Xét nghiệm LPA phát tính kháng thuốc vi khuẩn lao Hướng dẫn phiên giải báo cáo kết dành cho xét nghiệm viên bác sĩ lâm sàng Xét nghiệm LPA phát tính kháng thuốc vi khuẩn lao Hướng dẫn phiên giải báo cáo kết dành cho xét nghiệm viên bác sĩ lâm sàng Nội dung Các từ viết tắt v Các thuật ngữ vi Lời cảm ơn vii Đôi nét tài liệu viii Giới thiệu Nguyên lý xét nghiệm LPA (Line Probe Assay) GenoType MTBDRplus Version GenoType MTBDRsl Version Phiên giải báo cáo kết xét nghiệm LPA Các thay đổi phiên giải kết nhà sản xuất Các hoạt động chẩn đoán theo dõi bổ sung nhằm đưa phác đồ điều trị lao thích hợp Phiên giải kết LPA hàng 10 Rifampicin 10 Isoniazid 12 Phiên giải kết LPA hàng 14 Fluoroquinolones 14 Thuốc tiêm hàng hai 18 Nghiên cứu ca bệnh: Các ví dụ đánh giá lao kháng thuốc dựa LPA hàng 20 Tài liệu tham khảo 27 Phụ lục1 Mẫu báo cáo LPA hàng – Các ví dụ thực hành 31 Phụ lục Mẫu báo cáo LPA hàng – Các ví dụ thực hành 32 Phụ lục Sự thay đổi nucleotide cụ thể phát mẫu dò đột biến 34 iii Các từ viết tắt Am amikacin Thuốc chống lao amikacin CB clinical breakpoint Điểm gãy lâm sàng CC critical concentration Nồng độ tới hạn Cm capreomycin Thuốc chống lao capreomycin DST drug-susceptibility testing Kháng sinh đồ Eto ethionamide Thuốc chống lao ethionamide FL-LPA first line – line probe assay LPA- hàng FQ fluoroquinolone Thuốc chống lao fluoroquinolone H isoniazid Thuốc chống lao isoniazid Km kanamycin Thuốc chống lao kanamycin Lfx levofloxacin Thuốc chống lao levofloxacin LPA line probe assay Xét nghiệm LPA NTM non-tuberculous mycobacteria Mycobacterium không lao MIC minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MDR-TB multidrug-resistant tuberculosis Lao đa kháng thuốc Mfx moxifloxacin Thuốc chống lao moxifloxacin MTBC Mycobacterium tuberculosis complex Phức hợp Mycobacterium tuberculosis MUT mutation probe Đột biến mẫu dò Pto prothionamide Thuốc chống lao prothionamide QRDR quinolone-resistance determining region Vùng quy định kháng quinolone R resistant Kháng RRDR Rifampicin- resistance determining region Vùng quy định kháng Rifampicin Rif rifampicin Thuốc chống lao rifampicin S susceptible Nhạy SLI second-line injectable (drug) Thuốc tiêm hàng (i.e kanamycin, amikacin, capreomycin) (vd kanamycin, amikacin, capreomycin) SL-LPA second line – line probe assay Xét nghiệm LPA – hàng TB tuberculosis Bệnh Lao WT wild-type Chủng hoang dại v Các thuật ngữ Nồng độ tới hạn: Nồng độ thấp thuốc lao môi trường in vitro ức chế 99% số lượng vi khuẩn mọc chủng Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) kiểu hình hoang dại Điểm gẫy lâm sàng: Là nồng độ thuốc lao xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao nồng độ tới hạn, giá trị tách biệt chủng đáp ứng với điều trị với chủng không đáp ứng với điều trị Nồng độ xác định nhiều biến số, bao gồm giá trị in vivo, mối tương quan số liệu kết lâm sàng có sẵn số liệu PK/PD bao gồm liều dùng phân phối giá trị MIC marker phân tử Việc tăng liều dùng sử dụng để khắc phục tính kháng quan sát liều dùng thấp hơn, tăng mức cao liều dùng dung nạp được, liều dùng cao điểm gãy lâm