trình tổng hợp nano bạc

7 Tình hình nghiên cứu

Hiện này trên thế giới nói chung và trong nước nói riêng đã có nhiều nghiên cứu tổng hợp để phòng trừ các nấm bệnh trên cây trồng và đạt hiệu quả tương đối tốt, với các loại nano bạc ức chế các loài nấm bệnh khác nhau

7.1 Trên thế giới

Năm 2011, Lamsal và cs đã thử nghiệm ứng dụng của nano bạc đối với đối

chứng loài Colletotrichum trong phòng thí nghiệm và thực nghiệm với bệnh thán

thư trên cây tiêu, kết quả cho thấy việc áp dụng nồng độ 100 ppm của các hạt nano bạc đã tạo ra sự ức chế tối đa sự phát triển của sợi nấm cũng như sự nảy mầm của đối chứng trong phòng thí nghiệm Trong các thực nghiệm, sự ức chế của nấm cao đáng kể khi các hạt nano bạc được áp dụng trước khi dịch bệnh bùng phát trên cây Kết quả kính hiển vi điện tử quét cho thấy các hạt nano bạc gây ra tác động bất lợi

đối với sự phát triển sợi nấm của các loài Colletotrichum

Năm 2012, Sang Woo Kim và cs thử nghiệm hoạt tính kháng nấm của 3 loại nano bạc (CV, AT, PR) với 18 chủng nấm gây bệnh trên nhiều loại cây khác nhau

trên 3 loại môi trường (PDA, MEA, CMA) ở các nồng độ khác nhau (10, 25, 50,

100 ppm) Kết quả cho thấy AgNP có đặc tính kháng nấm chống lại các mầm bệnh thực vật này ở các cấp độ khác nhau Thử nghiệm kháng của loại nano bạc CV có tiềm năng kháng nấm cao nhất ức chế hầu hết các loại nấm Kết quả cũng cho thấy

sự ức chế đáng kể nhất của nấm gây bệnh thực vật đã được quan sát thấy trên PDA

và 100 ppm AgNPs

Năm 2012, Kaur và cs thử nghiệm hoạt tính kháng nấm của các hạt nano Ag/Chitosan ức chế mầm bệnh do nấm gây ra từ hạt giống Kết quả hầu hết các loại nấm cho thấy sự ức chế tăng trưởng và mức độ ức chế giống hệt với thuốc kháng

nấm thử nghiệm Ag/Chitosan cho thấy sự ức chế 94 % đối với nấm Aspergillus sp.,

67 % đối với nấm Rhizoctonia sp và 78 % đối với Alternaria sp

Hiện nay, việc sử dụng nano bạc trong nông nghiệp dần được phát triển và đạt hiệu quả cao Bởi những lợi ích mà nano bạc mang lại, nhiều thí nghiệm về nano bạc kháng nấm gây bệnh được thực hiện để tìm ra cách ức chế và phòng trị nấm gây bệnh trên cây trồng một cách tốt nhất và hiệu quả nhất Nhằm góp phần thay đổi dần sử dụng phương thức dùng phân thuốc hóa học sang sinh học, giảm thiểu ảnh hưởng đến sức khỏe người sản xuất và người sử dụng, đồng thời giảm ô nhiễm môi trường

7.2 Trong nước

Năm 2014, Lê Quang Luân và cộng sự nghiên cứu hiệu ứng kháng nấm

Phytophthora capsici gây bệnh chết nhanh ở cây hồ tiêu của chế phẩm nano bạc -

chitosan chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ thu được kết quả khả năng ức chế nấm

P capsici từ 22,6 - 92,9 % của chế phẩm trong khoảng nồng độ tương ứng từ 20 -

100 ppm

Năm 2016, Hà Viết Cường và Trần Thị Định nghiên cứu vi khuẩn

Gluconobacter oxydans bị ức chế ở nồng độ nano bạc là 10 ppm và Lasiodiplodia pseudotheobromae bị ức chế ở nồng độ nano bạc là 15 ppm

Năm 2017, Nguyễn Hoài Châu và cs nghiên cứu chế tạo ra nano bạc ức chế nấm

Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani gây bệnh lở cổ rễ và thối rễ trên cây đậu tương ở Bắc Ninh đạt Hiệu quả ức chế nấm F oxysporum của vật liệu nano

Ag/CTS/Bentonite khi nồng độ bạc là 400 ppm đạt 66,70 %, ức chế nấm R solani

cao nhất đạt 92,82 % sau 2 ngày nuôi cấy Với hoạt tính kháng nấm cao, vật liệu nano Ag/CTS/Bentonite có thể được sử dụng trong thành phần vỏ bọc hạt giống nhằm kiểm soát nấm gây bệnh trên cây trồng

