Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lên men LACTIC từ rễ cây lúa hỗ trợ tăng trưởng cây trồng và kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên cây lúa (ORYZA SATIVA)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC TỪ RỄ CÂY LÚA HỖ TRỢ TĂNG TRƢỞNG CÂY TRỒNG VÀ KHÁNG NẤM GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA (ORYZA SATIVA) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiện: Hồ Thị Dưỡng MSSV: 1611100273 Lớp: 16DSHA1 Trần Quang MSSV: 1611100041 Lớp: 16DSHA2 TP Hồ Chí Minh, 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC TỪ RỄ CÂY LÚA HỖ TRỢ TĂNG TRƢỞNG CÂY TRỒNG VÀ KHÁNG NẤM GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA (ORYZA SATIVA) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiện: Hồ Thị Dưỡng MSSV: 1611100273 Lớp: 16DSHA1 Trần Quang MSSV: 1611100041 Lớp: 16DSHA2 TP Hồ Chí Minh, 2020 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Người thực đề tài xin cam đoan: Đồ án cơng trình nghiên cứu thực nhóm thực hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Hoài Hương Các số liệu thu thập phân tích đề tài trung thực, nghiêm túc không trùng lặp với đề tài nghiên cứu Những thơng tin tham khảo trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng Nếu có sai sót chúng tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm Tp HCM, Ngày 30 tháng 09 năm 2020 Sinh viên thực HỒ THỊ DƯỠNG TRẦN QUANG Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi để em học tập hoàn thành tốt khóa học 2016 – 2020 Em xin cảm ơn thầy cô Viện Khoa học Ứng dụng tận tình dạy truyền đạt cho em kiến thức quan trọng tạo tảng kiến thức vững để hồn thành tốt Đồ án sau ứng dụng vào công việc thực tiễn Em xin cảm ơn thầy phụ trách phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học, Viện Khoa học Ứng dụng, Trường Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện tốt giúp cho em thực hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hoài Hương tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt q trình thực để em hồn thành tốt Đồ án tốt nghiệp Và em gửi lời cảm ơn đến bạn khóa tận tình hỗ trợ, giúp đỡ, động viên khích lệ tinh thần, trải qua khó khăn suốt q trình thực Đồ án tốt nghiệp Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, gia đình ln bên cạnh, cổ vũ động viên tinh thần, tạo điều kiện để hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp Tp HCM, Ngày 30 tháng 09 năm 2020 Sinh viên thực HỒ THỊ DƯỠNG TRẦN QUANG Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH v MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Tình hình nghiên cứu 2.1 Ngoài nước 2.2 Trong nước Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Phƣơng pháp luận Phƣơng pháp xử lý số liệu Kết đạt đƣợc Kết cấu đồ án CHƢƠNG TỔNG QUAN .5 1.1 Các vi sinh vật khả hỗ trợ tăng trưởng trồng .5 1.1.1 Khả phân giải lân 1.1.2 Khả sinh Indole-3-acetic acid (IAA) 1.1.3 Khả tạo màng sinh học biofilm 1.2 Giới thiệu chung nấm đạo ôn hại lúa 10 1.2.1 Triệu chứng bệnh lúa 10 1.2.2 Nguyên nhân gây bệnh đạo ôn 11 1.2.3 Giới thiệu chung Pyricularia oryzae 13 1.2.4 Cơ chế xâm nhiễm nấm Pyricularia oryzae 15 1.2.5 Biện pháp phịng trị bệnh đạo ơn lúa 18 1.3 Tổng quan vi khuẩn lactic nội sinh 21 1.3.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic nội sinh 21 1.3.2 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn lactic nội sinh .25 i Đồ án tốt nghiệp 1.3.3 Quá trình trao đổi chất 26 1.3.4 Khả sinh hợp chất kháng khuẩn, kháng nấm 29 1.3.5 Ứng dụng vi khuẩn lactic nội sinh .32 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .35 2.1 Địa điểm nghiên cứu 35 2.2 Thời gian thực 35 2.3 Vật liệu nghiên cứu 35 2.3.1 Vật liệu 35 2.3.2 Hóa chất sử dụng 35 2.3.3 Thiết bị 36 2.3.4 Dụng cụ 36 2.4 Phương pháp nghiên cứu .37 2.4.1 Phân lập, khảo sát chủng vi khuẩn lactic nội sinh rễ lúa sống bề mặt rễ lúa .38 2.4.2 Khảo sát hoạt tính sinh học hỗ trợ tăng trưởng trồng chủng phân lập 43 2.4.3 Xác định khả gây bệnh đạo ôn nấm thị sàng lọc hoạt tính kháng nấm in vitro cùa chủng phân lập 47 2.4.4 Tuyển chọn hoạt tính kháng nấm in vivo 49 2.4.5 Ứng dụng chủng tuyển chọn xử lý hạt giống lúa 49 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 52 3.1 Phân lập, khảo sát