PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN Streptococcus iniae TRÊN CÁ CHẼM (Lates calcarifer) ISOLATION, IDENTIFICATION, AND ANTIMICROBIAL SUSCEPTIBILITY TESTING OF Streptococcus iniae ISOLATED FROM ASIAN SEA BASS (Lates calcarifer) Nguyễn Bảo Trung*, Trần Hữu Tính, Trần Thị Tuyết Hoa Từ Thanh Dung Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ Email: ttdung@ctu.edu.vn ABSTRACT Streptococcosis or “popeye” disease is causing severe losses in marine fish production globally The aim of this study was to characterize Streptococcus iniae isolated from Asian sea bass (Lates calcarifer) cultured in tanks in VungTau province, Vietnam A total number of thirty sea bass (250-600 gr), with clinical signs of listless swimming, unilateral and bilateral exophthalmia, skin hemorrhages and pale livers were sampled Bacterial isolates wereperformed from the liver, kidney, spleen, brain and eye of diseased fish The inoculating loops were streaked onto brain heart infusion agar (BHIA) and blood agar (BA) supplemented with sodium chloride at the concentration of 15‰ Bacterial cultures were incubated at 28°C for 24hrs Grampositive cocci, chain-forming, small and opaque colonies and betahaemolytic bacterial isolateswere identified as Streptoccocus iniae,using biochemical tests, rapid identification systems and 16S rRNA gene partial sequencing Antimicrobial susceptibility testing was performed with ten antibiotics, using the standardized disc diffusion method The results showed that the selected bacterial isolates showed the highest sensitivity to cefotaxime (CXT), doxycycline (DO), erythromycin (E) and florfenicol (FFC), but were completely resistant to colistin sulfate (CS) and fluminquine (UB) The minimal inhibitory concentrations (MICs) were also determined in this study Key words: Streptococcus iniae, sea bass, Lates calcarifer, antimicrobial susceptibility ĐẶT VẤN ĐỀ Cá chẽm (Lates calcarifer) lồi cá khả thích nghi rộng rộng muôi, sinh trưởng nhanh Cá chẽm bắt đầu nuôi từ năm 1970 Thái Lan, sau lan rộng nhiều nước Đơng Nam Á giá trị kinh tế nhu cầu thị trường cao (FAO, 2012) Ở Việt Nam, người ta bắt đầu nuôi cá chẽm từ năm 1990 với quy mô nhỏ thiếu giống Hiện nay, cá chẽm xem vật ni xóa đói giảm nghèo đối tượng ni thay cho diện tích nuôi tôm không hiệu số địa phương ven biển nước ta Hiện chưa có số liệu thống kê cụ thể sản lượng diện tích ni cá chẽm nước ta, qua tìm hiểu thơng tin từ báo cho thấy cá chẽm nuôi thành công số nơi Cam Ranh, Vạn Ninh (Khánh Hòa) Hương Trà (Thừa Thiên Huế), Hà Tĩnh, Đồng Nai, Bình Định, Cà Mau (Phúc, 2011) Tuy nhiên, loại bệnh nghiêm trọng bệnh ảnh hưởng đến loài cá nuôi Cá nuôi lồng trở nên dễ mắc bệnh mà thông số môi trường nhiệt độ, độ mặn, nồng độ oxy hòa tan chất lơ lửng thay đổi nhiều đột ngột Chỉ cần điều kiện thích hợp cho bệnh tạo điều kiện cho bệnh phát triển, trình dẫn tới bệnh môi trường nước xảy nhanh Việc xác định sớm thay đổi hoạt động dấu hiệu bệnh cá nuôi quan trọng để chẩn đoán bệnh PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp thu mẫu Trong nghiên cứu này, mẫu cá chẽm bệnh thu từ 42 bể composite bể xi măng, nuôi công nghiệp tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu, Việt Nam Mẩu cá có trọng lượng từ 250-600 gram/con, có dấu hiệu bơi lờ đờ, mắt phồng to bên hai bên, kèm theo xuất huyết da, gan bị tái thu phân tích trực tiếp phịng thí nghiệm trại nuôi 401 Phương pháp phân lập định danh vi khuẩn Các chủng vi khuẩn phân lập từ năm quan cá bệnh, bao gồm gan, thận, tì tạng, não, mắt; ni cấy môi trường thạch máu (BA), nước thịt BHIA (Brain heart infusion agar) có bổ sung1,5% NaCl (BHI-A+) Hầu hết đĩa môi trường này, sau ủ ở28°C 24-48 tủ ấm, xuất nhiều khuẩn lạc thuần, trắng dục, nhỏ li ti Tiến hành kiểm tra tiêu sinh hóa bản: Gram, tính di động, catalase, oxidase, khả sử dụng đường điều kiện hiếu khí yếm khí (O/F), dựa theo