BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM HỒ NGUYỄN HOÀNG YẾN KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM MỐC Neoscytalidium dimidiatum GÂY BỆNH ĐỐM NÂU TRÊN.
BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM HỒ NGUYỄN HOÀNG YẾN KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM MỐC Neoscytalidium dimidiatum GÂY BỆNH ĐỐM NÂU TRÊN THANH LONG CỦA VI KHUẨN Bacillus licheniformis D7 Chuyên ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Mã chun ngành: 52420201 KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 THƠNG TIN CHUNG Họ tên sinh viên: Hồ Nguyễn Hoàng Yến MSHV: 17026901 Lớp : DHSH13A Khóa: K13 (2017-2021) Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Mã chuyên ngành: 52420101 SĐT : 0938276298 Email : 22hyho01@gmail.com Tên đề tài : Khảo sát khả ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu long vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 Người hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Diệu Hạnh SĐT : 0982695357 Email : nguyenthidieuhanh@iuh.edu.vn Cơ quan công tác : Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2021 Người hướng dẫn (Ký ghi rõ họ tên) Sinh viên (Ký ghi rõ họ tên) Nguyễn Thị Diệu Hạnh Hồ Nguyễn Hoàng Yến i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này, em nhận giúp đỡ nhiệt tình lời động viên sâu sắc q Thầy Cơ, gia đình bạn bè suốt khoảng thời gian thực đề tài Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, Ban lãnh đạo Viện, Ban quản lý phịng thí nghiệm q Thầy Cơ Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm hỗ trợ sở vật chất tạo điều kiện tốt để em hoàn thành đề tài nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Diệu Hạnh tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm kiến thức chuyên môn giúp em kịp thời giải vấn đề, động viên em lúc khó khăn ln tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành đề tài nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn TS Phạm Tấn Việt TS Nguyễn Ngọc Ẩn quan tâm, bảo ln sẵn lịng hỗ trợ em suốt thời gian thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến tập thể sinh viên làm việc Phịng Thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh thuộc Viện Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm giúp đỡ, san sẻ tạo động lực để em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu Cảm ơn gia đình chia sẻ, hỗ trợ nguồn động viên to lớn suốt thời gian qua Tuy cố gắng nhiều vốn kiến thức, kinh nghiệm thân hạn chế, q trình thực hồn thành đề tài, em khơng tránh khỏi thiếu sót nên mong nhận ý kiến đóng góp quý Thầy Cơ để em hồn thiện Cuối cùng, em xin kính chúc q Thầy Cơ ln dồi sức khỏe gặt hái nhiều thành công công việc sống Em xin chân thành cảm ơn! ii TÓM TẮT Thanh long loại trái giàu dinh dưỡng có giá trị kinh tế cao Tuy nhiên, từ năm 2008-2009, long xuất bệnh có tên gọi bệnh đốm nâu Bệnh đốm nâu làm cho thân long xuất đốm cam hình trịn nhỏ, trũng xuống, đốm đen thối rữa, làm thiệt hại nghiêm trọng đến chất lượng suất trồng Chủng nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum xác định nguyên nhân gây bệnh đốm nâu long Do đó, nhằm tìm đối tượng vi sinh vật có khả kiểm sốt hiệu bệnh đốm nâu N dimidiatum gây an tồn mơi trường, chúng tơi khảo sát khả ức chế sinh trưởng phát triển nấm N dimidiatum chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 Dịch nuôi cấy chủng B licheniformis D7 có khả ức chế nảy mầm làm biến dạng cấu trúc bào tử mốc tế bào hệ sợi tơ nấm Bên cạnh đó, dịch ni cấy vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mốc tốt điều kiện nhiệt độ phòng pH 7.0 Thêm vào đó, dịch ni cấy chủng B licheniformis D7 có khả ức chế phát triển bệnh đốm nâu N dimidiatum gây làm