Xác định tác nhân gây bệnh đốm nâu cây măng tây ( Asparagus officinalis ) trồng tại Ninh Thuận

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÃO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH —*_—oOo BÁO CÁO TÔNG KẾT ĐỀ TÀI CHƯƠNG TRÌNH SINH VIÊN NCKH NĂM 2020 XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM NÂU CÂY MĂNG TÂY (Asparagus officinalis L.) TRỒNG TẠI NINH THUẬN Mã số đề tài: Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Thu Thảo Giảng viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Th| Nhã Khoa: Công nghệ Sinh học Thành viên tham gia: STT Họ tên Nguyễn Thị Thu Thảo MSSV 1711546225 TP Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2020 Lớp 17DSH1A MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH DANH MỤC BẢNG BIÊU CHƯƠNG TÔNG QUAN 1.1 Nơi thực 10 1.2 Nội dung nghiên cứu 10 1.3 Vật liệu phuơng pháp nghiên cứu 10 1.3.1 Xác định đặc điểm hình thái tác nhân gây bệnh đốm nâu măng tây trồng Ninh Thuận 10 2.3.2 Phuơng pháp lây nhiễm nhân tạo tác nhân gây bệnh 12 2.3.3 Xác định tác nhân gây bệnh phương phápđịnh danh phân tử 12 1.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ, ánh sáng lên sinh trưởng vàphát triển tác nhân gây bệnh 16 2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng phát triển tác nhân gây bệnh 16 2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng ánh sáng lên sinh trưởng phát triển tác nhân gây bệnh 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 1.5 Đặc điểm hình thái tác nhân gây bệnh đốm nâu măng tây Ninh Thuận 17 1.5.1 Triệu chứng gây bệnh 17 1.5.2 Phân lập, làm tác nhân gây bệnh 17 1.5.3 Quan sát mẫu kính hiển vi 18 1.6 Xác định đường lây nhiễm thông qua lây nhiễm, lan truyền tác nhân gây bệnh đốm nâu thông qua lây nhiễm nhân tạo 19 1.7 Xác định tác nhân gây bệnh phương pháp định danh phân tử 23 1.7.1 PCR khuyếch đại vũng trình tự 18S rRNA 24 1.7.2 Giải trình tự sản phẩm PCR 24 1.7.3 Ket BLAST chủng nấm phân lập với sở liệu NCBI 25 1.7.4 Xây dựng phát sinh loài 26 3.4 Ket khảo sát nhiệt độ, ánh sáng lên sinh trưởng phát triển chủng nấm phân lập 31 3.4.1 Ket khảo sát nhiệt độ lên sinh trưởng phát triển chủng nấm phân lập 31 3.4.2 Ket khảo sát ánh sáng lên sinh trưởng phát triển chủng nấm phân lập 34 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA : Deoxyribonucleic Acid RNA : Ribonucleic Acid rRNA : ribosome Ribonucleic Acid PCR : Polimerase Chain Reaction dNTPs : Deoxyribonucleotide triphosphates ITS : Internal Transribed Spacer PGA : Potato Glucose Agar WA : Water Agar NCBI : National Center for Biotechnology Information PLS1 : Plant Lysis Buffer PLS2 : Plant Lysis Buffer PBB : Plant Binding Buffer PWB : Plant Wash Buffer EB : Elution Buffer cv : Coeff Var LSD : Least Significant Difference DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 3.1 Măng tây bị bệnh đốm nâu Ninh Thuận 17 Hình 3.2 Mầu măng tây bị bệnh đốm nâu thu từ huyện Ninh Phước, tỉnh Ninh Thuận 17 Hình 3.3 Hình thái mẫu nấm thứ phân lập mơi trường PGA sau 2, 4, ngày 18 Hình 3.4 Hình thái mẫu nấm thứ hai phân lập môi trường PGA sau 2, 4, ngày 18 Hình 3.5 Ket quan sát hình thái kính hiển vi (A) Mầu thứ nhất; (B) Mau thứ hai 19 Hình 3.6 Lây nhiễm nhân tạo mẫu Alternaria sp măng tây 20 Hình 3.7 Lây nhiễm nhân tạo mẫu Curvularia sp măng tây 21 Hình Bệnh đốm nâu măng tây đồng ruộng sau lây nhiễm nhân tạo 22 Hình 3.9 Hình thái tản nấm (A, B, C) soi kính hiển vi (D, E, F) mẫu nấm Alternaria sp.sau tái phân lập nghiệm thức 3,4,5 22 Hình 3.10 Hình thái tản nấm (A, B, C) soi kính hiển vi (D, E, F) mẫu nấm Curvularỉa sp sau tái phân lập nghiệm thức 3, 4, 23 Hình 3.11 Ket điện di sản phẩm PCR 24 Hình 3.12 Ket