phương pháp Frerichs Millar (1993), Buller (2004) Đồng thời, sử dụng kít API 20Strep (BioMerieux) để định danh đến loài vi khuẩn Phương pháp lập kháng sinh đồ Nghiên cứu tiến hành xác định khả kháng thuốc chủng vi khuẩn 10 loại kháng sinh: ampicillin (AMP/25µg), cefotaxime (CTX/30µg), colistin (CS/30µg), doxycycline (DO/30µg), enrofloxacin (ENR/5µg), florfenicol (FFC/30µg), flumequine (UB/30µg), norfloxacin (NOR/5µg), rifampicin (RD/30µg), sulphamethoxazole/trimethoprim (SXT/25µg), (Oxoid, UK) Phương pháp lập kháng đồ thực theo tiêu chuẩn Clinical and Laboratory Standards Institute, M2-A09 (CLSI, 2006) Sử dụng môi trường BHIA (bổ sung thêm 1,5% NaCl) ủ 28°C 24-48 tiến hành đo đường kính vịng trịn vơ trùng (mm) nhằm xác định tính kháng nhạy vi khuẩn thuốc kháng sinh Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) vi khuẩn dựa phương pháp pha loãng dung dịch Clinical and Laboratory Standards Institue, M49-P (CLSI, 2006), pha loãng với loại kháng sinh tinh: colistin, enrofloxacin, erythromycin, florfenicol, oxytetracycline, trimethoprim, (Sigma) nồng độ: 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125 µg/mL, đối chứng dương (có vi khuẩn) đối chứng âm (khơng có vi khuẩn) Vi khuẩn nuôi tăng sinh môi trường BHI-B (Brain heart infusion broth) có bổ sung 1,5% NaCl (BHI-B+) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết phân lập vi khuẩn cá Chẽm Nghiên cứu tiến hành thu mẫu cá chẽm bị bệnh bể xi-măng: Vũng Tàu Kết phân lập 23 chủng vi khuẩn từ 40 cá chẽm bị bệnh Cá chẽm bị bệnh có dấu hiệu giống nhau, nhiều mức độ: cá bệnh thường bơi lờ đờ Việc quan sát dấu hiệu bên cho thấy cá thường bơi lội định hướng (lội đĩa), xuất huyết ởvây ngực phần bụng, cá thể bị nặng mắt lồi đục bên, hai bên (Hình 1.A) Đó dấu hiệu đặc trưng bệnh nhóm vi khuẩn Streptococcus gây ra, miêu ta nhiều tác giả khác Bromage(1999), Creeper Buller (2006), Baeck(2006), Aamri (2010), Suanyuk (2010) Nội quan cá thể dấu hiệu khác thường như: gan bị tái, thận tì tạng sưng (Hình 1.B) Kết phân lập vi khuẩn cá chẽm bệnh thu 23 chủng vi khuẩn môi trường BHIA (bổ sung 1,5% NaCl) ủ 28°C 24 Vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc trắng đục, tròn lồi, nhỏ li ti (0.5-1 mm) Vi khuẩn thuộc Gram dương, hình cầu chuỗi, có khả dung huyết dạng β mơi trường thạch máu, âm tính với oxidase, catalase, O/F, không di động, khả sử dụng đường môi trường hiếu khí, yếm khí,catalase oxidase âm tính (Bảng 1) 402 B A Hình 1: A: Cá chẽm biểu lồi mắt (mũi tên); B: Gan thận tỳ tạng sưng to (mũi tên) Bảng 1: Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa vi khuẩn gây bệnh phù mắt cá chẽm Chỉ tiêu Gram Hình dạng Kích thước khuẩn lạc Thời gian phát triển Dung huyết Di động Catalase ADH Oxidase O/F S iniae (Buller, 2004) dương cầu, chuỗi mm 24-48 Β -/- S iniae phân lập Dương cầu, chuỗi 0.5-1 mm 24-36 Β -/+ -/- Kết kiểm tra đặc điểm sinh hóa vi khuẩn nghiên cứu kit API 20Strep (Microbank™, PRO-LAB Diagnostics, UK) trình bày qua Bảng Bảng 2: Kết kiểm tra tiêu sinh hóa kit API 20Strep Chỉ tiêu VP HIP ESC PYRA GAL GUR GAL PAL LAP ADH RIB ARE MAN SOR LAC Voges Proskauer HIPpuric acid Esculin PYRrolidonyl Arylamidase α-GALactosidase ß-GlUcuRonidase ß-GALactosidase ALkaline Phosphatase Leucine AminoPeptidase Arginine DiHydrolase RIBose ARAbinose MANnitol SORbitol LACtose S iniae (Buller, 2004) + S iniae phân lập + + + + + + + + + + + - -/+ + + - 403 TRE TREhalose INU INUlin RAF RAFfinose AMD AmiDon GLYG Glycogen Ghi chú: dương tính (+), âm tính (-) + + + + + + Kết kháng sinh đồ Việc đối chiếu đường kính vùng trịn vơ trùng nghiên cứu với số liệu tham khảo CLSI M2-A09 cho thấy: chủng S iniae phân lập kháng hoàn toàn với colistin flumenquin Dù vậy, chủng nhạy với hầu hết loại kháng sinh, hình thành vùng trịn vơ trùng có kích thước lớn,và đặc biệt nhạy erythromycin doxycycline Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Nồng độ ức chế tối thiểu loại kháng sinh lên chủng S iniae nghiên cứu tóm tắt qua Bảng Các số liệu thể tương đồng kháng nhạy vi khuẩn kiểm tra định tính (kháng sinh đồ) định lượng (MIC) Trong đó,S iniae kháng colistin, thể qua giá trị MIC rấtcao (>512µg/mL) Nồng độ MIC loại kháng sinh cịn lại thấp, thể tính nhạy cao chủng S iniae loại kháng sinh, đặc biệt nhạy với erythromycin (MIC = 0.0325µg/mL).Các kết tính kháng thuốc chủng S iniae nghiên cứu lần phù hợp với kết gần Yon-Kyoung ctv (2009), Suanyuk ctv (2010) Bảng Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Kháng sinh (µg/mL) E ENR O TMP FFC CT M2B15 0.25 0.25 0.25 128 M2B17 0.0325 0.25 0.5 0.125 >512 Ghi chú: TMP: Trimethoprim, E: Erythromycin, ENR: Enrofloxacin; O: Oxytetracyclin; FFC: Florfenicol, CT: Colistin KẾT LUẬN Kết nghiên cứu phân lập vi khuẩn 20 mẫu cá chẽm thu Vũng Tàu, thu 13 chủng vi khuẩn Streptocuccus iniae với cá có dấu hiệu bệnh lý: bơi định hướng, mắt lồi đục, xuất huyết vây phần bụng Kết kháng sinh đồ cho thấy vi khuẩn S iniae phân lập cá chẽm kháng với khánh sinh: colistin sulfate (CS), flumequine (UB) tỏ nhạy với kháng sinh erythromycin (E), cefotaxime (CXT), doxycycline (DO) florfenicol (FFC) Giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) chủng vi khuẩn gây bệnh thấp (512µg/mL) TÀI LIỆU THAM KHẢO Phúc V.Đ, 2011 Tìm hiểu tác nhân gây bệnh lở loét cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi lồng biển nha trang - khánh hòa Aamri, F E., D Padilla, F Acosta, M J Caballero, J Roo, J, Brabo, J Vivas and F Real, 2012 Frist report of Streptococcus iniae in red progy (Pagrus pagrus, L.) Journal of Fish Disease 2012, 33 901-905 Baeck, G W., J H Kim, D K Gomez, S C Park, 2006 Isolation and characterization of Streptococcus sp From diseased flounder (Paralichthys olivaceus) in Jeju Island Journal of Veterinary Science (2006), 7(1) 53-58 404 Bromage, E S., A Thomas, L Owens, 1999 Streptococcus iniae, a bacterial infection in baramundi Lates calcarifer Diseases of Aquatic Organisms Volume 36: 177-181, 1999 Creeper, J H., and N B Buller, 2006 An outbreak of Streptococcus iniae in baramundi (Lates calcarifer) in freshwater cage culture Australian Vetirinary Journal Volume 84, No 11, November 2006 FAO.© 2006-2012.Cultured Aquatic Species Information Program.Lates calcarifer Cultured Aquatic Species Information Program Text by Rimmer, M.A In: FAO Fisheries and Aquaculture Department [online] Rome Updated June 2006 [Cited 27 May 2012] http://www.fao.org/fishery/culturedspecies/Lates_calcarifer/en#tcNA0019 G Nicolas Frerichs and Stuart D Millar, 1993 Manual for The Isolation and Identification of Fish Bacterial Pathogens Pisces Press, Stirling Nicky Buller, 2004 Bacteria from Fish and Other Aquatic Animals – A Practical Identification Manual CABI Publishing Clinical and Laboratory Standards Institute Methods for Broth Dilution Susceptibility Testing of Bacteria Isolated From Aquatic Animals; Proposed Guideline.CLSI document M49-P [ISBN 1-56238-577-1] Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2005 Clinical and Laboratory Standards Institute Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard—Ninth Edition Clinical and Laboratory Standards Institute document M2-A9 [ISBN 1-56238-586-0] Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2006 405 ... trùng (mm) nhằm xác định tính kháng nhạy vi khuẩn thuốc kháng sinh Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) vi khuẩn dựa phương... kít API 20Strep (BioMerieux) để định danh đến lồi vi khuẩn Phương pháp lập kháng sinh đồ Nghiên cứu tiến hành xác định khả kháng thuốc chủng vi khuẩn 10 loại kháng sinh: ampicillin (AMP/25µg),... (có vi khuẩn) đối chứng âm (khơng có vi khuẩn) Vi khuẩn ni tăng sinh mơi trường BHI-B (Brain heart infusion broth) có bổ sung 1,5% NaCl (BHI-B+) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết phân lập vi khuẩn cá Chẽm