Năm 2017, Nguyễn Duy Hạng và cs đã nghiên cứu hiệu ứng của chế phẩm nano bạc tạo bằng phương pháp chiếu xạ gama phối trộn với kẽm - EDTA ức chế lên

nấm Puccinia spp gây bệnh gỉ sắt trên cây hoa cúc đạt được kết quả làm giảm 100

% tỷ lệ bệnh gỉ sắt do nấm Puccinia spp gây ra và làm cho cây hoa cúc sinh trưởng

tốt hơn

Vì vậy trong nghiên cứu này tôi tiến hành tổng hợp nano bạc sử dụng dịch chiết

cỏ đậu phộng làm tác nhân khử và ổn định để đánh giá hoạt tính kháng nấm

Neoscytalidium sp gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long dựa trên hai phương

pháp: định tính kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch và định lượng xác định nồng độ ức chế tối thiểu

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện trong thời gian từ 2 – 5/2019

⮚ Tại phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Trường Đại học Mở thành phố

Hồ Chí Minh (cơ sở 3), 68 Lê Thị Trung, TP Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương

⮚ Tại Phòng Dầu khí - Xúc tác - Viện Công nghệ Hóa học, số 1 Mạc Đĩnh Chi, phường Bến Nghé, Quận 1, TP Hồ Chí Minh

2 Vật liệu

Chủng vi nấm Neoscytalidium sp được cung cấp từ PTN Công nghệ Vi sinh

(chủng nấm bệnh đã được phân lập và gây bệnh nhân tạo trên cành thanh long cắt rời), Trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh (Cơ sở 3, Bình Dương)

Cỏ đậu phộng được hái từ công viên khu dân cư Hiệp Thành III, phường Hiệp Thành, TP Thủ Dầu Một, Bình Dương

⮚ Que cấy móc, que cấy trang

3.3 Môi trường, hóa chất, thuốc nhuộm

Thuốc nhuộm: Lactophenol

4 Phương pháp nghiên cứu

Sơ đồ bố trí thí nghiệm

4.1 Kiểm tra, tái phân lập chủng nấm Neoscytalidium sp

Sau khi nhận giống vi sinh vật từ phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh Trường Đại học Mở TP HCM chúng tôi tiến hành tái phân lập trên đĩa môi trường

NA đối với vi khuẩn, PDA đối với vi nấm để kiểm tra hình thái đại thể và nhuộm Gram, làm tiêu bản nấm kiểm tra hình thái vi thể

Tiến hành định danh sơ bộ, căn cứ vào đặc điểm hình thái, màu sắc khuẩn lạc

Vi nấm phân lập trên môi trường PDA sau 3 đến 5 ngày thì xuất hiện tơ nấm

Kiểm tra tái phân lập chủng nấm

khử và ổn định

Định tính kháng nấm của nano bạc bằng phương pháp khuếch

tán giếng thạch

Định lượng kháng nấm của nano bạc bằng phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu

BLAST trình tự sau khi nhận kết

quả

Dựng cây phát sinh loài

Dùng que cấy khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn sau đó móc sợi nấm cấy sang đĩa môi trường PDA mới Tiến hành cấy đơn bào tử để tạo khóm nấm đồng nhất Sau khi được khóm nấm đồng nhất, chúng tôi tiến hành nhuộm nấm bằng lactophenol và quan sát dưới kính hiển vi quang học

4.2 Định danh sinh học phân tử

Theo nghiên cứu của Nadiah và cs., 2017, Fernández - Herrera và cs., 2017, vi

nấm Neoscytalidium dimiatum là tác nhân gây bệnh đốm nâu thanh long được định

danh ở vùng gen ITS1 là vùng nằm giữa vùng 18S và 5.8S Một nghiên cứu khác

của Mohd và cs., 2013 đã định danh vi nấm Neoscytalidium dimiatum gây bệnh

đốm nâu trên cây thanh long ở vùng gen ITS4 và ITS5, vì thế trong nghiên cứu này

chủng nấm Neoscytalidium sp sau khi làm thuần được gửi đi định danh dịch vụ tại

công ty TNHH TBR ở vùng gen ITS5 – ITS4 (trong vùng ITS này bao gồm vùng

ITS1 và ITS2)

Giải trình tự vi nấm bằng phương pháp Sanger

Các trình tự đã giải được so sánh với ngân hàng cơ sở dữ liệu trên NCBI bằng công cụ BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), hiệu chỉnh các trình tự có tín hiệu xấu Từ đó, tiến hành xây dựng cây phả hệ phân tử bằng chương trình MEGA 7.0

Kết luận mức độ loài của chủng được định danh

4.3 Tổng hợp nano bạc bằng phương pháp sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng làm tác nhân khử và ổn định (kế thừa qui trình tổng hợp nano bạc từ Viện Công nghệ Hóa học)

Tổng hợp nano bạc sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng làm tác nhân khử và ổn định (AgNPs)

Chuẩn bị dịch chiết cỏ đậu phộng:

hết các tạp chất

− Xay nhuyễn cùng với nước cất, tỉ lệ khối lượng nguyên liệu (cỏ đậu

phộng) và nước cất là

mL

AgNO3

Tạo dung dịch bạc nano:

dịch chiết cho vào lọ thủy tinh có nắp đậy

− Khuấy với tốc độ 300 v/ph trong thời gian 5 phút để tạo hỗn hợp dung dịch đồng nhất