chủng vi khuẩn lactic nội sinh rễ lúa sống bề mặt rễ lúa .52 3.1.1 Phân lập chủng LAB nội sinh sống bề mặt rễ lúa 52 3.1.2 Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 53 3.2 Khảo sát hoạt tính sinh học hỗ trợ tăng trưởng trồng chủng phân lập 59 3.2.1 Khảo sát khả lên men lactic tăng trưởng sinh khối .60 3.2.2 Khả tổng hợp sinh khối 61 3.2.3 Khảo sát khả phân giải lân 63 3.2.4 Khảo sát khả sinh IAA .65 ii Đồ án tốt nghiệp 3.2.5 Khả tạo màng biofilm 66 3.2.6 Khả sinh enzyme ngoại bào .67 3.3 Xác định khả gây bệnh đạo ôn nấm thị sàng lọc hoạt tính kháng nấm in vitro cùa chủng phân lập 69 3.3.1 Tái nhiễm theo quy tắc Koch .70 3.3.2 Định danh nấm thị phương pháp giải trình tự vùng ITS 72 3.3.3 Khảo sát khả kháng nấm gây bệnh đạo ôn in vitro 74 3.4 Tuyển chọn hoạt tính kháng nấm in vivo 75 3.4.1 Khảo sát khả kháng nấm gây bệnh đạo ôn in vivo chủng RL1T, RL, L5 mật độ 108, 107, 106 (cfu/ml) sau ngày .75 3.4.2 3.5 Định danh chủng tuyển chọn .77 Ứng dụng chủng vi khuẩn lactic hỗ trợ tăng trưởng trồng .79 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 83 4.1 Kết luận 83 4.2 Kiến nghị .84 TÀI LIỆU THAM KHẢO 85 A PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MÔI TRƢỜNG SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM B PHỤ LỤC PHƢƠNG PHÁP .6 C PHỤ LỤC HÌNH ẢNH 15 D PHỤ LỤC XỬ LÝ THỐNG KÊ 28 iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BCP: Bromocresol purple DNA: Deoxyribonucleotide Acid ĐBSCL: Đồng sông Cửu Long EFSA: Cơ quan Tiêu chuẩn Thực phẩm Châu Âu EPSs: Extracellular Polymeric Substance FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations Fw: Forward primer (Mồi ngược) GRAS: Generally Recognized As Safe IAA: Indole Acetic Acid IAM: Indole-3-acetamide IPA: Indole-3-pyruvate ITS: Internal transcribed spacer LAB: Lactic acid bacteria MRS: de Man, Rogosa and Sharpe NA: Nutrient Agar NB: Nutriend broth NMSL: Nước muối sinh lý NSAPs: Non – specific acid phosphatases OD: optical density (Mật độ quang) PGPR: vi khuẩn hỗ trợ tăng trưởng trồng PHL: Post Harvest Losses PSA: Potato Sucrose Agar PSB: Potato Sucrose Broth PSM: Phosphate Solubilizing Microorganisms RNA: Ribonucleic Acid Rv: Reverse primer (Mồi xuôi) SHPT: Sinh học phân tử TCA: Trichloroacetic acid iv Đồ án tốt nghiệp Tm: Melting Tempereture UV: Ultraviolet VK: Vi khuẩn VSV: vi sinh vật WA: Water agar v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại khoa học nấm bệnh đạo ôn 12 Bảng 1.2 Độc tố nấm đạo ôn 15 Bảng 1.3 Các loại thuốc hóa học trừ nấm bệnh đạo ôn 18 Bảng 1.4 Các giống lúa có khả kháng bệnh đạo ôn 20 Bảng 1.5 Cơ chế hoạt động chủng vi khuẩn 21 Bảng 1.6 Phân loại vi khuẩn lên men lactic 23 Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc đĩa thạch quan sát kính hiển vi 54 Bảng 3.2 Hình thái tế bào chủng khảo sát 55 Bảng 3.3 Kết khảo sát khả lên men loại đường 60 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ muối lên % acid tổng số chủng phân lập nuôi cấy môi trường MRS 61 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nồng độ muối lên mật độ chủng phân lập nuôi cấy môi trường MRS (Log(cfu/ml)) 63 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nồng độ muối lên đường kính vịng hịa tan lân vơ khó tan (D – d) chủng phân lập nuôi cấy môi trường Pikovskaya‟s 65 Bảng 3.7 Ảnh hưởng nồng độ muối lên đường kính vịng IAA chủng phân lập nuôi cấy môi trường Trypton water bổ sung cao nấm men 66 Bảng 3.8 Ảnh hưởng nồng độ muối lên khả tạo màng biofilm chủng vi khuẩn phân lập đo OD550nm 67 Bảng 3.9 Ảnh hưởng nồng độ muối lên khả sinh enzyme ngoại bào chủng phân lập 69 Bảng 3.10 Ảnh hưởng nồng độ muối lên tỷ lệ ức chế nấm Pyricularia oryzae (%) 75 Bảng 3.11 Tỷ lệ nảy mầm độ khỏe mầm nghiệm thức (P < 0.05, Duncan test) 82 Bảng 3.12 Chiều cao, cân nặng thân rễ non (P < 0.05, Duncan test) 83 iv Đồ án tốt nghiệp Class Levels Values 0%NaCl 1%NaCl 2%NaCl 3%NaCl 4%NaCl 5%NaCl Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 KHA NANG CHIU MUOI CHUNG RL2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: NDMUOI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 0.30991332 0.06198266 360.53 F NTHUC 0.30991332 0.06198266 360.53 F Model 1.41809456 0.47269819 2711.77 F NTHUC 1.41809456 