giảm mức độ bệnh long Hơn nữa, dịch ni cấy vi khuẩn cịn cho thấy có khả ngăn ngừa hồn tồn phát triển bệnh thân long 21 ngày gây nhiễm với mốc N dimidiatum Nghiên cứu cho thấy chủng vi khuẩn B licheniformis D7 có tiềm việc ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học để kiểm soát bệnh nấm mốc N dimidiatum gây nhằm phục vụ cho ngành trồng long nước ta iii MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ẢNH vii DANH MỤC BẢNG BIỂU ix MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Chi Bacillus 1.1.1 Đặc điểm chung 1.1.2 Bacillus licheniformis 1.1.3 Khả sinh tổng hợp hợp chất kháng mốc Bacillus licheniformis 1.2 Neoscytalidium dimidiatum 1.2.1 Đặc điểm 1.2.2 Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu long 10 1.3 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 12 1.3.1 Một số nghiên cứu nước 12 1.3.2 Một số nghiên cứu nước 13 1.3.3 Đánh giá kết cơng trình nghiên cứu cơng bố 13 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 15 2.1 Nguyên vật liệu 15 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Bố trí thí nghiệm 18 iv 2.2.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 18 2.2.2.1 Phương pháp bảo quản giống vi khuẩn 18 2.2.2.2 Phương pháp bảo quản bào tử nấm mốc 19 2.2.2.3 Phương pháp bảo quản hệ sợi tơ nấm mốc 19 2.2.3 Phương pháp thu nhận dịch nuôi cấy vi khuẩn 19 2.2.4 Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch 19 2.2.5 Phương pháp xây dựng đường cong tăng trưởng vi khuẩn 20 2.2.6 Phương pháp khảo sát thành phần khác dịch nuôi cấy vi khuẩn lên hoạt tính ức chế nấm mốc 20 2.2.7 Phương pháp khảo sát tác động dịch nuôi cấy vi khuẩn lên nảy mầm bào tử nấm mốc 20 2.2.8 Phương pháp khảo sát tác động dịch nuôi cấy vi khuẩn lên phát triển hệ sợi tơ nấm mốc 21 2.2.9 Phương pháp khảo sát khả bền nhiệt, bền pH dịch nuôi cấy vi khuẩn lên hoạt tính ức chế phát triển nấm mốc 21 2.2.10 Phương pháp kiểm tra hiệu ngăn ngừa bệnh đốm nâu nấm mốc gây long dịch nuôi cấy vi khuẩn 22 2.2.11 Phương pháp xử lí số liệu 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1 Định danh chủng nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum 24 3.2 Định danh chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 26 3.3 Kết sơ khả ức chế sinh trưởng phát triển nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 29 v 3.4 Đường cong tăng trưởng chủng Bacillus licheniformis D7 30 3.5 Ảnh hưởng thời gian ni cấy lên hoạt tính ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum dịch nuôi cấy chủng vi khẩn Bacillus licheniformis D7 31 3.6 Tác động dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên nảy mầm bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum 32 3.7 Tác động dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên phát triển hệ sợi tơ nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum 36 3.8 Khả bền nhiệt bền pH dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên hoạt tính ức chế nấm mốc Neoscytlidium dimidiatum .38 3.8.1 Khả bền nhiệt 38 3.8.2 Khả bền pH 40 3.9 Hiệu ngăn ngừa bệnh đốm nâu long nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 42 CHƯƠNG KẾT LUẬN 45 4.1 Kết luận 45 4.2 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC 54 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình thái đại thể vi thể chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis Hình 1.2 Hình thái đại thể vi thể nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum 10 Hình 1.3 Các giai đoạn phát triển bệnh thối thân Neoscytalidium dimidiatum gây long 12 Hình 1.4 Bệnh đốm nâu thân long 12 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 18 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc nấm mốc HY ngày nuôi cấy