Phân lập, định danh và xác định khả năng chống tế bào ung thư của nấm thượng hoàng

ĐẠI HỌC THÁI NGUN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM HỒNG VĂN HƯNG “PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỐNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA NẤM THƯỢNG HOÀNG ” LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên, 2022 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HOÀNG VĂN HƯNG “PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỐNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA NẤM THƯỢNG HỒNG ” Ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số ngành: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Mạnh Tuấn TS Nguyễn Xuân Vũ Thái Nguyên, 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng: Số liệu kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực chưa sử dụng cơng bố cơng trình khác Mọi giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Hoàng Văn Hưng ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô Khoa Công Nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm thuộc trường Đại Học Nông Lâm Thái Ngun tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu để hồn thành luận văn tốt nghiệp Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Mạnh Tuấn TS Nguyễn Xuân Vũ dành nhiều thời gian, tâm huyết, trực tiếp hướng dẫn tận tình tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực nghiên cứu đề tài hoàn thiện luận văn Thạc sĩ Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè động viên, khích lệ, chia sẻ, giúp đỡ, đồng hành tơi q trình học tập, nghiên cứu Trong trình học tập ngiên cứu khó tránh khỏi thiếu sót Do đó, tơi mong nhận đóng góp ý kiến thầy để luận văn hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng Tác giả luận văn Hoàng Văn Hưng năm 2022 iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu 3 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Trong nước 1.1.1 Đặc điểm tự nhiên đa dạng sinh học vùng miền núi phía Bắc 1.1.2 Tổng quan nghiên cứu nấm Thượng Hoàng 1.1.3 Tình hình nguồn cung cấp nhu cầu nấm Thượng Hoàng 1.2 Ngoài nước 10 1.2.1 Phân bố, phân loại hình thái nấm Thượng Hồng tự nhiên 10 1.2.2 Tóm lược lịch sử sử dụng nấm Thượng Hoàng 11 1.2.3 Hoạt chất dược liệu nấm Thượng Hoàng 12 1.2.4 Ứng dụng nấm Thượng Hoàng Y – Dược 17 1.2.5 Tính an tồn nấm Thượng Hoàng 24 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 25 2.2 Nội dung nghiên cứu 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Phương pháp điều tra phân bố, thu thập nguồn gen nấm Thượng Hoàng tự nhiên 26 iv 2.2.2 Phương pháp phân lập, lưu giữ nguồn gen nấm Thượng Hoàng 27 2.2.3 Lưu giữ nguồn gen nấm Thượng Hoàng phân lập 28 2.2.4 Định danh, phân loại chủng nấm Thượng Hoàng thu thập được: 28 2.2.5 Phương pháp xác định hoạt chất chống ung thư nấm Thượng Hoàng 29 2.2.