đọc trình tự Alternaria sp phần mềm BioEdit 24 Hình 3.13 Ket đọc trình tự Curvularỉa sp phần mềm BioEdit 25 Hình 14 Ket BLAST trình tự chủng nấm phân lập thứ 25 Hình 3.15 Ket BLAST trình tự chủng nấm phân lập thứ hai 26 Hình 3.16 Cây phát sinh loài chủng nấm Alternaria alternata 28 Hình 3.17 Cây phát sinh lồi chủng nấm Ciirvularia sp 30 Hình 3.18 Ảnh hưởng nhiệt độ lên phát triển nấm Alternaria Alternata 32 Hình 3.19 Ảnh hưởng nhiệt độ lên phát triển nấm Curvularỉa sp 33 Hình 3.20 Ảnh hưởng ánh sáng lên phát triển nấm Alternaria alternata 35 Hình 3.21 Ảnh hưởng ánh sáng lên phát triển nấm Curvularia sp 36 DANH MỤC BẢNG BIÉU Bảng Thành phần phản ứng PCR 14 Bảng 2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 15 Bảng 3.1 Các chủng tham chiếu với nấm Alternarỉa alternata 27 Bảng 3.2 Các chủng tham chiếu với nấm Curvularỉa sp 29 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ lên phát triển nấm Alternaria alternata 31 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ lên phát triển nấm Curvularỉa sp 32 Bảng 3.5 Ảnh hưởng ánh sáng lên phát triển nấm Alternaria alternata 34 Bảng 3.6 Ảnh hưởng ánh sáng lên phát triển nấm Curvularia sp 35 CHƯƠNG TỎNG QUAN Tính cấp thiết đề tài Măng tây có tên khoa học Asparagus officinalis L., có nguồn gốc từ châu Âu, đuợc mệnh danh vua loại rau Măng tây có huơng vị thơm ngon, hàm lượng dinh dưỡng cao, giàu tính dược liệu nên ngày trở nên phổ biến, trở thành loại rau có giá trị kinh tế cao Tại Việt Nam, măng tây loại nông sản cao cấp, ưa chuộng, du nhập vào nước ta từ thập niên 60 - 70 kỷ 20 vùng: Đông Anh (Hà Nội), Kiến An (Hải Phịng), Đức Trọng (Lâm Đồng) Là có ti thọ cao, phù hợp với kill hậu nước ta, nên măng tây trồng phổ biến Việt Nam Măng tây chịu hạn tốt mùa nắng, sinh trưởng phát triển mạnh với loại đất trồng tơi xốp, giàu dinh dưỡng, nơi có đầy đủ ánh sáng tỉnh Ninh Thuận măng tây công nhận 12 sản phẩm đặc thù tỉnh Những năm gần măng tây cho suất cao, đáp ứng nhu cầu xuất khẩu, tiêu thụ với giá thành cao nâng mức sống cho nhiều hộ nông dân Song việc trồng măng tây lâu năm điều kiện nóng ẩm làm cho số bệnh hại xuất làm giảm suất, chất lượng hiệu kinh tế loại Rất nhiều bệnh hại gỉ sắt, đốm nâu, bệnh thán thư, mốc xám, bạc lá, đốm lá, bệnh thối măng cổ măng, thối gốc, thường xuyên xuất cánh đồng măng tây giới, làm phát triển kém, kiệt sức chết hàng loạt, Việt Nam nay, số bệnh phổ biến bệnh gỉ sắt, đốm nâu, khô thân cành, thối gốc bệnh gây thiệt hại lớn cho nông dân Trong bệnh đốm nâu bệnh phổ biến, bệnh xuất thân cành, ban đầu đốm nhỏ màu nâu lõm giữa, có viền tím xung quanh, sau bệnh phát triển tạo thành vết bệnh có nhiều đốm liền Ở vùng có mưa kéo dài, nhiều sương mù, bệnh trở nên nghiêm trọng, làm măng non chậm phát triển, gây vàng thân, rụng lá, gây chết trưởng thành, gây hậu nghiêm trọng khơng có biện pháp xử lý kịp thời Việc chẩn đốn xác tác nhân gây bệnh yếu tố quan trọng định thành công biện pháp phịng trà Nhiều bệnh hại có triệu chứng giống nhau, khiến cho việc chẩn đốn gặp khó khăn, đơi khơng thể thực Do đó, thơng tin tình hình bệnh hại việc chẩn đốn tác nhân gây bệnh để làm sở xây dựng biện pháp phòng trừ hiệu cần thiết Tuy nhiên, nghiên cứu tác nhân gây bệnh măng tây Việt Nam hạn chế Chính vậy, đề tài “Xác định tác nhân gây bệnh đốm nâu măng tây (Asparagus officinalis L.) trồng Ninh Thuận” thực nhằm tìm ngun nhân gây bệnh để có biện pháp phịng trà thích họp Mục tiêu đề tài Định danh tác nhân gây bệnh đốm nâu măng tây trồng Ninh Thuận thông qua đặc điểm hình thái đặc điểm phân tử vùng ITS 18S rRNA Xác định điều kiện nhiệt độ, ánh sáng thích họp cho sinh trưởng phát triển tác nhân gây bệnh Khả ứng dụng thực tiễn