môi trường PGA 24 Hình 3.2 Hình thái vi thể chủng nấm mốc HY 25 Hình 3.3 Tỉ lệ tương đồng (gene mã hóa cho 18S-rRNA) chủng HY với loài lân cận 25 Hình 3.4 Cây phả hệ chủng HY với loài lân cận 26 Hình 3.5 Hình thái khuẩn lạc khả sinh catalase chủng vi khuẩn Bacillus sp D7 27 Hình 3.6 Hình thái vi thể chủng Bacillus sp D7 nhuộm Gram nhuộm bào tử 27 Hình 3.7 Tỉ lệ tương đồng (gene mã hóa cho 16S-rRNA) chủng Bacillus sp D7 với loài lân cận 28 Hình 3.8 Cây phả hệ chủng Bacillus sp D7 với loài lân cận 28 Hình 3.9 Khả đối kháng nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 29 vii Hình 3.10 Ảnh hưởng thành phần khác dịch nuôi cấy vi khuẩn lên khả ức chế sinh trưởng phát triển nấm mốc 30 Hình 3.11 Đường cong tăng trưởng chủng Bacillus licheniformis D7 môi trường LB 31 Hình 3.12 Ảnh hưởng thời gian ni cấy lên hoạt tính ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 32 Hình 3.13 Tác động dịch ni cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên hình thái khả nảy mầm bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum 34 Hình 3.14 Tác động dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên sinh trưởng bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum 35 Hình 3.15 Tác động dịch ni cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên hình thái phát triển hệ sợi tơ nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum 37 Hình 3.16 Phần trăm hoạt tính kháng mốc Neoscytalidium dimidiatum cịn lại dịch ni cấy chủng Bacillus licheniformis D7 nhiệt độ khác thời gian 30 phút 39 Hình 3.17 Phần trăm hoạt tính kháng mốc Neoscytalidium dimidiatum cịn lại dịch ni cấy chủng Bacillus licheniformis D7 giá trị pH khác thời gian 41 Hình 3.18 Hiệu ngăn ngừa bệnh đốm nâu Neoscytalidium dimidiatum gây long dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 43 Hình 3.19 Hiệu ngăn ngừa bệnh đốm nâu Neoscytalidium dimidiatum gây thân long dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 44 viii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Một số thiết bị dụng cụ 15 Bảng 2.2 Một số hóa chất 16 Bảng 2.3 Thành phần số môi trường sử dụng nghiên cứu 16 Bảng 2.4 Một số nguyên vật liệu sử dụng nghiên cứu 17 Bảng 3.1 Ảnh hưởng dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 nảy mầm bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum tỉ lệ thời gian khác 33 Bảng 3.2 Ảnh hưởng dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 phát triển hệ sợi tơ mốc Neoscytalidium dimidiatum tỉ lệ thời gian khác 36 ix − Ở ba tỉ lệ phối trộn, dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 có khả ngăn ngừa hồn tồn bệnh đốm nâu nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây thân Tuy nhiên, long xảy tượng thối nhũn ba tỉ lệ thời gian xuất bệnh chậm hơn, mức độ bệnh nhẹ so với đối chứng giảm dần theo tỉ lệ tăng dần dịch nuôi cấy vi khuẩn 4.2 Kiến nghị Nghiên cứu thực quy mơ phịng thí nghiệm nên cịn tồn nhiều khó khăn máy móc thiết bị bị hạn chế mặt thời gian dịch Covid-19 Do vậy, để mở rộng hướng nghiên cứu nhằm khai thác tối đa tiềm đề tài, xin đưa số kiến nghị sau: − Nghiên cứu thêm chế kháng mốc chủng Bacillus licheniformis D7 − Nghiên cứu thêm quy trình tạo chế phẩm sinh học kiểm soát Neoscytalidium dimidiatum từ chủng Bacillus licheniformis D7 − Ngoài ra, Bacillus licheniformis D7 lồi vi khuẩn tiềm năng, đó, cần nghiên cứu thêm chủng nhằm khai thác đặc tính hữu ích khác khả kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh khác, khả sinh tổng hợp số loại enzyme có hoạt tính cao amylase, chitinase, protease, cellulase… 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO , truy cập 24/04/2021 , truy cập 24/04/2021 Thị trường long Úc giải pháp xúc tiến xuất long