CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp phân lập nấm bệnh đốm nâu trên cây lúa
2.4.1.1. Thu, chọn mẫu bệnh
Các mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh được thu nhận vào sáng ngày 30/11/2019 tại tỉnh Long An.
Đặc điểm vết bệnh trên lá: trên lá có các dấu hiện của các bệnh lý do nấm gây ra như các vết bệnh nhỏ màu nâu đen, các đốm lớn màu nâu có tâm màu xám.
Mẫu được giữ trong túi PE, được dán nhãn, ở nhiệt độ thường và mang đến phịng thí nghiệm trong ngày để phân lập nấm gây bệnh.
2.4.1.2. Phân lập nấm
Nấm được phân lập và làm thuần tại phịng thí nghiệm trường Đại Học Cơng Nghệ Tp. Hồ Chí Minh quận 9.
Chuẩn bị môi trường WA bổ sung Chloramphenicol và môi trường PDA bổ sung Chloramphenicol, đem đi đo pH = 5,6 rồi đem đi hấp tiệt trùng 121oC/ 1 atm/ 20 phút. Đổ môi trường 1/3 đĩa petri đã hấp khử trùng để nguội.
+ Bước 1: Mẫu bệnh được cắt thành từng đoạn nhỏ 1 - 2 x 1 - 2 mm rồi được khử trùng bằng cồn 70o, ngâm 15 giây trong cồn 70°, sau đó rửa bằng nước cất vơ trùng 3 - 4 lần. Lấy ra bỏ vào đĩa petri có giấy lọc để lá được khơ.
+ Bước 2: Mẫu lá được đặt vào đĩa thạch môi trường WA (bổ sung kháng sinh chloramphenicol).
+ Bước 3: Quan sát từng ngày để chọn lọc tơ nấm không bị nhiễm chồng lên nhau. + Bước 4: Dùng que cấy ria chọn sợi nấm chưa bị nhiễm chồng cấy sang đĩa chứa môi trường PDA.
+ Bước 5: Các đĩa phân lập được ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 ngày để nấm phát triển, kích thích sự hình thành bào tử nấm.
+ Bước 4: Theo dõi sự phát triển của hệ sợi nấm trên môi trường và tiến hành cấy chuyền trên môi trường PDA để làm thuần. Kiểm tra tính thuần và giữ giống trong mơi trường PDA thạch nghiêng 4°C.
37
2.4.1.3. Phương pháp phòng ẩm và quan sát bào tử nấm
Phương pháp phòng ẩm dùng để nghiên cứu sự sắp xếp của tế bào một cách tự nhiên trong khuẩn lạc như hình dạng cuống sinh bào tử, chuỗi bào tử của nấm. Bào tử của nấm khi sinh trưởng sẽ lan sang mép lame.
Chuẩn bị dụng cụ: Lame, lamelle, đĩa petri có lót giấy lọc (hấp khử trùng 121oC/ 1 atm/ 20 phút), que cấy vịng, đèn cồn. Mơi trường PDA và nước cất, hấp khử trùng 121oC/ 1 atm/ 20 phút.
+ Bước 1: chuẩn bị đĩa petri đổ môi trường PDA vào đĩa, để khô, dùng thước kẻ ô vuông 1 x 1 cm. Dùng dao cắt nhỏ từng miếng thạch. Di chuyển từng miếng thạch cho vào đĩa lame rồi đậy nắp lại. Các thao tác này đều phải trong điều kiện vô trùng.
+ Bước 2: Dùng que cấy vòng ria bào tử nấm lên lame, đậy lamelle lại.
+ Bước 3: Nhỏ nước cất vô trùng sao cho thấm đều giấy lọc, đậy nắp đĩa petri lại, quấn parafin. Ủ ở nhiệt độ phòng từ 3 - 5 ngày.
+ Bước 4: Quan sát bảo tử nấm dưới kính hiển vi quang học.
2.4.1.4. Phương pháp bảo quản chủng nấm
Phương pháp cấy chuyền (Bảo quản trong ống thạch nghiêng)
Phương pháp này giống có thời gian sống, thơng thường giống được bảo quản từ 3 - 6 tháng.
+ Bước 1: Chuẩn bị ống thạch nghiêng chứa môi trường PDA bổ sung chloramphenicol được hấp khử trùng .
+ Bước 2: Dùng que đục lỗ mẫu thạch chứa sợi nấm từ đĩa nấm đã thuần,rồi dùng dao di chuyển sang ống thạch nghiêng có chứa mơi trường PDA.
+ Bước 3: Đậy nắp, quấn parafin, ghi chú tên mẫu và ngày cấy giữ giống. + Bước 4: Bảo quản mẫu ở ngăn mát tủ lạnh 4oC.
Bảo quản nấm sợi bằng phương pháp lạnh sâu -80℃ Chuẩn bị:
- Chuẩn bị dung dịch glycerol 20% khử trùng ở 121oC trong 15 phút. - Chuẩn bị mẫu nấm sợi trên mơi trường thạch đĩa có lượng bào tử lớn.
38
+ Bước 1: Dùng micropipet hút khoảng 1 ml glycerol đã vô trùng vào eppendorf 1,5 ml.
+ Bước 2: Dùng dao vô trùng cắt lấy 1 miếng nhỏ môi trường chứa cả sợi và bào tử nấm sợi cho vào ống nhựa. Lượng glycerol đủ để phủ lên miếng thạch mẫu, đậy nút và quấn parafin sau đó dán nhãn.
+ Bước 3: Mẫu trước tiên phải để ở 5oC (tạo điều kiện cho glycerol đi vào tế bào), sau đó được làm lạnh sâu tử 25oC xuống -55oC với tốc độ -1°C/phút. Trong trường hợp khơng có thiết bị làm lạnh thì có thể để -20oC trong 3 giờ, sau đó chuyển sang - 80oC [16] .