sàng cho thuốc không khuyến cáo sử dụng Sử dụng điểm gãy lâm sàng để áp dụng cho việc điều trị bệnh nhân Nồng độ ức chế tối thiểu nồng độ thấp thuốc lao để ức chế phát triển 99% số lượng vi sinh vật kỹ thuật kháng sinh đồ pha loãng môi trường đặc lỏng Thông thường việc thử nghiệm MIC theo phương thức chuẩn hóa tổng hợp cho lồi, phân bố MIC theo hình thái Gausian đơn lẻ tạo thành, phù hợp với phân bố hoang dại kiểu hình lồi ( ví dụ: phân bố cho lồi sinh vật thiếu chế kháng phát kiểu hình) Các phân bố bổ sung với MIC tổng cao xác định tương ứng với sinh vật có chế kháng nội tự nhiên (ví dụ phân bố kiểu hình khơng hoang dại) vi Lời cảm ơn Hướng dẫn sản phẩm Nhóm chiến lược tồn cầu phịng xét nghiệm (GLI) Việc xây dựng tài liệu hướng dẫn hoàn thiện Elisa Tagliani Daniela Cirillo (Viện khoa học San Raffaele), với đóng góp Elisa Ardizzoni, Bouke de Jong Leen Rigouts (Viện Y học Nhiệt đới Antwerp) Xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới thành viên Nhóm chủ chốt với đóng góp to lớn họ, bao gồm Heather Alexander, Olajumoke Tubi Abiola, Maka Akhalaia, Heidi Albert, Uladzimir Antonenka, Martina Casenghi, Petrade Haas, Kathleen Anh, Lucilaine Ferrazoli, Marguerite Massinga Loembe, Alaine Umubyeyi Nyaruhirira, Daniel Orozco, Kaiser Shen, Thomas Shinnick, Alena Skrahina, Sabira Tahseen Nguyễn Văn Hưng Q trình hồn thiện tài liệu ghi nhận nỗ lực phối hợp thông tin kỹ thuật quý báu từ Dennis Falzon, Christopher Gilpin, Lice GonzálezAngulo, Alexei Korobitsyn, Fuad Mirzayev Karin Weyer Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) Chương trình Lao tồn cầu Các tác giả thực tất biện pháp phòng ngừa hợp lý để xác minh thơng tin có tài liệu Tuy nhiên, khơng có bảo đảm việc phân phối tài liệu hình thức nào, thực công khai mô chỉnh sửa Người đọc chịu trách nhiệm việc diễn giải sử dụng tài liệu Các tác giả không chịu trách nhiệm cho thiệt hại phát sinh từ việc sử dụng tài liệu trường hợp GLI nhóm nghiên cứu nhằm ngăn chặn bệnh lao Soạn thảo xuất tài liệu thực với Với hỗ trợ tài từ Cơ quan phát triển Quốc tế Hoa Kỳ Ảnh bìa © Alicephotography Thiết kế đồ họa sử dụng hạn chế bố cục hướng dẫn Chịu trách nhiệm dịch tiếng Việt: Phó Giáo sư Nguyễn Văn Hưng Nhóm Sinh học phân tử, Khoa Vi Sinh Phòng Xét Nghiệm Lao Chuẩn Quốc Gia, Bệnh viện Phổi Trung Ương vii Đôi nét tài liệu Tài liệu xây dựng nhằm cung cấp hướng dẫn cách phiên giải kết hầu hết trường hợp thường gặp xét nghiệm LPA hàng 1, hàng (VD.Xét nghiệm GenoType MTBDRplus V2.0 and GenoType MTBDRsl V2.0; Hain Lifescience, Đức) Ngoài việc phiên giải đột biến xác định hai xét nghiệm trên, hướng dẫn bao gồm khuyến cáo việc thực xét nghiệm chẩn đoán theo dõi bổ sung có có mặt đột biến cụ thể ý nghĩa lâm sàng mang lại việc lựa chọn phác đồ điều trị bệnh lao phù hợp Hướng dẫn nhằm cung cấp cho xét nghiệm viên bác sĩ lâm sàng thông tin sau đây: Mối quan hệ đột biến cụ thể kiểu hình kháng thuốc Các trường hợp tính kháng liên quan đến đột biện cụ thể khơng xác định tính kháng suy luận Ý nghĩa lâm sàng đột biến cụ thể phát xét nghiệm LPA Ngồi ra, hướng dẫn cịn hỗ trợ cho nhân viên phòng xét nghiệm lao quốc gia khu vực để hiểu rõ quản lý khác biệt có kháng sinh đồ kiểu hình kiểu gen Hướng dẫn phác thảo đột biến xác định hai xét nghiệm LPA hàng hàng 2, bao gồm thông tin liên quan đến mối liên hệ chúng với kháng thuốc kiểu hình dựa nghiên cứu cơng bố Miotto cộng (1) với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cho loại thuốc lao hàng 1và hàng WHO báo cáo gần (2, 3) Phiên giải kết xét nghiệm, xét nghiệm chẩn đoán theo dõi bổ sung ý nghĩa lâm sàng liên quan đến có mặt đột biến cụ thể trường hợp mà tính kháng suy luận báo cáo Cuối cùng, minh họa nghiên cứu ca bệnh cụ thể để trình bày cách báo cáo kết xét nghiệm cho bác sĩ lâm sàng, ví dụ kết LPA mẫu báo cáo khuyến nghị viii Lời giới thiệu Trong hai thập kỷ qua có nhiều cải thiện hiểu biết sở phân tử tính kháng thuốc, điều dẫn đến phát triển nhiều phương pháp chẩn đoán dựa kiểu gen cho việc xác định nhanh chóng tính kháng thuốc vi khuẩn lao Bên cạnh việc chẩn đốn nhanh chóng, xét nghiệm phân tử có lợi bổ sung khả áp dụng trực tiếp với bệnh phẩm lâm sàng (không cần nuôi cấy phân lập chủng môi trường đặc lỏng) mẫu bệnh phẩm có chứa vi khuẩn khơng cịn sống (ví dụ:vi khuẩn bị giết nhiệt bất hoạt hóa học), khả xử lý khối lượng mẫu lớn giảm yêu cầu an toàn sinh học phịng thí nghiệm Năm 2008, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) thông qua việc sử dụng xét nghiệm LPA hàng 1, GenoType MTBDRplus (gọi tắt GenoType MTBDRplus V1), để phát nhanh bệnh lao đa kháng thuốc (MDR) -TB) (4) Sau đó, phiên công nghệ LPA phát triển từ năm 2011, bao gồm (i) GenoType MTBDRplus phiên (gọi tắt GenoType MTBDRplus V2) (ii) Nipro NTM + MDRTB detection kit (được gọi Nipro, Tokyo, Nhật Bản) Những phiên kỹ thuật LPA nhằm mục đích cải thiện độ nhạy phát MTBC đồng thời phát kháng với rifampicin (Rif) isoniazid (H) Vào năm 2015, FIND (Quỹ chẩn đoán sáng tạo mới) đánh giá xét nghiệm Nipro GenoType MTBDRplus V2 so sánh với GenoType MTBDRplus V1 Nghiên cứu chứng minh ba kit thương mại có kết tương đương Kỹ thuật LPA để phát vi khuẩn lao kháng với Rif H (5) Bộ kit LPA thương mại phát kháng thuốc lao hàng hai GenoType MTBDRsl phiên 1.0, phát triển Hain Lifescience thập kỷ trước (gọi tắt GenoType MTBDRsl V1) Phiên cập nhật kỹ thuật (GenoType MTBDRsl V2) phát đột biến liên quan đến kháng thuốc fluoroquinolone thuốc tiêm hàng hai (SLI) phát phiên 1.0, bổ sung thêm đột biến (được mơ tả phần bên dưới), thức sử dụng từ 2015 Ngay năm tiếp theo, WHO đưa khuyến nghị việc sử dụng kit thương mại LPA hàng có bán thị trường (ví dụ GenoType MTBDRplus V1, GenoType MTBDRplus V2 Nipro) để xét nghiệm ban đầu thay thực kháng sinh đồ kiểu hình (DST) phát tính kháng Rif H (6) Đồng thời, khuyến nghị việc sử dụng GenoType MTBDRsl (V1 V2) để phát kháng với fluoroquinolones thuốc tiêm hàng bệnh nhân kháng rifampicin / MDR-TB hướng dẫn bắt đầu phác đồ điều trị thích hợp cho bệnh nhân MDR-TB WHO ban hành năm 2016 (7) Để biết chi tiết vị trí kỹ thuật LPA hàng hàng sơ đồ chẩn đốn bệnh lao,vui lịng tham khảo tài liệu GLI model TB diagnostic algorithms GLI (cập nhật vào tháng năm 