Việt Nam vào thị trường Báo cáo nghiên cứu Tổng lãnh quán Việt Nam Sydney-thương vụ việt nam Úc 2017 , truy cập 24/04/2021 Lan, G.B., He, Z.F., Xi, P.G., Jiang, Z.D., First report of brown spot disease caused by Neoscytalidium dimidiatum on Hylocereus undatus in Guangdong, Chinese mainland Plant Dis., 2012 96(11) doi: 10.1094/PDIS-07-12-0632PDN Chuang, M.F., Ni, H.F., Yang, H.R., Shu, S.L., Lai, S.Y., Jiang, Y.L., First report of stem canker disease of pitaya (Hylocereus undatus and H polyrhizus) caused by Neoscytalidium dimidiatum in Taiwan Plant Dis., 2012 96(6) doi: 10.1094/PDIS-08-11-0689-PDN , truy cập 24/04/2021 Machouart, M., Menir, P., Helenon, R., Quist, D., Desbois, N., Scytalidium and scytalidiosis: What's new in 2012? Journal de Mycologie Médicale / Journal of Medical Mycology, 2013 23(1), p.40–46 doi: 10.1016/j.mycmed.2013.01.002 Elad, D., Morick, D., David, D., Scheinin, A., Yamin, G., Blum, S., Goffman, O., Pulmonary fungal infection caused by Neoscytalidium dimidiatumin a Risso's dolphin (Grampus griseus) Medical Mycology, 2011 49(4), p.424–426 doi: 10.3109/13693786.2010.533392 10 Polizzi, G., Aiello, D., Castello, I., Vitale, A., Groenewald, J Z., & Crous, P W., Occurrence, Molecular Characterisation, 47 and Pathogenicity of Neoscytalidium dimidiatum on Citrus in Italy Acta Horticulturae, 2011 (892), p.237–243 doi:10.17660/actahortic.2011.892.27 11 Xu, M., Peng, Y.,Qi, Z.,Yan, Z., Yang, L., He, M.-D.,Li, Q.-X., Liu, C.-L., Ruan, Y.-Z., Wei, S.-S., Xie, J., Xia, Y.-Q., Tang, H., Identification of Neoscytalidium dimidiatum causing canker disease of pitaya in Hainan, China Australasian Plant Pathology, 2018 doi:10.1007/s13313-018-0588-2 12 Tỹrkửlmez, ., Dervi, S., ầiftỗi, O., Uluba Serỗe, ầ., & Dikilitas, M., New disease caused by Neoscytalidium dimidiatum devastates tomatoes (Solanum lycopersicum) in Turkey Crop Protection, 2019 118, p 21–30 doi.org/10.1016/j.cropro.2018.12.004 13 , truy cập 24/04/2021 14 Kayalvizhi, N., Gunasekaran, P., Production and characterization of a lowmolecular-weight bacteriocin from Bacillus licheniformis MKU3 Letters in Applied Microbiology, 2008 47(6), p.600–607 doi:10.1111/j.1472- 765x.2008.02473.x 15 Guo, Y., Yu, Z., Xie, J., Zhang, R., Identification of a new Bacillus licheniformis strain producing a bacteriocin-like substance Journal of Microbiology, 2012 50(3), p.452–458 doi:10.1007/s12275-012-2051-3 16 Medical Microbiology 4th edition Baron S, editor Galveston (TX): University of Texas Medical Branch at Galveston; 1996 17 Beladjal, L., Gheysens, T., Clegg, J S., Amar, M., & Mertens, J., Life from the ashes: survival of dry bacterial spores after very high temperature exposure Extremophiles, 2018 22(5), p.751–759 doi: 10.1007/s00792-018-1035-6 18 Shoda, M., Bacterial control of plant diseases Journal of Bioscience and Bioengineering, 2000 89(6), p.515–521 doi:10.1016/s1389-1723(00)80049-3 19 Kadaikunnan, S., Rejiniemon, T., Khaled, J M., Alharbi, N S., & Mothana, R., In-vitro antibacterial, antifungal, antioxidant and functional properties of Bacillus amyloliquefaciens Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 2015 14(1) doi: 10.1186/s12941-015-0069-1 20 Hassan, Z.U., Thani, R.A., Alnaimi, H., Migheli, Q., Jaoua, S., Investigation and application of Bacillus licheniformis volatile compounds for the biological 48 control of toxigenic Aspergillus and Penicillium spp ACS Omega, 2019 4(17), p.17186–17193 doi: 10.1021/acsomega.9b01638 21 Ash, C., Farrow, J.A.E., Wallbanks, S., Collins, M.D., Phylogenetic heterogeneity of the genus Bacillus revealed by comparative analysis of smallsubunit-ribosomal RNA sequences Letters in Applied Microbiology, 2008 