Việc tìm tác nhân gây bệnh biết điều kiện ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển tác nhân gây bệnh giúp làm sở cho dự tính, dự báo có biện pháp xử lý phòng trừ nấm gây bệnh đốm nâu măng tây phù họp CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 1.1 Noi thực - Thời gian thực hiện: từ tháng - 2020 đến - 2020 - Địa điểm tiến hành: Phòng Sinh học Phân tử Thực Vật khoa Công Nghệ Sinh Học, 2374 Quốc lộ 1A, phường Trung Mỹ Tây, quận 12, Thành phố Hồ Chí Minh 1.2 Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Xác định đặc điểm hình thái tác nhân gây bệnh đốm nâu măng tây trồng Ninh Thuận - Nội dung 2: Định danh phân tử dựa vùng trình tự ITS 18S rRNA tác nhân gây bệnh - Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ, ánh sáng lên sinh trưởng phát triển tác nhân gây bệnh 1.3 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 1.3.1 Xác định đặc điểm hình thái tác nhân gây bệnh đốm nâu măng tây trồng Ninh Thuận Vật liệu: Mầu bệnh hại có triệu chứng điển hình bệnh đốm nâu măng tây thu thơn Tuấn Tú, xã An Hải, huyện Ninh Phước, tỉnh Ninh Thuận Việc chẩn đốn xác tác nhân gây bệnh yếu tố quan trọng định thành công biện pháp phòng trừ Một số tác nhân gây bệnh lên biểu triệu chứng điển hình giúp xác định sơ có mặt tác nhân gây bệnh nấm hay vi khuẩn hay nhiều tác nhân gây bệnh Sau tác nhân phân lập làm môi trường nhân tạo Tuy nhiên, nhiều bệnh hại có triệu chứng giống nhau, khiến cho việc chẩn đoán gặp khó khăn, đơi khơng thể thực Vì mẫu bệnh chuẩn đốn xác theo nhiều phương pháp khác phịng thí nghiệm Khi mẫu bệnh phân lập làm thuần, mẫu bệnh xác định kính hiển vi hay kỹ thuật phân tử phương pháp tốn Hầu hết nấm gây bệnh thối rễ thân cành chẩn đoán dựa môi trường nhân tạo 2.3.1.1 Phương pháp phân lập làm tác nhân gây bệnh - Thu thập mẫu: Mầu măng tây nghi ngờ có triệu chứng bệnh thu thập Ninh Thuận Tiến hành quan sát, ghi chép thu mẫu có triệu chứng bệnh 10 951 - AlTemana sp /l&s/Aioevera/ MyBinh/VkelNarrV20i9 97 Allernana s p.71 SS/AloeveraAZan Hal A/»etNam/2019 Altemana 5p/i8S/Aloevera/MyHaMV»etNanv 2019 Alternana artemala/18S/Pakistan/2018 MH 79767 • Aiternana sp /i8Sj'A$paragus/AnHai/vietNan'V2O2O Alternana allemala, l8S'China/2020 MT089989 Aiternarta tenssima/i8S/China/20i9 MN593335 Alternana allema!'l8S/China72Ũl8 MG717290.1 Aliernarta alternaia/18S/criinaZ2019 MK392100 97 Artemana altemaỉaM8S/Japan/2020 LC440S831 Aiternana aitemaia/i8SAJaparừ2020 LC440581 ARernana altemata/l8S/Pakfstan/20l8 MHS69Ữ92.1 Aiternana atternaia/18S/india/20i9 MK6 75997 ARernana attemataiT8S/lndia/201S MH 183216 Sả Aiternaria arternaia/l8S/China/20l5 KT 192213 Altemana altemala/18S/Ch»na/2017 KY026586 Alternana altemaiaí18S/Pakistan/2016 KX926578 Alternana artemataH8S/Germany/2020 MT4Ô3271 Altemana artema(a/18S7Pakistan/2O18 MH879772 Attemana allernata,'lSS/Japan/2020 MH862229.1 curvulana lunataHSS/lndía/2018 MH183192 o 020 Hình 3.16 Cây phát sinh lồi chủng nấm Alternaria alternata Phân tích phát sinh (Hình 3.16) cho thấy trình tự gen 18S - 28S chủng nghiên cứu Alternaricil sp phân bố nhóm có mức tưong đồng cao với chủng Alternarial alternate! phân lập từ nhiều quốc gia giới Trung Quốc (trên nhân sâm, cải củ, yến mạch), Pakistan (trên quýt hồng, hoa hồng), Àn Độ (lúa mì), Nhật Bản (cà chua) Chủng nấm Alternaria tenuissỉma (trên sâm ngọc linh) Trung Quốc có quan hệ gần với Alternarial alternata Trong nghiên cứu Hong cộng (2006) phân loại Alternarial phân loại hạt phỉ óc chó Châu Âu, dựa dừ liệu AFLP, nhóm A alterta A tenuissỉma bao gồm dịng Ngồi so sánh chủng nấm phân lập Alternarỉa măng tây bị đốm nâu với chủng nấm Alternarỉa phân lập nha dam bị đốm trồng Ninh Thuận cho thấy hai củng nấm nhóm với Vì vậy, tác nhân gây bệnh đốm nâu măng tây tác nhân gây bệnh đốm nha dam trồng Ninh Thuận loại Alternarial alternata Từ đó, canh tác, người dân cần ý không nên luân canh, xen canh trồng hai loại gần để tránh lây lan dịch bệnh Đối với chủng nấm Curvularia sp sau tìm co sở liệu NCBI, chọn 16 kết có quan hệ gần với chủng nghiên cứu dùng làm chủng tham chiếu, ngồi cịn có trình tự lấy từ mẫu nha dam bị bệnh đốm Ninh Thuận 28 tham chiếu (Bảng 3.2) Bên cạnh chủng nấm Pleosporaceae sp chọn làm nhóm outgroup Bảng 3.2 Các chủng tham chiếu với nấm Curvularỉa sp STT Loài Mã số truy cập Curvularia lunata MH911367.1 MH880114.1 Curvularia lunata MH414909.1 Curvularia warraberensis Curvularia lunata DQ836799.1 MH183192.1 Curvularia lunata Curvularỉa lunata MN173127.1 KU681406.1 Curvularia lunata Curvularia lunata KJ767095.1 MG745382.1 Curvularỉa lunata 10 KU856632.1 Curvularia aerỉa 11 KU221485.1 Curvularia lunata 12 KY684275.1 Curvularia lunata 13 Curvularia prasadỉi MH858396.1 14 Curvularia lunata KY684273.1 15 KY684274.1 Curvularia lunata 16 KY307850.1 Curvularia lunata ❖ 17 Curvularia hawaiiensis ❖ 18 Curvularia hawaiiensis ❖ 19 Curvularia hawaiiensis (*): Không rõ gây bệnh đối tượng hay quốc gia 29 Quốc gia Ẩn Độ Ấn Độ Australia Pháp Ẩn Độ Án Độ Egypt Malaysia Trung Quốc Burkina Faso Ẩn Độ Oman Ấn Độ Oman Oman Ẩn Độ Ninh Thuận Ninh Thuận Ninh Thuận Đối tượng gây bệnh (*) (*) Cỏ chân gà (*) Ngô Cây Cà chua (*) (*) Cao lương (*) Đậu cô ve ' (*) Đậu cô ve Đậu xanh (*) Nha đam Nha đam Nha đam Curvularia lunata/18S/OmarV2017 KY684274.1 Curvularia lunata/18S/OmarV2017 KY6842751 Curvularia lunata/18S/Oman/2017 KY6842731 Curvularia lunata/18S/lndia/2015 KU221485.1 • Curvularia sp /18S/Asparagus/AnHai/A/ietNam/2020 Curvularia lunata/18S/lndia/2019 MN173127.1 Curvularia lunata/18S/Egypt/2016 KU681406.1 Curvularia aeria/18S/lndia/2016 KY307850 Curvularia aeria/18S/BurkinaFaso/2016 KU856632 Curvularia prasadii/18S/lndia/2020 MH858396 Curvularia lunata/18S/lndia/2018 MH 183192.1 Curvularia lunata/18S/FranceZ2015 DQ836799 Curvularia warraberensis/18S/Australia/2018 MH414909 Curvularia lunata/18S/lndia/2018/MH880114.1 Curvularĩa lunata/18S/lndĩa/20187MH911367.1 r Curvularia lunata/18S/Malaysia/2014 KJ767095 98l Curvularia lunata/18S/China/2018 MG745382 Curvularia sp./18S/Aloevera/VanHai/VietNam/2019 Curvularia sp./18S/Aloevera/MyHaưVìetNam/2019 Curvularia sp./18S/Aloevera/MyBinlWietNam/2019 Pleosporaceae sp./18S/Germany/2020 KT270256 020 Hình 3.17 Cây phát sinh loài chủng nấm Curvularỉa sp Sau phân tích phát sinh lồi trình tự thứ (Curvularỉa sp ) (Hình 3.17) cho thấy trình tự gen chủng nghiên cứu Curvularia sp phân bố nhóm có mức độ tưong đồng cao với chủng Curvularia sp phân lập từ nhiều quốc gia giới nhu Àn Độ (ngô, bông), Oman (đậu cô ve, đậu xanh), Pháp, Burkina Faso (cây cao lương), úc( cỏ chân gà), Ai Cập (cà chua) Ngoài so sánh với chủng nấm Curvularia gây hại nha đam trồng Ninh Thuận cho thấy khơng nhóm với chủng nấm Curvularia phân lập măng tây Từng có báo cáo Malaysia cho số loài Curvularia phân lập từ măng tây Malaysia, Curvularia lunata loài thường gặp (85%), Curvularỉa pallescens (32%), Curvularỉa eragrostidis (18,2%) Curvitlaria brachyspora (11,5%) Như vậy, kết phân tích tác nhân gây bệnh thông qua đặc điểm phân tử khắng định tác nhân gây bệnh đốm nâu măng tây Alternarỉa alternata nấm Curvularỉa sp (trong Curvularỉa lunata, Curvuỉaria warraberensis, Curvularia aerỉa, Curvularia prasadỉỉ lồi nấm có quan hệ lồi gần nhau) chủng nấm nghiên cứu tương đồng với chủng nấm gây bệnh trồng nhiều nước giới 30 3.4 Ket khảo sát nhiệt độ, ánh sáng lên sinh trưởng phát