Phân lập nấm gây bệnh đốm nâu trên cây lúa (oryza sativa) và bước đầu sàng lọc vi khuẩn lên men lactic ức chế phát triển nấm bệnh này

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP NẤM GÂY BỆNH ĐỐM NÂU TRÊN CÂY LÚA (ORYZA SATIVA) VÀ BƯỚC ĐẦU SÀNG LỌC VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC ỨC CHẾ PHÁT TRIỂN NẤM BỆNH NÀY Ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn TS Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiện Nguyễn Mỹ Hoàng MSSV 1611100385 Lớp 16DSHA1 Sinh viên thực hiện Lê Ngọc Quân MSSV 1611100065 Lớp 16DSHA2 TP Hồ Chí Minh, 2020 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt n.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP NẤM GÂY BỆNH ĐỐM NÂU TRÊN CÂY LÚA (ORYZA SATIVA) VÀ BƯỚC ĐẦU SÀNG LỌC VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC ỨC CHẾ PHÁT TRIỂN NẤM BỆNH NÀY Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiện: Nguyễn Mỹ Hoàng MSSV: 1611100385 Lớp: 16DSHA1 Sinh viên thực hiện: Lê Ngọc Quân MSSV: 1611100065 Lớp: 16DSHA2 TP Hồ Chí Minh, 2020 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu nhóm hướng dẫn Tiến sĩ Nguyễn Hoài Hương viện Khoa học Ứng dụng trường Đại học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Những kết hồn tồn khơng chép từ nghiên cứu khoa học khác hình thức Tp Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng năm 2020 Nhóm thực đề tài Nguyễn Mỹ Hồng – Lê Ngọc Quân Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời cảm ơn chúng em xin gửi đến Ban giám hiệu Trường Đại học Công nghệ Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho chúng em học tập nghiên cứu Em xin chân thành biết ơn quý thầy cô Viện Khoa học ứng dụng Hutech truyền đạt cho chúng em kiến thức, kinh nghiệm suốt trình học tập Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Nguyễn Hồi Hương tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, cung cấp kiến thức, thơng tin bổ ích đặc biệt ln động viên, theo sát q trình làm việc chúng em để kịp thời khắc phục lỗi sai để việc đạt hiệu tốt Chúng em xin cảm ơn đến thầy Sinh với em cộng tác viên phịng thí nghiệm bạn phòng E1.03.03 trực tiếp giúp đỡ, hỗ trợ hóa chất, dụng cụ suốt thời gian thực đề tài Sau cùng, chúng em xin cảm ơn Thầy/Cô Hội Đồng Phản Biện dã dành thời gian đọc nhận xét đồ án đồ án tốt nghiệp Chúng em kính chúc Thầy/Cơ Ban lãnh đạo Viện Khoa học Ứng dụng Hutech sức khỏe thành cơng Tp Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng năm 2020 Nhóm thực đề tài Nguyễn Mỹ Hoàng – Lê Ngọc Quân MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược lúa 1.2 Tình hình sản xuất lúa Việt Nam 1.3 Một số bệnh nấm thường gặp lúa 1.3.1 Bệnh đốm nâu 1.3.2 Bệnh đạo ôn 11 1.3.3 Bệnh đốm vằn 13 1.3.4 Bệnh tiêm lửa 13 1.4 Một số loại nấm gây hại lúa 15 1.4.1 Nấm Curvularia lunata 15 1.4.2 Nấm Pyricularia oryzae hay Magnaporthe grisea 16 1.4.3 Nấm Ustilaginoidea virens (Cooke) Taka 17 1.4.4 Nấm Rhizoctonia solani Kuhn 18 1.5 Khẳng định tác nhân theo quy tắc Koch 21 1.6 Tổng quan vi khuẩn lactic 23 1.6.