BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Tên đề tài Khảo sát khả năng ức chế nấm mốc Neoscytali[.]
BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: Khảo sát khả ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu long vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 Mã số đề tài: 19.2TP06SV Chủ nhiệm đề tài: Hồ Nguyễn Hồng Yến Đơn vị thực hiện: Viện Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh, 2021 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này, em nhận giúp đỡ nhiệt tình lời động viên sâu sắc quý Thầy Cơ, gia đình bạn bè suốt khoảng thời gian thực đề tài Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, Ban lãnh đạo Viện, Ban quản lý phịng thí nghiệm q Thầy Cô Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Phòng Quản lý Khoa học Hợp tác Quốc tế hỗ trợ kinh phí, sở vật chất tạo điều kiện tốt để em hoàn thành đề tài nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Ngọc Ẩn tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm kiến thức chuyên môn giúp em kịp thời giải vấn đề, động viên em lúc khó khăn ln tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành đề tài nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn TS Phạm Tấn Việt TS Nguyễn Thị Diệu Hạnh quan tâm, bảo sẵn lòng hỗ trợ em suốt thời gian thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến tập thể sinh viên làm việc Phịng Thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh thuộc Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm giúp đỡ, san sẻ tạo động lực để em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu Cảm ơn gia đình ln chia sẻ, hỗ trợ nguồn động viên to lớn suốt thời gian qua Tuy cố gắng nhiều vốn kiến thức, kinh nghiệm thân cịn hạn chế, q trình thực hồn thành đề tài, em khơng tránh khỏi thiếu sót nên mong nhận ý kiến đóng góp q Thầy Cơ để em hồn thiện Cuối cùng, em xin kính chúc quý Thầy Cô dồi sức khỏe gặt hái nhiều thành công công việc sống Em xin chân thành cảm ơn! PHẦN I: THƠNG TIN CHUNG I Thơng tin tổng quát 1.1 Tên đề tài: Khảo sát khả ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu long vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 1.2 Mã số: 19.2TP06SV 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài: TT Họ tên Đơn vị cơng tác Vai trị thực đề tài Hồ Nguyễn Hoàng Yến Trường ĐHCN Nghiên cứu đề tài TS Nguyễn Ngọc Ẩn Trường ĐHCN Cố vấn khoa học 1.4 Đơn vị chủ trì: Viện Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm 1.5 Thời gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: Từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 10 năm 2020 1.5.2 Gia hạn: 12 tháng 1.5.3 Thực thực tế: Từ tháng 10 năm 2019 đến tháng năm 2021 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): Khơng có 1.7 Tổng kinh phí phê duyệt đề tài: 05 triệu đồng (số tiền chữ: Năm triệu đồng) II Kết nghiên cứu 2.1 Đặt vấn đề Thanh long loại ăn nhiệt đới cận nhiệt đới quan trọng Thanh long thuộc họ Xương rồng (Cactaceae), xuất vùng nhiệt đới địa châu Mỹ Latinh, bao gồm Mexico, Trung Nam Mỹ Hiện nay, trồng rộng khắp vùng nhiệt đới cận nhiệt đới toàn giới, đặc biệt nước châu Á, Malaysia, Việt Nam, Thái Lan, Philippines Trung Quốc [1, 2] Việt Nam nước có diện tích sản lượng long lớn Châu Á, xuất long hàng đầu giới Diện tích trồng long Việt Nam tăng nhanh từ 5.512 năm 2000 lên đến 35.665 năm 2014 với tổng sản lượng đạt khoảng 614.346 [3] Theo số liệu ước tính sơ năm 2015, diện tích trồng long gần 5.000 ha, sản lượng đạt khoảng 686.195 [3] Theo thống kê, sản lượng long Việt Nam đạt khoảng 1,2 triệu vào năm 2019 dự kiến đạt 1,7 triệu vào năm 2025, dự báo tốc độ tăng trưởng đạt 6,0% [4] Do đó, việc xuất long mang lại nguồn thu nhập lớn cho nông dân nước ta Tuy nhiên, việc sản xuất long Việt Nam gặp nhiều khó khăn tác động biến đổi khí hậu dịch bệnh bệnh đốm nâu, bệnh nám cành, bệnh thối nhũn, bệnh thán thư, bệnh nấm bồ hóng,… [5] Do khí hậu nhiệt đới ẩm mơi trường phù hợp cho nhiều loại mốc phát triển Bên cạnh việc mở rộng diện tích, thâm canh cao tạo điều