2018) (8) Mục đích tài liệu này, tập trung vào hai kỹ thuật LPA sử dụng rộng rãi (ví dụ: GenoType MTBDRplus V2 GenoType MTBDRsl V2), để cung cấp hướng dẫn cho xét nghiệm viên bác sĩ điều trị việc phiên giải kết kỹ thuật LPA X T NGHIỆM LPA PHÁT HIỆN TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN LAO hàng hàng 2, để hiểu rõ quản lý tốt trường hợp bất đồng kết kháng sinh đồ kiểu gen kiểu hình Nguyên lý xét nghiệm LPA Kỹ thuật lai mẫu dị nhóm xét nghiệm dựa strip DNA để xác định thông tin kháng thuốc chủng MTBC thơng qua mơ hình liên kết sản phẩm khuếch đại DNA với mẫu dị đích với vị trí đột biến phổ biến quy định tính kháng thuốc hàng hàng mẫu dị đích tương ứng với trình tự DNA hoang dại Xét nghiệm LPA WHO phê chuẩn sử dụng để phát nhanh tính kháng thuốc hàng thứ hàng Các kỹ thuật xét nghiệm với chủng nuôi cấy (xét nghiệm gián tiếp), xét nghiệm với mẫu đờm soi AFB dương tính (LPA hàng 1) mẫu đờm soi AFB âm dương tính(LPA hàng 2) (6, 7) Đột biến phát cách: (i) Gắn sản phẩm khuếch đại DNA với mẫu dị đích với đột biến xảy phổ biến (mẫu dò MUT) (ii) suy thiếu phức hợp lai (tức thiếu liên kết) sản phẩm khuếch đại với mẫu dò WT tương ứng Phản ứng sau bước lai dẫn đến xuất băng vạch strip để phát mẫu dò tương ứng gắn vào Điều quan trọng cần nhớ tương tự xét nghiệm nhanh khác WHO chứng thực, xét nghiệm LPA có số hạn chế: • Mặc dù xét nghiệm LPA phát đột biến thường gặp chủng kháng thuốc, số đột biến kháng thuốc nằm vùng bao phủ xét nghiệm, strip tất băng WT khơng thể loại trừ hồn tồn tính kháng thuốc Vì vậy, số trường hợp, xét nghiệm bổ sung kháng sinh đồ kiểu hình cần thiết để có đánh giá đầy đủ • Một số đột biến xác định cụ thể xuất băng MUT, đột biến khác suy khơng có liên kết sản phẩm khuếch đại với mẫu dị WT Trường hợp khơng băng WT đồng thời mẫu dị MUT cũng khơng băng, có khả diện chủng mang đột biến kháng thuốc Tuy nhiên, lỗi hệ thống đột biến đồng nghĩa không đồng nghĩa (ví dụ: đột biến gen phát sinh) Trên tồn cầu, điều ( Suy có đột biến liên quan đến tăng MIC nồng độ cao> Phát đột biến liên quan đến tăng MIC mức độ thấp > Suy có đột biến liên quan đến tăng MIC mức độ thấp > Khơng phát tính kháng Đối với Rif: Phát kháng > Suy có kháng > Khơng phát kháng 31 Phụ lục Mẫu báo cáo xét nghiệm LPA hàng Lưu ý mục “Kết luận” không bao gồm báo cáo phịng xét nghiệm Ví dụ Thuốc Lfx a Mfx a Km a Gien Đột biến Phiên giải Kết luận gyrA D94A Khơng có đột biến Phát kháng với Lfx Levofloxacin khơng có hiệu gyrB gyrA D94A gyrB No mutation rrs a1401g Đột biến promote vùng -10 đến 15 r eis Am rrs a1401g Cm rrs a1401g Phát đột biến liên quan đến tăng MIC nồng độ thấp với Mfx Moxifloxacin sử dụng liều cao Phác đồ nên đánh giá lại dựa kết KSĐ kiểu hình CB Phát kháng với Km Phát kháng với Am Kanamycin khơng có hiệu Amikacin khơng có hiệu Capreomycin khơng có hiệu Phát kháng với Cm Ví dụ Thuốc Lfx Mfx Km Gene Đột biến Phiên giải Kết luận gyrA A90V gyrB Khơng có đột biến Phát kháng với Lfx gyrA A90V gyrB Khơng có đột biến Levofloxacin khơng có hiệu Moxifloxacin sử dụng liều cao Phác đồ nên đánh giá lại dựa kết KSĐ kiểu hình CB rrs No mutation eis Đột biến vùng 37 promoter Am rrs Khơng có đột biến Cm rrs Khơng có đột biến Phát đột biến liên quan đến tăng nồng độ MIC mức thấp với Mfx Suy kháng với Km Không phát kháng với Am Không phát kháng với Cm 32 Kanamycin hiệu Amikacin có hiệu Capreomycin có hiệu PHỤ LỤC SL- MẪU BÁO CÁO LPA– CÁC VÍ DỤ THỰC HÀNH Ví dụ Thuốc Gene Lfx gyrA Đột biến Kết luận Levofloxacin không hiệu Đột biến codon 89–93 gyrB Phiên giải Suy kháng với Lfx Moxifloxacin sử dụng liều cao Phác đồ nên đánh No mutation giá lại dựa kết KSĐ kiểu hình CB gyrA Đột biến codon 89-93 Mfx Suy đột biến liên quan đến tăng nồng độ MIC mức gyrB Khơng có đột thấp với Mfx biến Lưu ý Những khuyến nghị không áp dụng giải trình tự trước bắt đầu điều trị, xác định đột biến không liên quan đến kháng FQ KSĐ kiểu hình cho thấy nhạy CC rrs Km Am Khơng có đột biến eis Đột biến promoter vùng rrs Khơng có đột biến Cm rrs Khơng có đột biến Khơng phát kháng với Km Kanamycin khơng có hiệu Amikacin có hiệu Khơng phát kháng Capreomycin có hiệu với Km Khơng phát kháng Cm a Nếu có nhiều mẫu dị loại thuốc cung cấp thơng tin, kết báo cáo theo hệ thống phân cấp sau (trong dấu “>” có nghĩa “áp đảo”): Đối với Lfx, Am, Km, Cm: Phát tính kháng > Suy kháng > Không phát kháng Đối với Mfx: Phát đột biến liên quan đến tăng MIC mức độ cao > Phát dột biến liên quan đến tăng MIC nồng độ thấp > Suy đột biến liên quan đến tăng MIC nồng độ thấp >Không phát kháng 33 Phụ lục Sự thay đổi nucleotide cụ thể phát bới mẫu dò MUT Lưu ý số thay đổi axit amin (AA) xác định xét nghiệm LPA hàng hàng thay đổi nucleotide không xác định cụ thể mẫu dò MUT Chẳng hạn, đột biến gyrA A90V gây thay đổi nucleotide (i) gcg> gtg (ii) gcg> gtc Tuy nhiên, có thay đổi nucleotide trước (gcg> gtg) nhận mẫu dò gyrA MUT1, thay đổi sau (gcg> gtc) phát khơng có gyrA WT2 (tức gyrA WT2 khơng phát hiện) Mẫu dò rpoB MUT Mẫu dò katG MUT Mẫu dò gyrA MUT Mẫu dò gyrB MUT Mẫu dò MUT Thay đổi AA MUT1 D516V (D435V) Thay đổi Nucleotide gac>gtc MUT2A H526Y (H445Y) cac> tac MUT2B H526D (H445D) cac> gac MUT3 S531L (S450L) tcg>ttg Mẫu dò MUT Thay đổi AA Thay đổi Nucleotide MUT1 S315T agc>acc MUT2 S315T agc>aca Mẫu dò MUT Thay đổi AA MUT1 A90V Thay đổi Nucleotide gcg>gtg MUT2 S91P tcg>ccg MUT3A D94A gac>gcc MUT3B D94N gac>aac MUT3B D94Y gac>tac MUT3C D94G gac>ggc MUT3D D94H gac>cac Mẫu dò MUT Thay đổi AA Thay đổi Nucleotide MUT1 N538D (N499D) aac>gac MUT2 E540V (E501V) gaa>gta 34 www.stoptb.org/wg/gli .. .Xét nghiệm LPA phát tính kháng thuốc vi khuẩn lao Hướng dẫn phiên giải báo cáo kết dành cho xét nghiệm vi? ?n bác sĩ lâm sàng Nội dung Các từ vi? ??t tắt v Các thuật ngữ vi Lời cảm ơn vii Đôi... hướng dẫn cho xét nghiệm vi? ?n bác sĩ điều trị vi? ??c phiên giải kết kỹ thuật LPA X T NGHIỆM LPA PHÁT HIỆN TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN LAO hàng hàng 2, để hiểu rõ quản lý tốt trường hợp bất đồng kết. .. nằm giới hạn phát hiện) , nên báo cáo kết “ Phát tính kháng? ?? “ Khơng phát tính kháng? ?? thích hợp Sự khác biệt kiểu kháng “ Phát tính kháng? ?? “Suy có tính kháng? ?? Thuật ngữ “Suy có tính kháng? ?? sử dụng