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic 23 1.6.2 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn lactic 24 1.6.3 Qúa trình trao đổi chất 25 1.6.4 Khả sinh hợp chất kháng khuẩn, kháng nấm 28 1.6.5 Ứng dụng vi khuẩn lactic 31 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 i Đồ án tốt nghiệp 2.1 Địa điểm nghiên cứu 34 2.2 Thời gian thực 34 2.3 Vật liệu nghiên cứu 34 2.3.1 Vật liệu 34 2.3.2 Thiết bị, dụng cụ 34 2.3.3 Hóa chất sử dụng 34 2.4 Phương pháp nghiên cứu 35 2.4.1 Phương pháp phân lập nấm bệnh đốm nâu lúa 36 2.4.2 Khảo sát môi trường nuôi cấy nấm gây bệnh đốm nâu 38 2.4.3 Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo 38 2.4.4 Định danh nấm bệnh phương pháp giải trình tự vùng ITS 39 2.4.5 Phương pháp khảo sát khả đối kháng nấm bệnh chủng LAB (in vitro) 40 2.4.6 Phương pháp khảo sát khả đối kháng nấm bệnh chủng LAB (in vivo) 41 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 42 3.1 Kết phân lập làm 42 3.1.1 Kết thu nhận mẫu bị bệnh 42 3.1.2 Kết phân lập, làm thuần, quan sát hình thái khuẩn lạc bào tử tuyển chọn nấm gây bệnh đốm nâu qua hình thái 43 3.2 Khảo sát môi trường nuôi cấy tăng trưởng nấm bệnh 52 3.2.1 Khảo sát môi trường nuôi cấy phát triển chủng nấm N6 52 3.2.2 Khảo sát môi trường nuôi cấy phát triển chủng nấm N35 54 3.2.3 Khảo sát môi trường nuôi cấy phát triển chủng nấm N29 57 ii Đồ án tốt nghiệp 3.3 Kết tái nhiễm theo quy tắc Koch 60 3.3.1 Kết thí nghiệm lúa chủng N6 60 3.3.2 Kết thí nghiệm lúa chủng N35 62 3.4 Kết so sánh trình tự ITS với ngân hàng gene 63 3.5 Kết khảo sát khả đối kháng nấm bệnh chủng LAB (in vitro) 67 3.6 Kết khảo sát khả đối kháng nấm bệnh chủng LAB (in vivo) 70 3.6.1 Kết đối kháng chủng nấm N6 chủng khuẩn lactic mật độ khuẩn 109, 108, 107, 106 (cfu/ml) sau ngày 70 3.5.2 Kết đối kháng chủng nấm N35 chủng khuẩn lactic sau ngày 75 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79 4.1 Kết luận 79 4.2 Kiến nghị 79 CHƯƠNG TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Nguyên nghĩa Ký hiệu ĐC Đối chứng DNA Deoxyribonucleic acid ITS Internal transcribed spacer LAB Lactic acid bacteria MRS De Man, Rogosa and Sharpe NCBI National Center for Biotechnology Informatic NT Nghiệm thức PDA Potato Dextrose Agar PDB Potato Dextrose Broth TN Thí nghiệm iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại khoa học lúa Bảng 1.2 Phân loại khoa học nấm C lunata [10] 10 Bảng 1.3 Phân loại khoa học nấm M oryzae [6] 12 Bảng 1.4 Bảng khảo sát tác nhân gây bệnh nấm 19 Bảng 3.1 Mẫu lúa bị nhiễm bệnh thu đồng ruộng tỉnh Long An 43 Bảng 3.3 So sánh đại thể, vi thể chủng N6, N35, N29 50 Bảng 3.4 Khảo sát tăng trưởng chủng N6 môi trường PDA, PSA, YEG, CMA, RICE ngày 52 Bảng 3.5 Kết khả