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư dịch chiết hoạt chất sinh học tổng số từ nấm Thượng Hoàng in vitro 30 2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu 31 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Kết điều tra phân bố, thu thập, quy trình phân lập lưu giữ nguồn gen nấm Thượng Hoàng khu rừng tự nhiên vùng núi phía Bắc 32 3.1.1 Thu thập nguồn gen nấm Thượng Hoàng 32 3.1.2 Phân lập nguồn gen nấm Thượng Hoàng từ thể 38 3.1.3 Định danh, phân loại chủng nấm Thượng Hoàng thu thập 40 3.2 Xác định hoạt chất chống ung thư nấm Thượng Hoàng 46 3.3 Đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư dịch chiết hoạt chất sinh học tổng số từ nấm Thượng Hoàng 48 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 4.1 Kết luận 50 4.2 Kiến nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CÔNG BỐ PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Bảng tổng hợp hoạt chất sinh học tách chiết từ nấm Thượng Hoàng (Phellinus spp.) 13 Bảng 3.1 Phân bố đặc điểm hình thái thể nấm Thượng Hồng thu thập 36 Bảng 3.2 Hiệu phương pháp khử trùng mẫu đến phân lập hệ sợi nấm Thượng Hoàng từ thể 38 Bảng 3.3 So sánh trình tự vùng gen ITS chủng phân lập với liệu công bố GenBank 42 Bảng 3.4 Hàm lượng hoạt chất polysaccharide hispidin thể nấm Thượng Hoàng 46 Bảng 3.5 Hoạt tính chống ưng thư hoạt chất sinh học tổng số tách chiết từ nấm Thượng Hoàng 48 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 Đặc điểm hình thái nấm Thượng Hoàng thu thập 37 Hình 3.2 Đặc điểm hình thái khuẩn ty chủng nấm Thượng Hồng mơi trường PDA, ngày, 25oC 40 Hình 3.3 Điện di DNA tổng số (A) sản phẩm PCR trình tự gen ITS (B) M: marker 1kb; 1: NTH-PR1; 2: NTH-PR2; 3: NTH-PL3 4: NTH-PL4 41 Hình 3.4 Sơ đồ phả hệ chủng nấm Thượng Hồng dựa trình tự vùng gen ITS với liệu công bố GenBank 45 Hình 3.5 Hàm lượng polysaccharide (a) hispidin (b) có thể nấm Thượng Hồng thu thập tự nhiên 47 DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Từ, thuật ngữ viết tắt CAT Catalase Nghĩa đầy đủ từ, thuật ngữ Cs Cộng CT Công thức CV Coeficient of Variation – Hệ số biến động ĐC Đối chứng IC50 Nồng độ ức chế 50% dòng tế bào khảo sát ITS Internal transcribed spacer KTST Kích thích sinh trưởng LSD Least Singnificant Difference Test MDA Malondialdehyde MT Mơi trường NTH Nấm Thượng Hồng PDA Potato Dextrose Agar SOD Superoxide dismutase MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Ung thư nguyên nhân hàng đầu gây tử vong toàn giới Theo báo cáo Tổ Y tế Thế giới (2018) có khoảng gần triệu người chết nguyên nhân bệnh ung thư, có khoảng 70% trường hợp tử vong xảy nước chậm phát triển phát triển Cùng với yếu tố di truyền yếu tố ngoại cảnh (như tia cực tím từ ánh sáng mặt trời, hóa chất bảo vệ thực vật, loại hc mơn, khí thải rác thải cơng nghiệp,….) biết đến tác nhân quan trọng để “kích hoạt” bệnh ung thư bùng phát Theo dự đoán Viện nghiên cứu ung thư giới (https://www.cancer.gov/) số lượng người bị bệnh ung thư có xu hướng tăng mạnh, lên đến khoảng 23.6 triệu người đến năm 2030 Nước ta có tỷ lệ mắc bệnh ung thư tương đối cao, có khoảng 300.000 người sống chung với ung thư hàng năm, số người bị ung thư gan chiếm cao (15,4%), ung thư phổi chiếm 14,4%, ung thư dày khoảng 10,6%, ung thư vú chiếm 9,2%, ung thư đại trực tràng khoảng 8,9% ung thư khác (https://pharmed.vn) Các loại thuốc/hóa chất giải pháp hiệu để điều trị bệnh ung thư phát Tuy nhiên, loại thuốc/hóa chất điều trị ung thư tốn kém, dễ gây tác dụng phụ biến chứng trình điều trị Do đó, phát