− Bật gia nhiệt đến nhiệt độ 40°C và bật đèn tạo nguồn ánh sáng mặt trời nhân tạo chiếu vào lọ dung dịch phản ứng và bắt đầu tính thời gian quá trình tổng hợp trong thời gian 120 phút

Để kiểm tra nano bạc đã được hình thành, dung dịch được tiến hành phân tích

phổ UV - Vis của mẫu trên máy phân tích UV – 1800

Tổng hợp nano bạc sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng làm tác nhân khử và ổn định,

ly tâm tạo dung dịch nano bạc đậm đặc

- nano bạc đậm đặc)

Chuẩn bị dịch chiết cỏ đậu phộng:

hết các tạp chất

− Rửa bằng nước cất 3 lần sau đó để ráo nước

− Xay nhuyễn cùng với nước cất, tỉ lệ khối lượng nguyên liệu (cỏ đậu

phộng) và nước cất là

mL

AgNO3

Tạo dung dịch bạc nano:

dịch chiết cho vào lọ thủy tinh có nắp đậy

− Khuấy với tốc độ 300 v/ph trong thời gian 5 phút để tạo hỗn hợp dung dịch đồng nhất

− Bật gia nhiệt đến nhiệt độ 40°C và bật đèn tạo nguồn ánh sáng mặt trời nhân tạo chiếu vào lọ dung dịch phản ứng và bắt đầu tính thời gian quá trình tổng hợp trong thời gian 120 phút

tích phổ UV - Vis của mẫu trên máy phân tích UV – 1800

Tạo dung dịch nano bạc đậm đặc:

tâm

− Loại bỏ dịch nổi ở trên, lấy dịch đặc ở đáy ống ly tâm bằng

dung dịch

ban đầu

dung dịch nano bạc đồng nhất

dung dịch ban đầu

Tổng hợp nano bạc sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng làm tác nhân khử và ổn định,

bổ sung KMnO 4 ((2Ag-1Mn)NPs)

Chuẩn bị dịch chiết cỏ đậu phộng:

hết các tạp chất

− Xay nhuyễn cùng với nước cất, tỉ lệ khối lượng nguyên liệu (cỏ đậu

phộng) và nước cất là

− Cân chính xác lượng AgNO3 bằng cân 4 số cho vào bình định mức 100

mL

AgNO3

mL

− Thêm nước cất định mức đến mức 100 mL và tiếp tục lắc đều và đánh siêu

Tạo dung dịch bạc nano:

sẵn ở trên (theo tỉ lệ thể tích là 2/3 AgNO3 và 1/3 KMnO4) và 10 mL dịch chiết cho vào lọ thủy tinh có nắp đậy

− Khuấy với tốc độ 300 v/ph trong thời gian 5 phút để tạo hỗn hợp dung dịch đồng nhất

− Bật gia nhiệt đến nhiệt độ 40°C và bật đèn tạo nguồn ánh sáng mặt trời nhân tạo chiếu vào lọ dung dịch phản ứng và bắt đầu tính thời gian quá trình tổng hợp trong thời gian 120 phút

Để kiểm tra nano bạc đã được hình thành, dung dịch được tiến hành phân tích phổ UV - Vis của mẫu trên máy phân tích UV – 1800

4.4 Đo hình thái bề mặt của các mẫu nano bạc (TEM)

Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron microscopy – TEM) là một thiết bị chụp ảnh tối tân được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như vật

lý, vật liệu, hóa học, y - sinh học và năng lượng nhờ khả năng chụp ảnh chất lượng cao với độ phân giải cấp độ nguyên tử đi kèm với các phép phân tích tinh tế nhờ tương tác giữa chùm điện tử năng lượng cao và mẫu vật TEM là một kỹ thuật hiển

vi sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao (thường từ vài chục kV tới vài trăm hoặc thậm chí trên 1000 kV) chiếu xuyên qua mẫu vật mỏng (thường dưới 200 nm)

để tạo ảnh vi cấu trúc bên trong vật rắn nhờ sử dụng hệ thấu kính từ cho khả năng phóng đại từ vài trăm tới hàng triệu lần Do sử dụng chùm điện tử năng lượng cao, các kết cấu của TEM (súng phóng điện tử, cột điện tử, thấu kính từ, hệ ghi ảnh được đặt trong buồng chân không cao (thậm chí siêu cao) được duy trì nhờ hệ thống bơm chân không tinh vi Sự tạo ảnh ở TEM tương tự như nguyên lý trong các kính hiển vi quang học, chỉ khác là sử dụng sóng điện tử và thấu kính từ Khả năng tạo ra hình ảnh có độ phân giải siêu cao là nhờ bước sóng rất ngắn của chùm điện tử (Ngô Đức Thế, 2015)