CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.3. Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo
Thử nghiệm về khả năng lây bệnh nhân tạo được tiến hành để xác nhận lại nguyên nhân gây bệnh. Bệnh được tái tạo bằng cách cấy tác nhân gây bệnh lên bề mặt cây trồng theo cơ chế xâm nhiễm của tác nhân đó, hoặc bằng cách đưa mầm bệnh trực tiếp vào cây. Để thực hiện quá trình lây bệnh nhân tạo, các loài cây mẫn cảm được trồng trong các điều kiện có kiểm sốt và được cấy vi sinh vật nghi là gây bệnh.
Chuẩn bị dịch bào tử
Dịch bào tử được thu nhận từ mẫu nấm cần lây bệnh được tăng sinh trên môi trường PDB. Tăng sinh đến khi có bào tử nấm
Lây bệnh trên lá
Do nấm được phân lập từ mẫu lá lúa bị bệnh cho nên tái nhiễm lên lá lúa.
– Lựa chọn các lá lúa khỏe mạnh, khơng có dấu hiệu của vết bệnh rồi cắt thành từng đoạn 6 cm rửa dưới vòi nước sạch, nhúng các lá lúa đã cắt vào cồn 70° trong 15 - 20 giây, sau đó rửa qua nước cất vơ trùng 2 lần, rồi đem cho vào đĩa có giấy lọc đã hấp vô trùng.
39
– Tạo vết thương trên lá bằng kim vô trùng, rồi dùng que cấy thẳng nhúng dịch huyền phù bào tử nấm lên lá tại chỗ vết thương. Hút 300 µl nước đã hấp khử trùng bỏ vào giấy lọc, giúp lá còn tươi trong thời gian quan sát
– Mẫu đối chứng lá chỉ phun nước cất (khơng có dịch bào tử) – Quấn parafin tất cả các đĩa, ghi chú chi tiết.
– Nuôi ở nhiệt độ phịng dưới bóng tối để bào tử nấm xâm nhập vào cây. – Kiểm tra và so sánh những lá cây được lây bệnh với lá cây đối chứng
Quan sát và ghi nhận các triệu chứng và so sánh những triệu chứng này so với các triệu chứng đã quan sát được ở mẫu lá bệnh phân lập ban đầu.
Phân lập lại nấm sau khi tái nhiễm
Việc phân lập lại được thực hiện từ lá đã được nhỏ dịch bào tử nấm để lây bệnh. Các bước phân lập giống như đã mô tả ở mục 2.4.1