triển loại hoạt chất sinh học tự nhiên, có hiệu quả, tác dụng phụ, tốn để phòng điều trị ung thư yêu cầu cấp bách, đặt cho nhà khoa học quản lý Nấm Thượng Hoàng (Phellinus; danh pháp khoa học đồng nghĩa: Tropicoporus Inonotus Polyporus Sanghuangporus) phân loại lại thuộc ngành Basidiomycota, lớp Agaricomycetes, Hymenochaetales, họ Hymenochaetaceae Nấm Thượng Hồng tìm thấy số nước thuộc vùng nhiệt đới cận nhiệt đới (Chen cs, 54 17 Gorka K., Piekarska-Stachowiak A., Stala A., Miran D., Sokol S (2017) Comparison of the mycelial growth of some Phellinus spp isolates on different agar media Fragmenta Nature 50:18-27 18 Huo J cs (2020) Whole-genome sequence of Phellinus gilvus (mulberry Sanghuang) reveals its unique medicinal values Journal of Advanced Research 24:325-335 19 Ikekawa T, Nakanishi M, Uehara N, Chihara G, Fukuoka F (1968) Antitumor action of some basidiomycetes, especially Phellinus linteus Gann 59:155-157 20 Lõhmus l (2015) Habitat indicators for cavity-nesters: The polypore Phellinus pini in pine forests Ecological Indicators 66:275-280 21 Ota K cs (2017) Phellilane L, Sesquiterpene Metabolite of Phellinus Linteus: Isolation, Structure Elucidation, and Asymmetric Total Synthesis J Org Chem 82:12377-12385 22 Tomšovský M., Vampola P., Sedlák P., Byrtusová Z., Jankovský L (2010) Delimitation of central and northern European species of the Phellinus igniarius group (Basidiomycota, Hymenochaetales) based on analysis of ITS and translation elongation factor alpha DNA sequences Mycological Progress 9:431–445 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ Hồng Văn Hưng, Đỗ Bích Duệ, Đỗ Thị Hiền, Nguyễn Mạnh Tuấn (2022) Đặc điểm hình thái ni cấy nấm Thượng Hồng (Phellinus spp.) thu thập tỉnh miền núi phía Bắc, Việt Nam TNU Journal of Science and Technology 227(05): 170 – 177, http://jst.tnu.edu.vn/jst/article/view/5074 Nguyễn Mạnh Tuấn, Hồng Văn Hưng (2021) Quy trình ni trồng nhân tạo nấm Thượng Hoàng (Tropicoporus linteus NTH-PL4) sử dụng mùn cưa keo (Được chấp nhận đơn theo Quyết định số 21226w/QĐ-SHTT ngày 24 tháng 12 năm 2021 Cục Sở hữu Trí tuệ PHỤ LỤC >Trình tự gen ITS NTH-PL3 (MW757263) gtcgtaacaa ggtttccgta ggtgaacctg cggaaggatc attatcgagt tttgaaagcg 61 agacctgctg ctggtgcgaa atcgcgcatg tgcacggtct tcgcgctcaa atccaactca 121 aacccctgtg caccttatat atcgcgagtc gaagttagta gcctgaggtc ttgtaagtaa 181 tcagtagaag ggcgaaagcg agtcttgctc gttaggtagc ctttcgaaaa tgaaagcgag 241 tgcgtcgggt gaagacttcg gcttgtcgtt acaaaacacc ttatattgtc tttgtgaatg 301 taatgctcct tgtgggcgaa aataaataca actttcaaca acggatctct tggctctcgc 361 atcgatgaag aaagcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca 421 tcgaatcttt gaacgcacct tgcgcccctt ggtattccga ggggcatgcc tgtttgagtg 481 tcatgtttat ctcaaaccgc tcgtctttct taattgaagg gcttgaggtt tggacttgga 541 ggtttactgc tggcgccttt cgaggggtcg gctcctctta aatacattag ctgggctttg 601 gctcgcgttt acggtgtaat agttgattcc attcaccaac gagcgcttgc ctgacgagct 661 tgcttctagc cgtccgcgtc gtcggacaag gagtcacctc cttcttgaca cctttgacct 721 caaatcaggt aggattaccc gccgaactta agcatatcaa taagcg >Trình tự gen ITS NTH-PL4 (MW757264) ggtttccgta ggtgaacctg cggaaggatc attatcgagt tttgaaagcg agacctgctg 61 ctggtgcgaa