phát triển chủng N6 môi trường PDA, PSA, YEG, CMA, RICE qua 2, 4, 6, 8, 10 ngày 53 Bảng 3.6 Khảo sát tăng trưởng chủng N35 môi trường PDA, PSA, YEG, CMA, RICE 54 Bảng 3.7 Kết khả phát triển chủng N35 môi trường PDA, PSA, YEG, CMA, RICE qua 2, 4, 6, 8, 10 ngày 55 Bảng 3.8 Khảo sát tăng trưởng chủng N29 môi trường PDA, PSA, YEG, CMA, RICE 57 Bảng 3.9 Kết khả phát triển chủng N29 môi trường PDA, PSA, YEG, CMA, RICE qua 2, , 6, 8, 10 ngày 58 Bảng 3.10 Tỉ lệ tương đồng N35 với N6 số chủng gây bệnh đốm nâu lúa (Blast NCBI) 63 Bảng 3.11 Tỷ lệ ức chế (%) N6, N35 chủng vi khuẩn lactic 69 Bảng 3.12 Đánh giá tính đối kháng nấm N6, N35 với chủng khuẩn lactic (in vivo) 77 v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Bệnh đốm nâu lúa Hình 1.2 Bệnh đạo ôn lúa 11 Hình 1.3 Bệnh đạo ôn cổ lúa 12 Hình 1.4 Bệnh đạo ôn hạt lúa 12 Hình 1.5 Bệnh đốm vằn lúa 13 Hình 1.6 Bệnh tiêm lửa lúa 15 Hình 1.7 Cuống bào tử bào tử Curvularia lunata (Sharma, 1998) 15 Hình 1.8 Cuống bào tử bào tử Pyricularia oryzae (Sharma,1998), conidia: bào tử đỉnh; conidiophore: cọng mang túi bào tử 16 Hình 1.9 Bào tử nấm Ustilaginoidea viens (Cooke) Taka 17 Hình 1.10 Nấm Rhizoctonia solani Kuhn 19 Hình 1.11 Con đường lên men Glucose 28 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 35 Hình 2.2 Sơ đồ khảo sát khả đối kháng nấm chủng LAB (in vitro) 40 Hình 3.1 Ba mẫu lúa bị nhiễm bệnh thu đồng ruộng tỉnh Long An (30/11/2019) 42 Hình 3.2 Hình thái nấm mơi trường PDA hình thái bào tử mẫu N1 44 Hình 3.3 Hình thái nấm mơi trường PDA hình thái bào tử mẫu N2 44 Hình 3.4 Hình thái nấm mơi trường PDA hình thái bào tử mẫu N4 45 Hình 3.5 Hình thái nấm mơi trường PDA hình thái bào tử mẫu N5 45 Hình 3.6 Hình thái nấm mơi trường PDA hình thái bào tử mẫu N6 46 Hình 3.7 Hình thái nấm mơi trường PDA hình thái bào tử mẫu N7 46 Hình 3.8 Hình thái nấm mơi trường PDA hình thái bào tử mẫu N8 47 Hình 3.9 Hình thái nấm mơi trường PDA hình thái bào tử mẫu N12 47 Hình 3.10 Hình thái nấm mơi trường PDA hình thái bào tử mẫu N23 47 Hình 3.11 Hình thái nấm mơi trường PDA hình thái bào tử mẫu N26 48 Hình 3.12 Hình thái nấm mơi trường PDA hình thái bào tử mẫu N29 48 Hình 3.13 Hình thái nấm mơi trường PDA hình thái bào tử mẫu N33 49 Hình 3.14 Hình thái nấm mơi trường PDA hình thái bào tử mẫu N35 49 vi Đồ án tốt nghiệp Hình 3.15 Biểu đồ thể phát triển chủng nấm N6 môi trường PDA, PSA, YEG, CMA, RICE 54 Hình 3.16 Biểu đồ thể phát triển chủng nấm N35 môi trường PDA, PSA, YEG, CMA, RICE 56 Hình 3.17 Biểu đồ thể phát triển chủng nấm N29 môi trường PDA, PSA, YEG, CMA, RICE 59 Hình 3.18 Tái phân lập theo quy tắc Koch chủng N6 60 Hình 3.19 Tái phân lập theo quy tắc Koch chủng N35 62 Hình 3.20 Khoảng cách di truyền chủng so sánh (MEGA X) 64 Hình 3.21 Cây phát sinh loài số chủng nấm gây bệnh đốm nâu lúa, xây dựng phương pháp NJ, bootstrap 1000, MEGA X 65 Hình 3.22 So sánh đặc