Phân lập, định danh các chủng vi khuẩn lên men acid lactic và bước đầu ứng dụng để làm cơm mẻ.pdf

NTTU-NCKH-04 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2018 - 2019 Tên đề tài: Phân lập, định danh chủng vi khuấn lên men acid lactic bước đầu ứng dụng để làm cơm mẻ Số hợp đồng: 2019.01.52/HĐ.KHCN Chú nhiệm đề tài: Ông Bỉnh Nguyên Đơn vị công tác: Viện Kỳ thuật Công nghệ Cao Thời gian thực hiện: 06/2019 - 12/2019 TP Hồ Chí Minh, ngày 20 thảng 11 năm 2019 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2018 -2019 Tên đề tài: Phân lập, định danh chủng vi khuẩn lên men acid lactic bước đầu ứng dụng đe làm cơm mẻ Số hợp đồng: 2019.01.52/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: Ông Bỉnh Nguyên Đơn vị công tác: Viện CNC Thời gian thực hiện: 06/2018 - 11/2018 Các thành viên phối họp cộng tác: STT Họ tên Chuyên ngành Trấn' Thị Bích Huy Nguyễn Thành Cơng Ngơ Vĩnh Tường SL ĐV Cơ quan công tác Viện CNC SL ĐV Viện CNC CNSH Sinh viên Ký tên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẨT DANH MỤC CÁC BẢNG BIÊU, sơ ĐỊ, HÌNH ẢNH MỞ ĐÀU CHƯƠNG TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cơm mẻ 1.2 Vi khuân lên men lactic 10 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 14 2.1 Nội dung nghiên cứu 14 2.2 Phương pháp nghiên cứu 14 2.2.1 Phương pháp thu thập mầu 14 2.2.2 Phân lập chủng vi sinh vật sinh lactic 14 2.2.3 Tách chiết thu nhận DNA tổng số 15 2.2.4 Khuếch đại vùng trình tự 16S rRNA .17 2.2.5 Giải trình tự gen vùng khuếch đại 18 2.2.6 So sánh với sở dừ liệu GenBank 20 2.2.7 Nuôi cấy chủng LAB môi trường cơm gạo, đe làm cơm mẻ 21 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Ket phân lập chúng vi khuan lactic 22 3.2 Kết tách chiết DNA từ vi khuẩn LAB phân lập 24 3.3 Kết khuếch đại vùng trình tự 16S rDNA 25 3.4 Ket giải trình so sánh ngân hàng gen 26 3.5 Ket khảo sát khả sinh acid lactic chủng vi sinh vật phân lập 33 3.6 Kết sản phẩm cơm mẻ 36 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 4.1 Kết luận: 38 4.2 Kiến nghị: 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO .39 PHỤ LỤC 39 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Lactic acid bacteria LAB BLAST Basic Local Alignment Search Tool Base pair Bp dATP Deoxyadenosine triphosphate dCTP Deoxycytidine triphosphate dGTP Deoxycyguanosine triphosphate DNA Deoxyribxom DNAse Deoxyribonuclease dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate dTTP Deoxythymidine triphosphate DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU, sơ ĐỒ, HÌNH ẢNH Danh mục hình ảnh Hình 1.1 Cơm mẻ .8 Hình 1.2 Món cá nâu nấu mẻ .9 Hình 1.3 Phân tử acid lactic 10 Hình 1.4 Con đuờng tống hợp acid lactic vi sinh vật [6] 11 Hình 3.1 Đĩa thạch phân lập chủng LAB từ cơm mẻ sữa chua 22 Hình 3.2 Hình ảnh vịng phân giải vi khuân sinh acid lactic đuợc phân lập từ thực phẩm lên men Thái lan (Tác già Phanwipa Pangsri) [4,8] 23 Hình 3.3 Một sơ hình ảnh chủng vi khn phân lập từ cơm mẻ khơng có khả phân giải CaCO3 .24 Hình 3.4 Kết điện di DNA tong mầu M1-M8 24 Hình 3.5 Ket điện di sản phẩm PCR từ mầu Ml - M8 25 Hình 3.6 Ket giải trình tự Mầu 26 Hình 