13(4), p.202–206 doi:10.1111/j.1472-765x.1991.tb00608.x 22 Awasti, N., Anand, S., Djira, G., Sporulating behavior of Bacillus licheniformis strains influences their population dynamics during raw milk holding Journal of Dairy Science, 2019 102, p.6001–6012 doi:10.3168/jds.2018-15613 23 Gamal, S.A.S., Ragab, T.I.M., Helal, M.M.I., Esawy, M.A., Optimization of Bacillus licheniformis MAL tyrosinase: in vitro anticancer activity for brown and black eumelanin Heliyon, 2019 5(5), e01657 doi: 10.1016/j.heliyon.2019.e01657 24 Lopes, C., Barbosa, J., Maciel, E., Costa, E., Alves, E., Ricardo, F., Domingues, P., Mendo, S., Domingues, M R M., Decoding the fatty acid profile of Bacillus licheniformis I89 and its adaptation to different growth conditions to investigate possible biotechnological applications Lipids, 2019 doi: 10.1002/lipd.12142 25 Lee, J., Xiang, L., Byambabaatar, S., Kim, H., Jin, K S., Ree, M., Bacillus licheniformis α-amylase: Structural feature in a biomimetic solution and structural changes in extrinsic conditions International Journal of Biological Macromolecules, 2019 127, p.286–296 doi: 10.1016/j.ijbiomac.2019.01.053 26 Leelasuphakul, W., Sivanunsakul, P., Phongpaichit, S., Purification, characterization and synergistic activity of β-1,3-glucanase and antibiotic extract from an antagonistic Bacillus subtilis NSRS 89-24 against rice blast and sheath blight Enzyme and Microbial Technology, 2006 38(7), p.990–997 doi: 10.1016/j.enzmictec.2005.08.030 27 Liu, D., Cai, J., Xie, C., Liu, C., Chen, Y., Purification and partial characterization of a 36-kDa chitinase from Bacillus thuringiensis subsp colmeri, and its biocontrol potential Enzyme and Microbial Technology, 2010 46(3-4), p.252–256 doi: 10.1016/j.enzmictec.2009.10.007 49 28 Wang, C.X., Hu, Y.H., Yang, W.G., Wu, G., Gu, P.F., Ding, Z.W., Chen, Z.W., The control effect of Bacillus licheniformis NJWGYH 833051 Hubei Agr Sci., 2016 55, p.904–907 (in Chinese) 29 Ma, C., Zhu, H.L., Huang, T.W., Zhang, B.J., Screening and identification of endophytic antagonistic bacteria to Botrytis cinerea in Tomato J Shanxi Agr Sci., 2018 46, p.437–440 (in Chinese) 30 Wang, F.H., Han, X., Sun, B., Zhao, F.H., Wen, S., Du, J., Liao, Y.H., Cloning, expression and characterization of a lysozyme gene of Bacillus licheniformis isolated from fermented grains Chinese J Bioproc Eng 2018 16, p.82–88 (in Chinese) 31 Ling, L.J., Feng, L., Lei, L., He, N., Ding, L., Induction of defense-related enzymes in cucumber roots by Bacillus licheniformis strain TG116 J Northwest Normal Univ.:Nat Sci., 2016 52, p.100–104 (in Chinese) 32 Ansari, F A., & Ahmad, I., Fluorescent Pseudomonas -FAP2 and Bacillus licheniformis interact positively in biofilm mode enhancing plant growth and photosynthetic attributes Scientific Reports, 2019 9(1) doi: 10.1038/s41598019-40864-4 33 Lapidus, A., Galleron, N., Andersen, J.T., Jorgensen, P.L., Ehrlich, S D., Sorokin, A., Co-linear scaffold of the Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis genomes and its use to compare their competence genes FEMS Microbiol Lett., 2002 209, p.23–30 doi: 10.1111/j.1574-6968.2002.tb11104.x 34 Mohd, M H., Salleh, B., Zakaria, L., Identification and molecular characterizations of Neoscytalidium dimidiatum causing Stem canker of redfleshed dragon fruit (Hylocereus polyrhizus) in Malaysia Journal of Phytopathology, 2013 161(11-12), p.841–849 doi:10.1111/jph.12146 35 Ghaly, A E., Arab, F., Mahmoud, N., Higgins, J., Production of Levan by Bacillus licheniformis for use as a soil sealant in Earthen manure storage structures American Journal of Biochemistry and Biotechnology, 2007 3(2), p.47–54 doi: 10.3844/ajbbsp.2007.47.54 36 Wang, Z., Wang, Y., Zheng, L., Yang, X., Liu, H., & Guo, J., Isolation and characterization of an antifungal protein from Bacillus licheniformis HS10 50 Biochem Biophys Res Commun, 2014 454(1), p.48–52 doi: 10.1016/j.bbrc.2014.10.031 37 Lebbadi, M., Gálvez, A., Maqueda, M., Martínez-Bueno, M., & Valdivia, E., Fungicin M4: a narrow spectrum peptide antibiotic from Bacillus licheniformis M-4 J Appl Bacteriol, 1994 77(1), p.49–53 doi: 10.1111/j.13652672.1994.tb03043.x 38 Cui, T.