điểm hình thái bào tử chủng N35 66 Hình 3.23 So sánh đặc điểm hình thái bào tử chủng N6 67 Hình 3.24 Kết đối kháng chủng nấm N6 chủng LAB (in vitro) 68 Hình 3.25 Kết đối kháng chủng nấm N35 chủng LAB (in vitro) 69 Hình 3.26 Biểu đồ tỷ lệ ức chế (%) N6, N35 chủng vi khuẩn lactic 69 Hình 3.27 Hình ảnh kết khảo sát đối kháng chủng nấm N6 với chủng khuẩn lactic mật độ khuẩn 109, 108, 107, 106 (cfu/ml) sau ngày 74 Hình 3.28 Hình ảnh kết đối kháng chủng nấm N35 chủng vi khuẩn lactic mật độ khuẩn 107 (cfu/ml) sau ngày 77 vii Đồ án tốt nghiệp Thành phần g/L Pepton 10 Cao thịt 10 Cao nấm men D – Glucose 20 Tween 80 Ammonium citrate Sodium acetate Magnesium sulphate 0,1 Manganese sulphate 0,05 Dipotassium phosphate Agar 15 Nước cất 1000ml pH 6,5 ± 0,2 A.6 Môi trường de Man, Rogosa Sharpe ( MRS Broth) Thành phần g/L Pepton 10 Cao thịt 10 Cao nấm men D – Glucose 20 Tween 80 Ammonium citrate Sodium acetate Magnesium sulphate 0,1 Manganese sulphate 0,05 Dipotassium phosphate Nước cất 1000ml pH 6,5 ± 0,2 Đồ án tốt nghiệp B Số liệu B.1 Kết quả khả phát triển chủng N6 môi trường PDA, PSA, YEG, CMA, Rice qua 2, 4, 6, 8, 10 ngày Đường kính tản nấm sau cấy ( cm ) Môi trường ngày PDA 2,5 2,5 2,5 3,8 3,5 3,7 PSA 3,5 3,7 3,5 4,4 6,2 YEG 2,5 2,5 2,5 CMA Rice 2,7 2,8 4 5 3,7 10 ngày 4,9 4,8 4,8 7,1 5,6 7,8 3,5 4,8 ngày 5,5 5,5 6,5 8 4,8 5,4 5,5 5,5 5,6 5,8 5,8 7,1 6,8 2,6 2,6 2,6 4,6 4,6 4,6 5,8 6,2 8 7,6 7,7 7,6 9 9 9 B.2 Kết quả khả phát triển chủng N35 môi trường PDA, PSA, YEG, CMA, Rice qua 2, , 6, 8, 10 ngày Đường kính tản nấm sau cấy ( cm ) Môi trường PDA ngày 3 5,3 5,5 5,2 5,5 10 ngày 5,5 5,8 6,2 5,8 6,3 PSA 3,5 3,2 3,5 5,8 5,8 5,8 6,3 6,1 6,8 6,9 6,8 YEG 2,8 2,8 2,7 4,5 4,5 4,2 5,8 5,6 5,9 7,5 7,5 8,5 9 8,5 9 7,8 7,7 9 CMA Rice 2,5 ngày 4,8 5,2 6,7 6,5 6,8 2,7 2,7 2,7 4,5 4,3 4,2 5,7 5,5 5,5 7,7 7,2 7,1 B.3 Kết quả khả phát triển chủng N29 môi trường PDA, PSA, YEG, CMA, Rice qua 2, , 6, 8, 10 ngày Đường kính tản nấm sau cấy ( cm ) Môi trường ngày ngày 10 ngày PDA 3,5 3,7 3,7 4,6 4,8 4,7 4,9 6,5 5,7 6,9 5,9 6,2 PSA 3,5 3,8 3,6 4,4 5,4 4,8 4,8 5,7 5 6,4 5,4 5,4 6,6 5,5 YEG 3 4,5 4,5 5,6 5,5 6,8 6,8 7,5 7,5 Đồ án tốt nghiệp CMA 3,5 3,5 5,5 5,5 6,8 6,8 8 8,5 9 Rice 2,6 2,6 2,6 4,1 4,3 4,1 5,3 5,3 5,5 7,2 7,2 7,5 8,5 B.4 Kết quả khảo sát đối kháng nấm bệnh chủng N6 chủng LAB (in vitro) L5 L3 L2N L10L C1 ĐC (+) ĐC (-) Ngang Dọc N D N D N D N D N D N D 38 50 60 50 32 42 34 44 40 54 50 45 70 75 38 45 66 70 37 50 40 52 48 57 57 58 65 72 38 48 65 68 40 48 38 49 43 49 55 60 72 75 B.4 Kết quả khảo sát đối kháng nấm bệnh chủng N35 chủng LAB (in vitro) L5 Ngang Dọc 49 50 39 46 41 59 L3 N 45 40 40 D 50 42 40 L2N N D 34 30 37 47 33 25 L10L N D 35 40 34 46 35 45 C1 N 37 36 33 D 47 47 35 ĐC (+) N D 52 79 50 75 55 77 ĐC (-) N D 67 69 66 69 69 68 C Kết quả giải trình tự C.1 Chủng N6 Trình tự gene vùng (ITS1/ITS4 primers) – Công ty Phù Sa Cần Thơ internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Trình tự dài 929 bq >N6 CATATGAGGCTGTCCGCAGCTGGAGTATTTTATTACCCTTGTCTTTTGCG CACTTGTTGTTTCCTGGGCGGGTTCGCTCGCCACCAGGACCACCAAATA AACCTTTTTTATGCAGTTGCAATCAGCGTCAGTACAAACAATGTAAATC ATTTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAA CGCAGCGAAATGCGATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCAT Đồ án tốt nghiệp CGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCT GTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTTTTT GTCTTTGGTCGCCCAAAGACTCGCCTTAAAGTGATTGGCAGCCGGCCTTT CTGGTTTCGCAGCGCAGCACATTTTTGCGCTTGCCATCAGCAAAACGGC AATCCATCAAGCCTCCTTCTCACGTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATA CCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGCCGGAGGAA Blast search C.2 Chủng N35 Trình tự gene vùng internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Primers ITS/LU Trình tự dài 977 bq >N35 TACACAATAAAATATGAAGGCTGTACGCGGCTGTGCTCTCGGGCCAGTT TTGCAGAGGCTGAATTATTTATTACCCTTGTCTTTTGCGCACTTGTTGTTT CCTGGGCGGGTTCGCCCGCCACCAGGACCACATCATAAACCTTTTTTAT GCAGTTGCAATCAGCGTCAGTATAACAAATGTAAATCATTTACAACTTT CAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATG CGATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAA CGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTC ATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTTTTTTGTCTTTGGTTG Đồ án tốt nghiệp CCAAAGACTCGCCTTAAAAGGATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGCAG CGCAGCACATTTTTGCGCTTGCAATCAGCAAAAGAGGACGGCAATCCAT CAAGACTCCTTCTCACGTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTG AACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGC CCTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCT CTTTCAGAGTCCGAGTTGTAATTTGCAGAGGGCGCTTTGGCTTTGGCAGC GGTCCAAGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTAC GTGGTCGCTAGCTATTGCCGTGTAAAGCCCCTTCGACGAGTCGAGTTGTT TGGGAATGCAGCTCTAAATGGGAGGTAAATTTCTTCTAAAGCTAAATAT TGGCCAGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAG CACTTTGGAAAGAGAGTCAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAG GCACTCTTCTGCAGGCAGGCCAGCATCAGTTTGGGCGGTGGGA Blast search Đồ án tốt nghiệp D Hình ảnh D.1 Bào tử N35 D.2 Bào tử N6 D.3 Đối kháng nấm N6 chủng L5 Đồ án tốt nghiệp D.4 Đối kháng nấm LAB D.5 Quan sát phát triển nấm lúa đối kháng in vivo E Xử lý thống kê E.1 Khả kháng nấm N6 chủng LAB ‘kha nang khang nam N6 cua LAB 00:00 Monday, February 10, 2014 The ANOVA Procedure Class Level Information Đồ án tốt nghiệp Class Levels T Values + C1 L10L L2N L3 L5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 ‘kha nang khang nam N6 cua LAB 00:00 Monday, February 10, 2014 The ANOVA Procedure Dependent Variable: N Sum of DF Squares Source Model Error 12 Corrected Total Mean Square 3841.410644 768.282129 516.657733 43.054811 17 Coeff Var Root MSE 0.881448 19.16422 6.561617 DF T Pr > F 17.84 F F 15.28 F