atcgcgcatg tgcacggtct tcgcgctcaa atccaactca aacccctgtg 121 caccttatat atcgcgagtc gaagttagta gcctgaggtc ttgtaagtaa tcagtagaag 181 ggcgaaagcg agtcttgctc gttaggtagc ctttcgaaaa tgaaagcgag tgcgtccggt 241 gaagacttcg gcttgtcgtt acaaaacacc ttatattgtc tttgtgaatg taatgctcct 301 tgtgggcgaa aataaataca actttcaaca acggatctct tggctctcgc atcgatgaag 361 aaagcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt 421 gaacgcacct tgcgcccctt ggtattccga ggggcatgcc tgtttgagtg tcatgtttat 481 ctcaaaccgc tcgtctttct taattgaagg gcttgaggtt tggacttgga ggtttactgc 541 tggcgccttt cgaggggtcg gctcctctta aatacattag ctgggctttg gctcgcgttt 601 acggtgtaat agttgattcc attcaccaac gagcgcttgc ctgacgagct tgcttctagc 661 cgtccgcgtc gtcggacaag gagtcacctc cttcttgaca cctttgacct caaatcaggt 721 aggattaccc gccgaactta agcatatcaa taagc >Trình tự gen chủng NTH-PR1 (MW757261) ggaaggacat taacgaactt gaaatcggga gtctgttgct ggtgcggaaa cgtacatcgt 61 gcacggcttc tgtgttcaat tcaacccctg tgcacctcat cgaagccggt agtcccttta 121 tcttcttcgt tttgccggtc gcgtgcggtg cggatcgcga gtagcgagta aggcgaacgc 181 aactccggtt gtcagtagct tgaaaccgaa agtggtctgc cttcacgttc ggccggcgag 241 aggggggaga ggtcgagggt cgaaagcttt gacttgctat taaacgcttt gtatgtcttg 301 tggaatgtat tagctccttc gtgggcgaaa taaatacaac tttcaacaac ggatctcttg 361 gctctcgcat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt gcagaattca 421 gtgaatcatc gaatctttga acgcaccttg cgccccttgg tattccgagg ggcatgcctg 481 tttgagtgtc atgttaatct caaacccctt gtctttgttg actcggtcgg tttggacttg 541 gaggcgttgc cggcgtgctt gcgcgcgtcg gctcctctta aatgcattag ctaggctttg 601 gttcgcatcg acggtgtaat agtaaagtgt tcgccggggt gcctgcctaa aggagtctgc 661 ttccaatcgt cttcggacaa ggtctttgac ctttgcatat atcttgacct ttgacctcaa 721 atcaggtagg actacccgcc gaacttaagc at >Trình tự gen chủng NTH-PR2 (MW757262) attaacgaac ttgaaatcgg gagtctgttg ctggtgcgga aacgtacatc gtgcacggct 61 tctgtgttca attcaacccc tgtgcacctc atcgaagccg gtagtccctt tatcttcttc 121 gttttgccgg tcgcgtgcgg tgcggatcgc gagtagcgag taaggcgaac gcaactccgg 181 ttgtcagtag cttgaaaccg aaagtggtct gccttcacgt tcggccggcg agagggggga 241 gaggtcgagg gtcgaaagct ttgacttgct attaaacgct ttgtatgtct tgtggaatgt 301 attagctcct tcgtgggcga aataaataca actttcaaca acggatctct tggctctcgc 361 atcgatgaag aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca 421 tcgaatcttt gaacgcacct tgcgcccctt ggtattccga ggggcatgcc tgtttgagtg 481 tcatgttaat ctcaaacccc ttgtctttgt tgactcggtc ggtttggact tggaggcgtt 541 gccggcgtgc ttgcgcgcgt cggctcctct taaatgcatt agctaggctt tggttcgcat 601 cgacggtgta atagtaaagt gttcgccggg gtgcctgcct aaaggagtct gcttccaatc 661 gtcttcggac aaggtctttg acctttgcat atatcttgac ctttgacctc aaatcaggta 721 ggactacccg ccgaacttaa PHỤC LỤC XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HISPIDIN CĨ TRONG QUẢ THỂ NẤM THƯỢNG HỒNG BẰNG HPLC PHỤ LỤC XỬ LÝ SỐ LIỆU 2.1 Hàm lượng polysaccharide Ký hiệu nấm Lần Lần Kết Lần trung bình (%) NTH-PR1 1,106 1,124 1,141 1,12 0,018 NTH-PR2 1,1808 1,1684 1,179 1,18 0,007 NTH-PL3 1,1862 1,1905 1,179 1,19 0,006 NTH-PL4 1,2201 1,2075 1,216 1,21 0,006 * So sánh NTH-PR1 NTH-PR2 t-Test: Paired Two Sample for Means Mean Variance Observations Pearson Correlation Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T