-B., Chai, H.-Y., Jiang, L.-X., Isolation and Partial Characterization of an Antifungal Protein Produced by Bacillus licheniformis BS-3 Molecules, 2012 17(6), p.7336–7347 doi: 10.3390/molecules17067336 39 Tendulkar, S.R., Saikumari, Y.K., Patel, V., Raghotama, S., Munshi, T.K., Balaram, P., Isolation, purification and characterization of an antifungal molecule produced by Bacillus licheniformis BC98 and its effect on phytopathogen Magnaporthe grisea J Appl Microbiol, 2007 103, p.2331– 2339 doi: 10.1111/j.1365-2672.2007.03501.x 40 Jeong, M.-H., Lee, Y.-S., Cho, J.-Y., Ahn, Y.-S., Moon, J.-H., Hyun, H.-N., Cha, G.-S., Kim, K.-Y., Isolation and characterization of metabolites from Bacillus licheniformis MH48 with antifungal activity against plant pathogens Microbial Pathogenesis, 2017 110, p.645–653 doi: 10.1016/j.micpath.2017.07.027 41 James, J.E., Santhanam, J., Lee, M.C., Wong, C.X., Sabaratnam, P., Yusoff, H., Tzar, M.N., Razak, M.F.A., In vitro antifungal susceptibility of Neoscytalidium dimidiatum clinical isolates from Malaysia Mycopathologia, 2016 182(3-4), p.305–313 doi: 10.1007/s11046-016-0085-5 42 Bakhshizadeh, M., Hashemian, H.R., Najafzadeh, M.J., Dolatabadi, S., Zarrinfar, H., First report of rhinosinusitis caused by Neoscytalidium dimidiatum in Iran Journal of Medical Microbiology, 2014 63(7), p.1017– 1019 doi: 10.1099/jmm.0.065292-0 43 Dionne, B., Neff, L., Lee, S A., Sutton, D.A., Wiederhold, N.P., Lindner, J., Fan, H., Jakeman, B., Pulmonary Fungal Infection Caused by Neoscytalidium dimidiatum Journal of Clinical Microbiology, 2015 53(7), p.2381–2384 doi: 10.1128/jcm.00206-15 51 44 , truy cập 24/04/2021 45 Montiel, L.G.H., García, T.R., Bastidas, M.R., Contreras, C.J.C., Espinoza, F.H.R., Contreras, R.G.C., Potencial antagónico de bacterias y levaduras marinas para el control de hongos fitopatógenos Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas, 2018 9(20) doi: 10.29312/remexca.v0i20.1000 (tiếng Tây Ban Nha) 46 Sabah Lateef Alwan and et al., Efficacy of ecofriendly biocontrol Azotobacter chroococcum and Lactobacillus rhamnosus for enhancing plant growth and reducing infection by Neoscytalidium spp in fig (Ficus carica L.) saplings Journal of Kerbala for Agricultural Sciences, 2019 6(1): p 16–25 47 Võ Thị Thu oanh, Bùi Cách Tuyến, Nguyễn Phan Thành, Lê Đình Đơn, Phan Thị Thu Hiền, Xác định tác nhân gây bệnh đốm nâu (Neoscytalidium dimidiatum) long dựa vào trình tự vùng ITS – RADN Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển nông thôn số, 2014 21: p 17–23 48 Hà Thị Thúy, Lương Hữu Thành, Vũ Thúy Nga, Hứa Thị Sơn, Tống Hải Vân, Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả ức chế nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu long Hội thảo Quốc gia Khoa học Cây trồng lần thứ hai, 2016 49 Nguyễn Như Nhứt, Nguyễn Thị Ngọc Bích, Nguyễn Thanh Trường, Võ Thị Xuyến, Phân lập nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum Thanh long nghiên cứu kiểm soát vi sinh vật Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 2019 3(4): p 286–293 doi:10.32508/stdjns.v3i4.585 50 Li, X., Zhang, Y., Wei, Z., Guan, Z., Cai, Y., & Liao, X., Antifungal activity of isolated Bacillus amyloliquefaciens