3.7 Ket so sánh trình tự gen bank mẫu MI 26 Hình 3.8 Ket giải trình tự Mầu M2 27 Hình 3.9 Ket so sánh trình tự gen bank mẫu M2 27 Hình 3.10 Ket giải trình tự Mầu M3 28 Hình 3.11 Ket so sánh trình tự gen bank mẫu M3 28 Hình 3.12 Ket giải trình tự mẫu M4 29 Hình 3.13 Ket so sánh trình tự gen bank mẫu M4 29 Hình 3.14 Kết giải trình tự Mầu M5 30 Hình 3.15 Ket so sánh trình tự gen bank mẫu M5 30 Hình 3.16 Ket giải trình tự mầu M6 31 Hình 3.17 Ket so sánh trình tự gen bank mẫu M6 31 Hình 3.18 Ket giải trình tự mẫu M7 32 Hình 3.19 Ket so sánh trình tự gen bank mẫu M7 32 Hình 3.20 Ket giải trình tự mẫu M8 33 Hình 3.21 Ket so sánh trình tự gen bank mẫu M8 33 Hình 3.22 Đường chuẩn acid lactic với phương pháp quang kế với thuốc thử FeCl3 34 Hình 3.23 Ket mầu thử tạo màu với thuốc thử FeCl3 34 Hình 3.24 Cơm mẻ lên mẻ lên men từ chủng Ml, M2,M3 36 Hình 3.25 Cơm mẻ lên mẻ lên men từ chủng M4,M5, M6 36 Hình 3.26 Cơm mẻ lên mẻ lên men từ chủng M7 37 Danh mục bảng biêu Bảng 2.1 Môi trường MRS chỉnh sửa 14 Bảng 2.2 Các thành phần có phản ứng khuếch đại vùng HV1 17 Bảng 2.3 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR sau: 18 Bảng 2.4 Cặp môi sử dụng phản ứng giải trình tự vùng 16s rDNA [1,5,11] 18 Bảng 2.5 Môi trường MRS đánh giá khả tạo acid lactic [12] 21 Bảng 3.1 Kêt nông độ acid lactic chủng 35 TÓM TẤT KỂT QUẢ NGHIÊN cứu Kết quà đạt Công việc thực STT Nội dung - Thu mẫu chùng vi Thu mẫu cơm mẻ, mẫu kim chi sinh vật lên men lactic Nội dung - Phân lập chủng vi chủng vi khuấn sinh vật sinh lactic Nội dung - Tách chiêt thu nhận Tách chiết DNA cùa chủng vi DNA tổng số khuân Nội dung - Khch đại vùng trình Khuếch đại thành cơng trình tự vùng tự 16S rRNA 16S rRNA chủng Nội dung - Giải trình tự gen vùng Giải trình tự vùng 16S rRNA khuếch đại chùng vi khuân Xác định hàm lượng acid lactic men lactic cùa vi sinh vật phân lập chủng vi khuẩn lactic phân lập Nội dung - Đánh giá khà lên STT Sản phẩm đạt Sản phẩm đăng ký Cơm mẻ thành phàm 2kg Cơm mẻ thành phâm 2kg Báo cáo tông kết 51 trang Báo cáo tông kết 30 trang Bài báo khoa học Bài báo khoa học Thời gian thực hiện: từ 06/2019 đến ngày 12/2019 Thời gian nộp báo cáo: ngày 25/12/2019 MỞ ĐẦU Mẻ hay cơm mẻ gia vị truyền thống ẩm thực Việt Nam có vị chua dịu thơm đặc trưng, thường làm từ cơm nguội bún có xuất xứ từ miền Bắc Việt Nam Cơm mẻ bổ dường, giàu đạm, vitamin, acid lactic, khơng tương trợ cho số ăn trở nên thơm ngon, đặc biệt, mà cịn có lợi ích định sức khỏe người Là vị vị ẩm thực người Việt, mẻ khẳng định giá trị khác biệt so với thứ gia vị chua khác Tuy nhiên, với sở lên men truyền thống hộ gia đình tự ni cơm mẻ có khả khơng đảm bảo chất lượng vệ sinh an tồn thực phẩm Và muốn tạo cơm mẻ đến với số lượng lớn, nhanh, nhiều sở chế biến mẻ dụng cụ bấn, sinh nhiều loại vi trùng, vi khuẩn có độc trình lên men, gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe người sử dụng Vì vậy, đề đảm bảo độ an toàn cơm mẻ, cần xác định chủng vi sinh vật lên men acid latic có lợi cho sức khỏe người tiêu dùng CHU ƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Com mẻ Mẻ hay com mẻ gia vị truyền thống ẩm thực Việt