kiện cho nhiều loại sâu bệnh gây hại phát triển Từ năm 2008 đến nay, long xuất loại bệnh bệnh đốm trắng, đốm vàng, đốm nâu, bệnh loét gây hư hại thân long Trong đó, bệnh đốm nâu nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây hậu nghiêm trọng [6, 7] Neoscytalidium dimidiatum thuộc ngành nấm túi Ascomycota, lớp Dothideomycetes, Botrysphaeriales, họ Botrysphaeriaceae, chi Neoscytalidium [8] Nó xác định tác nhân gây bệnh nhiễm trùng giống bệnh nấm da người [9], xâm nhập làm viêm phổi dẫn đến chết cá heo [10], bên cạnh đó, chủng nấm mốc gây bệnh nhiều đối tượng thực vật như: cà chua, có múi, long,… [11-13] Hiện nay, xu hướng phát triển giới hướng tới nông nghiệp bền vững Tuy nhiên, nấm bệnh gây hậu nghiêm trọng, đặc biệt vùng nhiệt đới cận nhiệt đới, bệnh đốm nâu nấm mốc N dimidiatum gây làm ảnh hưởng nặng nề tới suất chất lượng long [12] Việc gây khó khăn việc tiêu thụ nội địa xuất khẩu, ảnh hưởng lớn đến đời sống người nông dân ngành trồng trọt long Thuốc diệt nấm hóa học sử dụng tràn lan nơng nghiệp có ảnh hưởng xấu sức khỏe người, gây ô nhiễm môi trường làm tăng khả kháng thuốc nấm bệnh Vấn đề cấp bách tìm nguyên nhân gây bệnh, từ đưa biện pháp phịng trừ hiệu Do đó, việc sử dụng biện pháp sinh học hợp chất đối kháng từ vi sinh vật phương pháp thay hiệu thân thiện với môi trường Bacillus licheniformis vi khuẩn Gram dương, hình que, ưa nhiệt Trong điều kiện mơi trường khắc nghiệt, có khả hình thành nội bào tử Những bào tử có khả chịu nhiệt, lạnh, xạ áp lực khác mơi trường Bacillus licheniformis có khả sản sinh nhiều loại enzyme có hoạt tính mạnh amylase, protease, cellulase, chitinase…, đồng thời, có khả sinh tổng hợp chất kháng sinh tự nhiên có tác dụng ức chế sinh trưởng tiêu diệt số vi sinh vật khác, bao gồm vi khuẩn Gram âm lẫn Gram dương nấm gây bệnh [14] Xuất phát từ thực trạng trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Khảo sát khả ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu long vi khuẩn Bacillus licheniformis D7” với mục đích hướng tới việc sản xuất chế phẩm sinh học hỗ trợ cho phát triển bền vững ngành nơng nghiệp nói chung ngành trồng long nói riêng nước ta 2.2 Mục tiêu 2.2.1 Mục tiêu tổng quát Đánh giá khả ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu long vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 2.2.2 Mục tiêu cụ thể Khảo sát sơ khả ức chế sinh trưởng phát triển nấm mốc N dimidiatum chủng B licheniformis D7 Khảo sát tác động B licheniformis D7 lên khả nảy mầm bào tử N dimidiatum Khảo sát tác động B licheniformis D7 lên phát triển hệ sợi tơ N dimidiatum Kiểm tra hiệu ngăn ngừa bệnh đốm nâu long N dimidiatum gây chủng B licheniformis D7 2.3 Phương pháp nghiên cứu Nội dung 1: Khảo sát sơ khả ức chế sinh trưởng phát triển nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 Kiểm tra hoạt tính kháng mốc phương pháp khuếch tán giếng thạch dịch nuôi cấy vi khuẩn môi trường PGA [15] Nội dung 2: Khảo sát tác động dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 lên khả nảy mầm bào tử Neoscytalidium dimidiatum Phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn dịch bào tử nấm mốc theo tỉ lệ 0,5:1, 1:1, 2:1, ủ nhiệt độ phòng quan sát nảy mầm bào tử kính hiển theo mốc thời gian 4, 8, 12, 24 [16] Kiểm tra sinh trưởng bào tử nấm mốc phương pháp cấy trải môi trường PGA Đối chứng thực tương tự với dịch bào tử nấm mốc thay dịch nuôi cấy vi khuẩn môi trường LB Nội dung 3: Khảo sát tác động dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 lên phát triển hệ sợi tơ Neoscytalidium dimidiatum Phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn dịch bào tử nấm mốc (được nuôi ủ môi trường PGB sau giờ) theo tỉ lệ 0,5:1, 1:1, 2:1, ủ nhiệt độ phịng quan sát kính hiển theo mốc thời gian 4, 8, 12, 24 [16] Đối chứng thực tương tự với dịch bào tử nấm mốc thay dịch nuôi cấy vi khuẩn môi trường LB Nội dung 4: Kiểm tra hiệu ngăn ngừa bệnh đốm nâu long N dimidiatum gây B licheniformis D7 Phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn dịch bào tử nấm mốc theo tỉ lệ 0,5:1, 1:1, 2:1 ủ nhiệt độ phòng 24 Tiến hành tiêm 200 μL dịch gây bệnh/vết lên thân long Theo dõi thời gian xuất bệnh mức độ gây bệnh [17] Với đối chứng (+) dịch chứa bào tử nấm mốc; đối chứng (-) môi trường chưa nuôi cấy vi khuẩn dịch nuôi cấy vi khuẩn; ba tỉ lệ phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn với dịch bào tử nấm mốc (0,5:1, 1:1 2:1) 2.4 Tổng kết kết nghiên cứu 2.4.1 Khả ức chế sinh trưởng phát triển Neoscytalidium dimidiatum dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 Để chứng minh dịch ni cấy Bacillus licheniformis D7 có khả đối kháng với nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum, tiến hành khảo sát sơ khả ức chế sinh trưởng phát triển N dimidiatum dịch nuôi cấy B licheniformis D7 Kết thể sau (Hình 1): Hình Khả đối kháng Neoscytalidium dimidiatum dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 Kết cho thấy dịch nuôi cấy B licheniformis D7 có khả ức chế sinh trưởng phát triển nấm mốc N dimidiatum cho đường kính vòng kháng 28.2 ± 0.9 mm 2.4.2 Tác động dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 lên nảy mầm bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum Sau chứng minh dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 có khả đối kháng với nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum, tiến hành khảo sát đặc điểm kháng mốc dịch nuôi cấy vi khuẩn Đầu tiên, khảo sát tác động dịch nuôi cấy B licheniformis D7 lên nảy mầm bào tử nấm mốc N dimidiatum Kết thể sau (Bảng Hình 2): Nhìn chung, đối chứng sau 24 giờ, bào tử nấm mốc nảy mầm tốt, kéo dài, phát triển thành hệ sợi tơ hình thành vách ngăn Ở tỉ lệ phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn dịch bào tử nấm mốc, bào tử nấm mốc bị ức chế nảy mầm bị biến dạng nặng sau 24 ủ với dịch nuôi cấy vi khuẩn Bảng Ảnh hưởng dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 nảy mầm bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum tỷ lệ thời gian khác Tỷ lệ Đối chứng 0,5:1 giờ 12 Bào tử bắt đầu Mầm tiếp tục nảy mầm, số kéo dài hình kéo dài hình thành vách mầm kéo dài thành tơ ngăn Bào tử bị ức chế Một số bào Mầm kéo dài Tơ kéo dài, tử bắt đầu nảy hình thành tơ bị biến dạng, mầm Tơ nấm phát triển 24 Tơ kéo dài, số khơng hình thành vách ngăn 1:1 Bào tử bị ức chế Một số bào Mầm phát triển Bào tử mầm bị biến dạng, tử bắt đầu nảy chậm ức chế biến số bắt đầu mầm dạng nảy mầm 2:1 Bào tử bị ức chế Bào tử bị biến Bào tử bị biến Bào tử bị biến nảy mầm bị dạng, số dạng, mầm khơng dạng nặng biến dạng bắt đầu nảy kéo dài mầm Đối chứng Tỉ lệ 0,5:1 giờ 12 Tỉ lệ 1:1 Tỉ lệ 2:1 24 Hình Tác động dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 lên hình thái khả nảy mầm bào tử Neoscytalidium dimidiatum Để làm rõ thêm tác động dịch nuôi cấy chủng B licheniformis D7 lên khả nảy mầm bào tử mốc N dimidiatum, cấy trải hỗn hợp dịch nuôi cấy vi khuẩn phối trộn với dịch bào tử nấm mốc lên đĩa môi trường PGA Kết thu sau (Hình 3): Nhìn chung, tỉ lệ phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn với dịch bào tử nấm mốc 0,5:1, bào tử nấm mốc khơng có khả sinh trưởng đĩa môi trường sau ủ với dịch nuôi cấy vi khuẩn Đối với tỉ lệ phối trộn 1:1 2:1, sau ủ với dịch ni cấy vi khuẩn, bào tử nấm mốc khơng có khả sinh trưởng đĩa mơi trường Hình Tác động dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên sinh trưởng bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum ... hành nghiên cứu đề tài: ? ?Khảo sát khả ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu long vi khuẩn Bacillus licheniformis D7? ?? với mục đích hướng tới vi? ??c sản xuất chế phẩm sinh học hỗ... thể Khảo sát sơ khả ức chế sinh trưởng phát triển nấm mốc N dimidiatum chủng B licheniformis D7 Khảo sát tác động B licheniformis D7 lên khả nảy mầm bào tử N dimidiatum Khảo sát tác động B licheniformis. .. sâu bệnh gây hại phát triển Từ năm 2008 đến nay, long xuất loại bệnh bệnh đốm trắng, đốm vàng, đốm nâu, bệnh loét gây hư hại thân long Trong đó, bệnh đốm nâu nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây