CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.5. Phương pháp khảo sát khả năng đối kháng nấm bệnh của các chủng
(in vitro)
Hình 2.2 Sơ đồ khảo sát khả năng đối kháng nấm của chủng LAB (in vitro)
Thí nghiệm được thực hiện nhằm xác định khả năng kháng nấm gây bệnh đốm nâu của vi khuẩn lactic.
Chủng vi khuẩn lactic được tăng sinh trong môi trường MRS broth ở nhiệt độ phòng và lắc trong 24 giờ.
Tiến hành khảo sát khả năng kháng nấm. - Môi trường khảo sát sử dụng là PSA
- Chủng nấm N6, N35 được đục từ môi trường PDA đã cấy trước đó 5 ngày và đặt vào tâm đĩa.
- Dùng que cấy ria 2 đường song song, cách đĩa 1,5 cm. Ở 37°C trong 72 giờ. Sau đó đo đường kính nấm và tính tỉ lệ kháng nấm.
Cơng thức tính tỉ lệ kháng nấm được tính theo W.S.Abbott.
Tỉ lệ kháng nấm (%)= [(Dđối chứng - Dthí nghiệm)/ Dđối chứng] x 100% Trong đó Dđối chứng : Đường kính vịng nấm đĩa đối chứng (mm)
41
2.4.6. Phương pháp khảo sát khả năng đối kháng nấm bệnh của các chủng LAB (in vivo) (in vivo)
Tiến hành thí nghiệm với mật độ tế bào vi khuẩn lactic 106, 107, 108, 109 (cfu/ml) để khảo sát mật độ khuẩn có khả năng kháng nấm hiệu quả, đối chứng âm là huyền phù bào tử nấm, đối chứng dương là huyền phù nấm với thuốc BEAM 75W.
Tiến hành:
- Pha BEAM 75W theo hướng dẫn sử dụng chuẩn là 10g thuốc với 16 lít nước. Làm thí nghiệm đối chứng dương cần khoảng 100ml (Cân 0,0625 g thuốc và 100ml nước).
- Lựa chọn những lá lúa khỏe, xanh tốt, khơng có dấu vết bệnh đem cắt thành từng đoạn 6 cm, rửa sạch qua nước, sau đó đem nhúng trong cồn 70° trong 15 - 20 giây, sau đó nhúng qua nước cất đã hấp tiệt trùng, cho vào đĩa petri có lót giấy lọc. Sau đó tạo vết thương bằng kim vơ trùng đâm trên bề mặt lá lúa.
Đối chứng âm (-): Sau khi tạo vết thương trên lá 1 điểm dùng que cấy thẳng nhúng bào tử tăng sinh trong môi trường PDB cấy vào vết thương.
Đối chứng dương (+): Sau khi tạo vết thương trên lá 1 điểm dùng que cấy thẳng nhúng bào tử tăng sinh trong mơi trường PDB cấy vào vết thương sau đó nhỏ 80 µl dung dịch thuốc BEAM 75W đã pha.
- Thí nghiệm nhiễm nấm trước: Cấy bào tử nấm tăng sinh trên môi trường PDB bằng que cấy thẳng vào vết thương chờ 10 giây sau đó nhỏ 80 µl huyền phù vi khuẩn ở nồng độ đã khảo sát bằng eppendorf.
- Thí nghiệm nhiễm nấm sau: Nhỏ 80 µl huyền phù vi khuẩn ở nồng độ đã khảo sát chờ 2 – 3 phút sau đó dùng que cấy thẳng cấy dịch bào tử nấm tăng sinh trên môi trường PDB lên vị trí tạo vết thương lúc đầu.
Mẫu đối chứng: Lá lúa khỏe và nước cất.
42