SYBC H47 for the biocontrol of peach gummosis PLoS ONE, 2016 11(9) doi: 10.1371/journal.pone.0162125 51 Zhang, X., Guo, X., Wu, C., Li, C., Zhang, D., Zhu, B., Isolation, heterologous expression, and purification of a novel antifungal protein from Bacillus subtilis strain Z-14 Microbial Cell Factories, 2020 19(1) doi:10.1186/s12934-02001475-1 52 52 Maier, R.M., Pepper, I.L., Gerba, C.P., Environmental Microbiology Academic Press, 2000 53 Wang, S., Ruan, C., Yi, L., Deng, L., Yao, S., & Zeng, K., Biocontrol ability and action mechanism of Metschnikowia citriensis against Geotrichum citriaurantii causing sour rot of postharvest citrus fruit Food Microbiology, 2020 87(103375) doi: 10.1016/j.fm.2019.103375 54 Nawaz, H H., Nelly Rajaofera, M J., He, Q., Anam, U., Lin, C., Miao, W., Evaluation of antifungal metabolites activity from bacillus licheniformis OE-04 against Colletotrichum gossypii Pesticide Biochemistry and Physiology, 2018 146, p.33–42 doi: 10.1016/j.pestbp.2018.02.007 55 Stoll, V.S., Blanchard, J.S., Chapter Buffers Guide to Protein Purification, 2nd Edition, 2009 p.43–56 doi:10.1016/s0076-6879(09)63006-8 56 Clerjeau, M., Conus, M., A rapid method of inoculation of young tomato seedlings with Pyrenochaeta lycopersici Schneider and Gerlach Annu Rev Phytopathol, 1973 5, p.143 57 John, G.H., Noel, R.K., Peter, H.A.S., James, T.S., Stanley, T.W., Bergey’s manual of determinative bacterial 9th Edition The Williams and Wilkin, Co., Baltimore, 1994 p.85-187 58 Đỗ Thị Thanh Dung, Lê Thanh Bình, Viên Thị Thanh Trúc, Võ Đình Quang, Khả đối kháng vi khuẩn Bacillus sp với vi nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng long Tạp chí Khoa học – Trường ĐH Sư phạm TP HCM, Khoa học tự nhiên công nghệ, 2018 15(12), trang 32–42 59 Cheng, J., Yang, S.H., Palaniyandi, S.A., Han, J.S., Yoon, T.-M., Kim, T.-J., Suh, J.-W., Azalomycin F complex is an antifungal substance produced by Streptomyces malaysiensis MJM1968 isolated from agricultural soil Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, 2010 53(5), p.545–552 doi: 10.3839/jksabc.2010.084 60 Singh, A.K., Chhatpar, H.S., Purification, characterization and thermodynamics of antifungal protease from Streptomyces sp A6 Journal of Basic Microbiology, 2011 51(4), p.424–432 doi: 10.1002/jobm.201000310 53 PHỤ LỤC Phụ lục A Bảng số liệu thể sơ khả ức chế nấm mốc dịch nuôi cấy vi khuẩn Bảng Độ lớn vòng ức chế nấm mốc dịch nuôi cấy vi khuẩn (mm) Lần Lần Lần 32 29 27 Phụ lục B Bảng số liệu thể giá trị OD600 theo mốc thời gian nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 Bảng Giá trị OD600 chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 theo mốc thời gian nuôi cấy Thời gian Lần Lần Lần Trung bình 0.147 0.147 0.147 0.147 0.211 0.211 0.211 0.208 0.642 0.642 0.642 0.656 0.851 0.851 0.851 0.854 1.001 1.001 1.001 1.002 10 1.125 1.125 1.125 1.126 12 1.296 1.296 1.296 1.313 14 1.316 1.316 1.316 1.323 (giờ) 54 16 1.361 1.361 1.361 1.374 18 1.36 1.36 1.36 1.364 20 1.377 1.377 1.377 1.344 22 1.352 1.352 1.352 1.356 24 1.331 1.331 1.331 1.341 Phụ lục C Ảnh hưởng thời gian ni cấy lên hoạt tính ức chế nấm mốc dịch nuôi cấy vi khuẩn Bảng Hoạt tính trung bình khả ức chế lan tơ nấm mốc dịch nuôi cấy vi khuẩn theo thời gian Thời gian (giờ) Trung bình độ lớn Hoạt tính trung bình vịng ức chế (mm) (%) 4.67±0.28 23.33±1.44 5.00±0.00 25.00±0.00 6.00±0.50 30.00±2.50 6.10±0.57 30.83±2.88 6.50±0.50 32.50±2.50 10 7.33±0.28 36.66±1.44 12 7.33±0.57 36.66±2.88 14 7.33±0.57 36.66±2.88 16 9.16±0.28 45.83±1.44 18 7.66±0.57 38.33±2.88 55 20 7.66±0.57 38.33±2.88 22 7.66±0.28 38.33±1.44 24 7.66±0.28 38.33±1.44 Hình Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên hoạt