63
Đối với mẫu thí nghiệm được phun dịch bào tử N35 sau 4 ngày, ở nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm thích hợp, quan sát thấy trên lá xuất hiện vài vị trí đốm nâu nhỏ xung quanh các đốm nâu chuyển dần từ xanh sang vàng (Hình 3.19.B). Vết bệnh tương tự như vết bệnh đã quan sát được trước khi tiến hành phân lập. Chủng N35 có khả năng gây bệnh khi thí nghiệm gây nhiễm vào lá lúa.
Tiếp đến tiến hành phân lập lại từ lá lúa có vết bệnh từ mẫu thí nghiệm ở đĩa hình 3.19.B
Mẫu nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA có bổ sung chloramphenicol trong vòng 5 ngày, ở nhiệt độ thường. Tơ nấm có màu đen xám và mịn như nhung (Hình 3.25 A). Cuống bào tử thẳng, sợi lớn. Bào tử màu đen hơi cong và có 3 vách ngăn, phân đốt (Hình 3.25 C, vật kính 100X). Giống với hình thái đã quan sát được của chủng N35. Mẫu nấm chủng N35 đã phân lập được từ lá lúa nhiễm bệnh ở Long An được định danh là loài Curvularia lunata có khả năng gây bệnh đốm nâu trên lá lúa. Thí nghiệm tái nhiễm theo quy tắc Koch thành cơng.
3.4. Kết quả so sánh trình tự ITS với ngân hàng gene
Hai chủng N6 và N35 có hình thái bào tử giống bào tử nấm thuộc chi Curvularia được gửi đi giải trình tự gene vùng ITS và một phần tiểu đơn vị lớn của gene rRNA được trình tự N6 dài 529 bp và N35 trình tự 977 bp (xem phụ lục C.1 và phụ lục C.2). So sánh trên Genbank và so sánh với nhau cho thấy chủng N35 tương đồng 100% với
Cochliobolus lunatus culture-collection NRRL:53719 và tương đồng 99,82% với Curvularia lunata strain UPM1189. Tuy nhiên N35 chỉ tương đồng N6 là 94,78%
và Curvularia geniculata strain UPM1190 94,93%.
Bảng 3.9 Tỉ lệ tương đồng N35 với N6 và một số chủng gây bệnh đốm nâu trên lúa
(Blast NCBI)
Mã số truy cập genbank và tên chủng E value
Tỉ lệ tương đồng (%)
GQ328851_Cochliobolus lunatus culture-
collection NRRL:53719 0 100
64
JQ360963_Curvularia fallax isolate HNHY001 0 96.85 KP340063_Curvularia hawaiiensis strain UPM1242 0 96.5 KP340067_Curvularia aeria strain UPM1298 0 96.86 KP340049_Curvularia eragrostidis strain UPM902 0 92.55
N6 0 94.78
KP340055_Curvularia geniculata strain
UPM1190 0 94.93
KP340074_Bipolaris sorokiniana strain UPM1275 0 90.33
Từ đó các N6, N35 được so sánh với một số chủng trong chi Curvularia bằng
phần mềm MEGA X, xây dựng cây phát sinh lồi và tìm khoảng cách di truyền giữa các chủng. Kết quả cho thấy trên bảng 3.10, hình 3.20 và hình 3.21 là
Chủng N35 có khỏang cách di truyền bằng 0 với Cochliobolus lunatus culture-collection NRRL:53719 và có khoảng cách di truyền bằng 0,0018 với
Curvularia lunata strain UPM1189, Cochliobolus lunatus và Curvularia lunata là
hai tên chỉ cùng loài, tên đầu chỉ trạng thái telemorph hữu tính, tên sau chỉ trạng thái anamorph vơ tính, vì vậy có thể định danh chủng nấm N35 là Curvularia lunata.
Chủng N6 có khoảng cách di truyền gần nhất với Curvularia geniculata strain
UPM1190 (0,0082), cách xa so với Curvularia lunata (0,05). Từ đó có thể đề nghị
tên cho N6 là Curvularia geniculata.
- Chủng nấm N35 có mối quan hệ gần nhất với lồi Cochliobolus lunatus có tỉ
65
Hình 3.21 Cây phát sinh loài một số chủng nấm gây bệnh đốm nâu cây lúa, xây dựng
bằng phương pháp NJ, bootstrap 1000, MEGA X
So sánh với các đặc điểm hình thái hai lồi trong tài liệu, Curvularia lunata có khuẩn lạc màu xám trên mơi trường CMX và có mặt sau màu đen. Tốc độ tăng trưởng của Curvularia lunata là 3,61 ± 0,3 cm/ngày. Bào tử có dạng hình thoi, hơi cong và có 3 vách ngăn. Cả hai đầu hơi thn nhọn. Kích thước của bào tử khoảng từ 17,75 – 23,29 µm x 6,25 – 8,75 µm. C. lunata là nấm gây bệnh trên lúa và gây thiệt hại lớn cho ngành nông nghiệp Châu Á và Châu Phi [14].
66
A1,A2 A3. Bào tử chủng N35 phân lập được dưới vật kính 100X
B. Hình thái khuẩn lạc và bào C.lunata tử trích dẫn từ bài nghiên cứu của tác giả
Nazionale dei Lincei 2015
C. Hình dạng bào tử C.lunata trên Mycobank
(http://www.mycobank.org/mb/269889)
- Chủng nấm N6 có mối quan hệ gần nhất với Curvularia geniculata strain UPM1190. Dựa vào kết quả so sánh trình tự gene và so sánh kết quả đặc điểm hình thái (Hình 3.19)
Ta thấy bào tử nấm gửi đi định danh có dạng elip màu nâu sẫm, có 3 – 4 vách ngăn. Cuống sinh bào tử thn dài mảnh. Sợi nấm có vách ngăn và các đốt thấy rõ. Giống với hình thái bào tử đã công bố trên Mycobank và bài của tác giả Nazionale dei Lincei 2015. Vì vậy có thể khẳng định rằng chủng nấm N6 là loài Curvularia
geniculata.
A1 A2 A3
C B