0.47269819 2711.77 F D.6.6 64 Đồ án tốt nghiệp Model 1.46432743 0.48810914 1983.47 F NTHUC 1.46432743 0.48810914 1983.47 F Model 1.28549081 0.42849694 315.71 F NTHUC 1.28549081 0.42849694 315.71 F Model 307.6972469 102.5657490 22.44 0.0003 Error 36.5604873 4.5700609 Corrected Total 11 344.2577341 R-Square Coeff Var Root MSE DKN Mean 0.893799 13.33579 2.137770 16.03032 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NTHUC 307.6972469 102.5657490 22.44 0.0003 TY LE KHANG NAM DOI CHUNG DUONG BEAM 75W The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for DKN 67 Đồ án tốt nghiệp NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 4.570061 Number of Means Critical Range 4.025 4.195 4.289 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N NTHUC A 23.077 0%NaCl B 17.901 1%NaCl C 13.768 2%NaCl D 9.375 3%NaCl D.7.2 Chủng RL1T TY LE KHANG NAM CHUNG RL1T The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NTHUC 0%NaCl 1%NaCl 2%NaCl 3%NaCl Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 TY LE KHANG NAM CHUNG RL1T The ANOVA Procedure Dependent Variable: DKN Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 922.606936 307.535645 8.45 0.0073 Error 291.284885 36.410611 Corrected Total 11 1213.891822 R-Square Coeff Var Root MSE DKN Mean 0.760040 13.50764 6.034121 44.67191 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NTHUC 922.6069364 307.5356455 8.45 0.0073 TY LE KHANG NAM CHUNG RL1T The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for DKN NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 36.41061 Number of Means Critical Range 11.36 11.84 12.11 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N NTHUC A 58.462 0%NaCl B 45.679 1%NaCl B B 39.130 2%NaCl B B 35.417 3%NaCl D.7.3 Chủng RL TY LE KHANG NAM CHUNG RL 68 Đồ án tốt nghiệp The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NTHUC 0%NaCl 1%NaCl 2%NaCl 3%NaCl Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 TY LE KHANG NAM CHUNG RL The ANOVA Procedure Dependent Variable: DKN Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 758.2508154 252.7502718 17.75 0.0007 Error 113.9414074 14.2426759 Corrected Total 11 872.1922228 R-Square Coeff Var Root MSE DKN Mean 0.869362 8.714448 3.773947 43.30678 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NTHUC 758.2508154 252.7502718 17.75 0.0007 TY LE KHANG NAM CHUNG RL The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for DKN NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 14.24268 Number of Means Critical Range 7.106 7.405 7.572 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N NTHUC A 55.385 0%NaCl B 45.062 1%NaCl B C B 38.406 2%NaCl C C 34.375 3%NaCl D.7.4 Chủng L5 TY LE KHANG NAM CHUNG L5 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NTHUC 0%NaCl 1%NaCl 2%NaCl 3%NaCl Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 TY LE KHANG NAM CHUNG L5 The ANOVA Procedure Dependent Variable: DKN Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 842.2105856 280.7368619 105.67 F NTHUC 842.2105856 280.7368619 105.67 F Model 3857.738810 1285.912937 53.57 F NTHUC 3857.738810 1285.912937 53.57 F Model 3452.962240 1150.987413 101.02 F NTHUC 3452.962240 1150.987413 101.02 F Model 9.09779083 4.54889541 229.07 F NTHUC 9.09779083 4.54889541 229.07 F Model 0.00007950 0.00003975 11.97 0.0081 Error 0.00001993 0.00000332 Corrected Total 0.00009943 R-Square Coeff Var Root MSE CANNANGRE Mean 0.799551 11.97962 0.001823 0.015214 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NTHUC 0.00007950 0.00003975 11.97 0.0081 CAN NANG RE CAY The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for CANNANGRE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 3.322E-6 Number of Means Critical Range 003641 003774 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N NTHUC A 0.017882 RL 75 Đồ án tốt nghiệp A B D.8.3 A 0.016694 0.011067 L5 DC Độ khỏe mầm DO KHOE MAM The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NTHUC DC L5 RL RL1T Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 DO KHOE MAM The ANOVA Procedure Dependent Variable: DOKHOEMAM Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 734306.5167 244768.8389 36.85 F NTHUC 734306.5167 244768.8389 36.85