triển chủng nấm phân lập Nhiệt độ, ánh sáng ẩm độ ba yếu tố ngoại cảnh làm ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng, phát triển màu sắc nấm Trong đó, ẩm độ điều kiện tiên dẫn đến sinh trưởng phát triển tác nhân gây bệnh Để khảo sát đánh giá yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển nấm nhằm mục đích dự báo sinh trưởng phát triển dịch bệnh khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ ánh sáng tiến hành 3.4.1 Kết khảo sát nhiệt độ lên sinh trưởng phát triển chủng nấm phân lập Nhiệt độ yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển tác nhân gây bệnh Trong thí nghiệm này, năm ngưỡng nhiệt độ khác khảo sát với Alternaria alternata Curvularỉa sp Kết thí nghiệm thu bảng 3.3, 3.4 hình 3.18, 3.19 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ lên phát triển nấm AItern aria alternata Đường kính tản nấm (cm) Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ ố,7b 20 1,7C 2,3C 3,5b 5,3b 25 l,7a 30 4,l a l,9a 5,6a 0,5 d 0,9 d 35 0,3c o,od 40 o,oe o,oe 10,04 cv (%) 5,57 2,58 0,24 0,28 0,19 LSDo.oi *Trong cột giá trị trung bình có chữ theo sau khác khác biệt có ỷ NHIỆT Độ (°C) - nghĩa mặt thống kê 31 Hình 3.18 Anh hưởng nhiệt độ lên phát triên nâm Alternaria Alternata (Al — A2 - A3: Nấm nuôi cấy nhiệt độ 20 °C sau 2, 4, ngày nuôi cay; Bl - B2 - B3: Nấm nuôi cấy nhiệt độ 25 °C sau 2, 4, ngày nuôi cay; Cl - C2 - C3: Nấm nuôi cấy nhiệt độ 30 °C sau 2, 4, ngày nuôi cấy; Dl - D2 — D3: Nấm nuôi Cấy nhiệt độ 35 °C sau 2, 4, ngày nuôi cay; El- E2 - E3: Nấm nuôi Cấy nhiệt độ 40 °C sau 2, 4, ngày nuôi cay) Bảng 3.4 Ánh hưởng nhiệt độ lên phát triến nấm Curvularỉa sp Đường kính tăn nấm (cm) Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ 3,2C l,6d 5,0d 20 5,4a 25 2,6C 7,9a 6,5b 30 3,6a 5,5a 2,9d 5,0b 35 6,0c o,oe o,od 40 o,oe 3,23 2,02 1,90 cv (%) 17 0,20 0,25 LSDo.oi *Trong cột giá trị trung bình có chữ theo sau khác khác biệt có ỷ NHIỆT Độ (°C) - nghĩa mặt thống kê 32 Hình 3.19 Anh hưởng nhiệt độ lên phát triển nấm Curvularia sp (Al — A2 - A3: Nấm nuôi cấy nhiệt độ 18 — 20 °C san 2, 4, ngày nuôi cay; Bl - B2 - B3: Nấm nuôi cấy nhiệt độ 25 °C sau 2, 4, ngày nuôi cay; Cl - C2 - C3: Nấm nuôi cấy nhiệt độ 30 °C sau 2, 4, ngày nuôi cấy; Dl - D2 - D3: Nấm nuôi cấy nhiệt độ 35 °C sau 2, 4, ngày nuôi cay; El- E2 - E3: Nấm nuôi cấy nhiệt độ 40 °C sau 2, 4, ngày nuôi cấy) Ket bảng 3.3 3.4 cho thấy sau hai ngày ngưỡng nhiệt độ 20 °C đến 35 °C, chủng nấm có tăng trưởng kích thước, nhiên nhiệt độ 35 °C chủng nấm Alternaria ahernata phát triển yếu, nhiệt độ 40 °C quan sát thấy hai chủng nấm Alternaria alternata Curvularỉa sp khơng có phát triến Đối với chủng nấm Alternaria alternata nhiệt độ 20 °C nấm phát triển chậm ngưỡng nhiệt độ 25 - 30 °C Chủng nấm Curvuỉaria sp phát triển tốt ngưỡng nhiệt độ từ 25 - 35 °C, nghiên cứu chứng minh ngưỡng phát triển tốt nấm Sau ngày, ngưỡng nhiệt độ 25 °C Curvularỉa sp có phát triển tốt ngưỡng nhiệt độ 30 °C Alternaria alternata phát triển tốt nhất, nhiệt độ 40 °C hai chủng nấm không phát triển Như vậy, tác nhân gây bệnh đốm nâu măng tây phát 33 triển mạnh nhiệt độ từ 25 - 30 °C, nhiệt độ 20 °C 35 °C nấm phát triển chậm, nhiệt độ cao 40 °C nấm bị ức chế hoàn toàn Đối với Ninh Thuận, nhiệt độ trung bình hàng năm cao phù họp với sinh trưởng phát triển nấm bệnh theo nghiên cứu Vì để kiểm sốt bệnh cần sử dụng biện pháp hạn chế phát tán mầm bệnh sử dụng thuốc vi sinh, vi sinh vật đối kháng 3.4.2 Ket khảo sát ánh sáng lên sinh trưởng phát triển chủng nấm phân lập Bên cạnh nhiệt độ, ánh sáng yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển vi sinh vật Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng ánh