tính ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum dịch ni cấy chủng Bacillus licheniformis D7 Phụ lục D Khả bền nhiệt dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên hoạt tính ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum Bảng Khả bền nhiệt dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên hoạt tính ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum Trung bình độ lớn Hoạt tính trung bình vòng ức chế (mm) lại (%) DC 9.16±0.28 100.00±0.00 40 6.16±0.28 67.27±3.14 50 5.16±0.28 56.36±3.14 60 5.16±0.28 56.36±3.14 70 3.16±0.28 34.54±3.14 Nhiệt độ (℃) 56 80 2.66±0.28 29.09±3.14 90 0.00±0.00 0.00±0.00 100 0.00±0.00 0.00±0.00 121 0.00±0.00 0.00±0.00 Hình Khả bền nhiệt dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên hoạt tính ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum Phụ lục E Khả bền pH dịch ni cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên hoạt tính ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum Bảng Khả bền pH dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên hoạt tính ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum Trung bình độ lớn Hoạt tính trung bình vịng ức chế (mm) lại (%) DC 9.16±0.28 100.00±0.00 2.0 0.00±0.00 0.00±0.00 pH 57 3.0 0.00±0.00 0.00±0.00 4.0 4.83±0.28 52.72±3.14 5.0 5.00±0.28 54.54±3.14 6.0 6.33±0.28 69.09±3.14 7.0 9.66±0.28 105.45±3.14 8.0 6.00±0.28 65.45±3.14 Tris 8.0 6.16±0.28 67.27±3.14 9.0 5.66±0.28 61.81±3.14 10.0 5.16±0.28 56.36±3.14 11.0 2.83±0.28 30.90±3.14 12.0 2.66±0.28 29.09±3.14 58 Hình Khả bền pH dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên hoạt tính ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum Phụ lục F Kết phân tích Anova Bảng ANOVA Table for Hoat tinh by Thoi gian Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 1360.58 12 113.381 22.82 129.167 26 4.96795 1489.74 38 Method: 95.0 percent LSD P-Value 0.0000 Bảng Multiple Range Tests for Hoat tinh by Thoi gian Thoi gian 12 14 10 24 22 Count 3 3 3 3 3 Mean 23.3333 25.0 30.0 30.8333 32.5 36.6667 36.6667 36.6667 38.3333 38.3333 59 Homogeneous Groups X X X X X X X X X X 20 18 16 3 38.3333 X 38.3333 X 45.8333 X Method: 95.0 percent LSD Bảng ANOVA Table for Hoat tinh by Nhiet Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 29395.0 3674.38 666.90 99.1736 18 5.50964 29494.2 26 Method: 95.0 percent LSD P-Value 0.0000 Bảng Multiple Range Tests for Hoat tinh by Nhiet Nhiet 90 121 100 80 70 60 50 40 DC Count Mean Homogeneous Groups 0.0 X 0.0 X 0.0 X 29.0909 X 34.5455 X 56.3636 X 56.3636 X 67.2727 X 100.0 X Method: 95.0 percent LSD Bảng 10 ANOVA Table for Hoat tinh by pH Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 37039.0 12 3086.59 367.82 218.182 26 8.39161 37257.2 38 Method: 95.0 percent LSD P-Value 0.0000 Bảng 11 Multiple Range Tests for Hoat tinh by pH pH 12 11 10 Tris DC Count Mean Homogeneous Groups 0.0 X 0.0 X 29.0909 X 30.9091 X 52.7273 X 54.5455 X 56.3636 X 61.8182 X 65.4545 XX 67.2727 X 69.0909 X 100.0 X 105.455 X Method: 95.0 percent LSD 60 ... trạng trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Khảo sát khả ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu long vi khuẩn Bacillus licheniformis D7? ?? với mục đích hướng tới vi? ??c sản xuất chế. .. cứu: khả ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu long chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Đề tài tiến hành nhằm xác định khả ức chế nấm mốc Neoscytalidium. .. thái đại thể (A) vi thể (B) nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum [43] 1.2.2 Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu long Bệnh đốm nâu nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây long bệnh nghiêm trọng,