Nam có vị chua dịu thơm đặc trung, thường làm từ cơm nguội bún có xuất xứ từ miền Bắc Việt Nam Cơm mẻ bố dưỡng, giàu đạm, vitamin, acid lactic, khơng tương trợ cho so ăn trở nên thơm ngon, đặc biệt, mà cịn có lợi ích định sức khỏe người Mẻ vị vị ẩm thực người Việt, mẻ khẳng định giá trị khác biệt so với thứ gia vị chua khác, cơm mẻ lấy khỏi hũ đựng, tán mịn với chút muối ăn đe giết mẻ, lọc qua rây bỏ xác để lấy thành phẩm dạng nước sánh đặc, trắng đục, chua thơm, sử dụng vơ số ăn ẩm thực Việt Nam trải khắp ba miền Một danh sách không đầy đủ thường biết đến bao gồm thịt chó, om, lẩu, chả nướng, canh chua Hình 1.1 Cơm mẻ Cơm mẻ bao gồm số thành phần gồm mẻ, nấm men vi khuẩn lên men acid lactic Con mẻ loại tuyến trùng hữu ích mang tên Panagrellus redivivus nhỏ nhung có the nhìn thấy mắt thường, bò ngọ nguậy bề mặt cơm hũ mẻ thành dụng cụ chứa đựng Trong hầu hết người ý đến mẻ, thực chất mẻ lại khơng đóng vai trị cốt yếu tiến trình lên men thành cơm mẻ mà báo hiệu cho người sử dụng biết chất lượng cơm mẻ Nấm men thành phần thứ hai cơm mẻ, có dạng hình chùm, cung cấp nhiều vitamin đạm, hồ trợ dinh dưỡng Vi khuẩn lactic thành phàm thứ ba thành phần cơm mẻ Vi khuẩn lactic có khả chuyển hóa tinh bột thành đường từ đường chuyển thành acid lactic từ tạo thành vị chua cơm mẻ Vi khuấn cịn kích thích hệ tiêu hóa, tận dụng chất bột, đường, tạo điều kiện cho mơi trường có pH thấp làm ức chế vi khuẩn có hại cho đường ruột Escherichia coli, Salmonella [1,4] Hình 1.2 Món cá nâu nấu mẻ Trong ẩm thực người Việt, thịt chó với cơng thức gia vị tiếng gồm riềng-mẻ-mắm tôm sử dụng tẩm ưóp pha chế bát nước chấm cho hầu hết nhựa mận, chả chó, xáo chó, chân chó hầm, thịt chó hấp Các biến thể giả thịt chó (giả cầy) sử dụng gia vị kể đến gồm thịt chân giị nấu giả cầy, vịt/ngan nấu giả cầy, thịt bò giả cầy Các canh cá nấu chua sử dụng cơm mẻ, thường biết đến với tên gọi canh cá giấm mẻ, canh chua cá linh, canh cá dọc mùng, canh chua cơm mẻ bơng so đũa, cá lóc nấu mẻ, canh chua cá rô cơm mẻ, canh chua cá đuối cơm mẻ 1.2 Vi khuẩn lên men lactic Lactic acid có hai đồng phân quang học L(+) D(-) carbon bất đối xứng cấu trúc Trong D(-) lactic acid có hại cho người, độc tính với tế bào não [6] L(+) lactic acid (L-lactate) không gây hại cho sức khỏe người ưa dùng sản phẩm lên men sử dụng làm nguyên liệu polymer, tạo hương liệu hay chất bảo quản [9], COOH COOH H —c—OH HO—c— H I I CH3 ch3 D (-) levorotatory lactic acid L (+) dextrorotatory lactic acid Hình 1.3 Phân tử acid lactic 10 ... đường tổng hợp acid lactic vi sinh vật [6] Vi khuẩn lên men lactic: Các vi sinh vật tham gia vào trình lên men lactic gọi chung LAB (Lactic acid bacteria), nhóm phổ biến nhóm trực khuẩn lactic (Lactobacillus'')... phân đế lên men lactic acid nên q trình lên men có the rút gọn thành bước thay bước Nhóm vi khuấn gọi ALAB (amylolytic lactic acid bacteria) Một so chủng L plantarum L.fermentum phân lập sử dụng. .. Quá trình lên men lactic: có đường lên men đồng hình (homofermentative pathway) lên men dị hình (heterofermentative pathway) [6] Lên men đồng hình: từ phân tử glucose tạo phân tử lactic acid ATP