sáng năm ngưỡng điều kiện ánh sáng khác cho kết thí nghiệm thu bảng 3.5, 3.6 hình 3.20, 3.21 Bảng 3.5 Ảnh hưởng ánh sáng lên phát triển nấm Alternarỉa alternata Đường kính tản nấm (cm) Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ Tối liên tục 3,lcd 4,4d 1,8C 4,3e Sáng liên tục l,oe 3,3C 12S - 12T 4,9a 6,7a 2,3a l,ld 3,ld 16T - 8S 4,9C 2,0b 4,4b 6,0b 8T - 16S 3,17 0,85 cv (%) 2,27 0,22 12 013 LSDo.oi *Trong cột giá trị trung bình có chữ theo sau khác khác biệt có ỷ ÁNH SÁNG nghĩa mặt thống kê 34 Hình 3.20 Ảnh hường ánh sáng lên phát triên nấm Alternarỉa alternata (Al - A2 - A3: Mâu nấm nuôi cấy điều kiện tối liên tục sau 2, 4, ngày nuôi cấy BI - B2 -B3: Mâu nấm nuôi cấy điều kiện sảng liên tục sau 2, 4, ngày nuôi cay Cl, C2, C3: Mâu nấm nuôi cấy điều kiện 12ỈĨ sảng - 12 tối sau 2, 4, ngày nuôi cấy Dl - D2 - D3: Mâu nam nuôi cấy điếu kiện 16h toi - 8h sáng sau 2, 4, ngày nuôi cấy.El - E2 - E3: Mâu nấm nuôi cấy điều kiện 16h sáng - 8h tối sau 2, 4, ngày nuôi cấy) Bảng 3.6 Ảnh hưởng ánh sáng lên phát triển nấm Curvularia sp Đường kính tản nấm (cm) Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ y gabc Tối liên tục 3,5ab 6,6ab 3,6ab 6,3ab 8,obc Sáng liên tục 3,3ab 6,9a 8,4a 12S - 12T 8,obc 16T - 8S 3,7a 7,la 3,lb 5,9b 8,2ab 8T - 16S 5,75 3,97 cv (%) 2,0 0,42 051 0,67 LSDo,oi *Trong cột giá trị trung bình có chữ theo sau khác khác biệt có ỷ ÁNH SÁNG nghĩa mặt thống kê 35 Hình 3.21 Ánh hướng ánh sáng lên phát triến nấm Curvularỉa sp (Al - A2 - A3: Mầu nấm nuôi cấy điều kiện tối liên tục sau 2, 4, ngày nuôi cay Bl - B2 B3: Mâu nấm nuôi cấy điều kiện sảng liên tục sau 2, 4, ngày nuôi cấy Cl - C2 - C3: Mâu nấm nuôi cấy điều kiện 12h sáng- 12 tối sau 2, 4, ngày nuôi cấy Dl - D2 - D3: Mâu nấm nuôi cấy điếu kiện 16ÌỈ tối- 8h sáng sau 2, 4, ngày ni cay El - E2 - E3: Mâu nấm nuôi cấy điều kiện 16h sáng 8h sau 2, 4, ngày nuôi cấy.) Ket bảng 3.5 bảng 3.6 cho thấy, nấm phát triển tất điều kiện chiếu sáng điều kiện ánh sáng có ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển nấm Alternaria aỉternata Curvularỉa sp Ớ ngưỡng tối xen kẽ 16 sáng 12 sáng xen kẽ 12 tối, nấm Alternaria alternata phát triển tốt ngưỡng ánh sáng tối liên tục, sáng liên tục, 16 tối sáng có khác biệt màu sắc sinh trưởng (Hình 3.20), đường kính tản nấm mức độ ánh sáng khác nhau, phát triển tốt tối xen kẽ 16 sáng (6,7cm) phát triển chậm tối liên tục (4,3cm) Đối với nấm Curvularia sp sau ngày nuôi cấy cho thấy ảnh hưởng ánh sáng không rõ đến sinh trưởng nấm, đường kính lớn 8,4cm ngưỡng 12 tối xen kẽ 12 sáng, ngưỡng tối xen kẽ 16 sáng nấm đạt 8,2cm đường kính nhỏ 7,8cm điều kiện tối liên tục Điều cho thấy nấm gây bệnh đốm nâu măng tây trồng Ninh Thuận phát triển thích hợp với điều kiện ánh sáng tối 16 sáng 12 sáng xen kẽ 12 tối 36 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Tác nhân gây bệnh đốm nâu măng tây Ninh Thuận Alternaria aỉternata Curvularỉa sp Hệ sợi nấm A alternata phát triển nhanh tạo tản nấm ban đầu có màu xám nhạt sau chuyển sang màu nâu đen với rìa ngồi màu trắng sau ngày ni cấy Khuẩn ty màu nâu sáng, mảnh, có vách ngăn, phân nhánh Bào tử có hình trứng hình elip Nấm thích họp với nhiệt độ 30 °C Nấm Curvularia sp Có khuẩn ty màu xám nhạt, sau ngày chuyển xanh xám xám đậm vùng trung tâm màu trắng ngồi rìa Bào tử hình trứng, clip, có màu nâu nhạt đến nâu sẫm, có vách ngăn, đơi uốn cong, thuôn đầu Nấm phát triển mạnh nhiệt độ 25 °C Nấm Alternaria alternata Curvularia sp phát triến tất điều kiện ánh sáng khảo sát Đề nghị Áp dụng chủng vi sinh vật, hoạt chất chất bảo vệ thực vật có tác dụng ức chế nấm Curvularia sp A alternata để để phòng trừ bệnh măng tây Khi nhiệt độ 25 - 30 °C, độ ẩm cao, mưa nhiều cần ý áp dụng biện pháp phòng bệnh Koike ST, Gladders p, Paulus A Vegetable diseases: A colour handbook CRC Press; 2006 Elena K Asparagus diseases European Journal of Plant Science and Biotechnology 2007;1:76-83 Hausbeck M, Hartwell J, Byrne J Epidemiology of Stemphylium leaf spot and purple spot in no-till Asparagus Paper presented at: IX International Asparagus Symposium 1997 Menzies s, Broadhurst p, Triggs c Stemphylium disease of Asparagus (Asparagus officinalis z.) in New Zealand New Zealand journal of crop and horticultural science 1992;20(4):427-433 Lacy ML Purple Spot: A new disease of young Asparagus spears caused by Stemphylium vesicarium Plant Disease 1982;66(12):1198-1200 Leuprecht B Stemphylium botryosum Wallr on Asparagus Gesunde Pflanzen 1990;42(6):187-191 Joon HH, Jong HS, Fu T, Kim KS A New Record and Characterization of Asparagus Purple Spot Caused by Stemphylium vesicarium in Korea 2019;47(l): 120-125 Mary K Hausbeck PaES, Bryan J Webster FRA Purple spot disease of Asparagus Michigan State University 2009 Wang XF, Li ZA, Tang KZ, Zhou CY, Yi L First report of Alternaria brown spot of Citrus caused by Alternaria alternata in Yunnan Province, China Plant Disease 2010;94(3):375-375 Rukhsana Bajwa, Irum Mukhtar, Mushtaq s New report of Alternaria alternata causing leaf spot of Aloe vera in Pakistan Canadian Journal of Plant Pathology 2010;32(4):490-492 Ezra D, Gat T, Skovorodnikova Y, Vardi Y, Kosto I First report of Alternaria black spot of pomegranate caused by Alternaria alternata in Israel Australasian Plant Disease Notes 2010;5(l): 1-2 Shoaib A, Akhtar N, Akhtar s, Hafeez R First report of Alternaria longipes causing leaf spot of potato cultivar sante in Pakistan Plant Disease 2014;98(12):1742-1742 Raja p, Reddy A, Allam u First report of Alternaria tenuissima causing leaf spot and fruit rot on eggplant (Solanum melongend) in India Plant pathology: 2006;55(4) Nasehi A, Kadir J, Abidin MZ, Wong M, Mahmodi F First report of Alternaria tenuissima causing leaf spot on eggplant in Malaysia Plant disease 2012;96(8):1226-1226 39 Salleh BSB, Safinat A, Julia L, Teo c Brown spot caused by Curvularia spp., a new disease of asparagus BIOTROPIA-The Southeast Asian Journal of Tropical Biology 1996(9) Cui R, Sun X First report of Curvularia lunata causing leaf spot on lotus in China Plant disease 2012;96(7):1068-1068 Akram w, Anjum T, Ahmad A, Moeen R First report of Curvularia lunata causing leaf spots on Sorghum bicolor from Pakistan Plant disease 2014;98(7):1007-1007 Majeed R, Shahid A, Saleem M, Asif M, Zahid M, Haider M First report of Curvularia tuberculata causing brown leaf spot of Rice in Punjab, Pakistan Plant Disease 2016; 100(8): 1791-1791 Majeed R, Shahid A, Ashfaq M, Saleem M, Haider M First report of Curvularia lunata causing brown leaf spots of rice in Punjab, Pakistan Plant Disease 2016;100(l):219-219 Woudenberg JH, Groenewald J, Binder M, Crous p Altemaria redefined Studies in mycology 2013;75:171-212 Wei J, Lin z, Zhang M, et al First Report of Alternaria sp Causing Brown Leaf Streak on Sugarcane in China Plant Disease 2015;99(8): 1176-1176 Kusai NA, Azmi MMZ, Zulkifly s, Yusof MT, Zainudin NAIM Morphological and molecular characterization of Curvularia and related species associated with leaf spot disease of rice in Peninsular Malaysia Rendiconti Lincei 2016;27(2):205-214 Bruns TD, White TJ, Taylor JW Fungal molecular systematics Annual Review of Ecology and systematics 1991 ;22( ):525-564 Timmer LW, Peever TL, Solei z, Akimitsu K Alternaria diseases of citrusNovel pathosystems Phytopathologia Mediterranea 2003;42(2):99-l 12 Hubballi M, Nakkeeran s, Raguchander T, Anand T, Samiyappan R Effect of environmental conditions on growth of Alternaria alternata causing leaf blight ofnoni World Journal ofAgricultural Sciences 2010;6(2):171-177 Canihos Y, Peever T, Timmer L Temperature, leaf wetness, and isolate effects on infection of Minneola tangelo leaves by Alternaria sp Plant Disease 1999;83(5):429-433 Henson JM, Sheehan KB, Rodriguez RJ, Redman RS Curvularia strains and their use to confer stress tolerance and/or growth enhancement in plants Google Patents; 2011 Roberts J, Tredway L First report of Curvularia blight of zoysiagrass caused by Curvularia lunata in the United States Plant disease 2008;92(l):173-173 40 Salleh B, Safinat A, Julia L, Teo c Brown spot caused by Curvularia spp., a new disease of Asparagus The Southeast Asian Journal of Tropical Biology 1996(9):28 Basallote Ureba M, Prados Ligero A, Melero Vara J Aetiology of leaf spot of garlic and onion caused by Stemphylium vesicarium in Spain Plant Pathology 1999;48(1):139-145 Phạm Thị Thủy Nghiên cứu tình hình bệnh hại, đặc điểm sinh học số nấm gãy bệnh phô biến măng tây (Asparagus officinalis L.) huyện Củ Chỉ Tp Hồ Chí Minh năm 2012, Truờng Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh; 2012 Mai Hồng Đạo Ảnh hưởng mức đạm lân đến sinh trưởng măng tây (Asparagus officininalis L.) trồng Thủ Đức Tp Hồ Chí Minh, Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh; 2014 Huỳnh Thị Ngọc Bích Anh hưởng bon nồng độ xử lỷ Salicylic acid đến suất bệnh nứt thân sổ bệnh hại phô biến măng tây (Asparagus offcinalis L.) Thủ Đức thành phố Hồ chi Minh, Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh; 2015 Burgess LW, Knight TE, Tesoriero L, Phan TH Cẩm nang chẩn đoán bệnh Việt Nam Australian Centre for International Agricultural Research (ACIAR); 2009 Domsch KH, Gams w Fungi in agricultural soils Fungi in agricultural soils 1972 Barnett HL, Hunter BB Illustrated genera of imperfect fungi Illustrated genera of imperfectfungi 1972(3rd ed) White T, Bruns T, Lee s, Taylor J Amplification anddirect sequencing of fungal ribosomal RNA genes forphylogenetics PCR protocols: a guide to methods and applications: Academic Press; 1990:315-322 Shanmugam V, Dhyani D, Ananthapadmanaban D First report of Alternaria sp causing blight on Incarvillea emodi Australasian Plant Disease Notes 2011;6(l):33-35 Marin-Felix Y, Groenewald J, Cai L, et al Genera of phytopathogenic fungi: GOPHY Studies in mycology 2017;86:99-216 Tan YP, Crous PW, Shivas RG Cryptic species of Curvularia in the culture collection of the Queensland Plant Pathology Herbarium MycoKeys 2018(35):l Embong z, Hitam WHW, Yean CY, et al Specific detection of fungal pathogens by 18S rRNA gene PCR in microbial keratitis BMC ophthalmology’ 2008;8(l):7 41 Hong SG, Maccaroni M, Figuli PJ, Pryor BM, Belisario A Polyphasic classification of Alternaria isolated from hazelnut and walnut fruit in Europe Mycological Research 2006; 110(11): 1290-1300 42 Chủ nhiệm đề tài Giảng viên hướng dẫn (Kỷ ghi rõ họ tên) (Kỷ ghi rõ họ tên) 43 ... 1.3.1 Xác định đặc điểm hình thái tác nhân gây bệnh đốm nâu măng tây trồng Ninh Thuận 10 2.3.2 Phuơng pháp lây nhiễm nhân tạo tác nhân gây bệnh 12 2.3.3 Xác định tác nhân gây bệnh. .. định tác nhân gây bệnh đốm nâu măng tây (Asparagus officinalis L .) trồng Ninh Thuận? ?? thực nhằm tìm ngun nhân gây bệnh để có biện pháp phịng trà thích họp Mục tiêu đề tài Định danh tác nhân gây bệnh. .. dam bị đốm trồng Ninh Thuận cho thấy hai củng nấm nhóm với Vì vậy, tác nhân gây bệnh đốm nâu măng tây tác nhân gây bệnh đốm nha dam trồng Ninh Thuận loại Alternarial alternata Từ đó, canh tác,