TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 173-179 SÀNG LỌC VI SINH VẬT NỘI SINH CÂY CAO SU CÓ KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC VI NẤM Corynespora cassiicola Nguyễn Văn Minh1*, Mai Hữu Phúc1, Võ Ngọc Yến Nhi1, Dương Nhật Linh1, Nguyễn Anh Nghĩa2 Trường Đại học Mở Hồ Chí Minh, *nguyenminhou@gmail.com Viện Nghiên cứu cao su Việt Nam TÓM TẮT: Từ 28 mẫu cành mô gỗ cao su (Hevea brasiliensis) thu thập từ thành phố Hồ Chí Minh, tỉnh Bình Phước tỉnh Bình Dương, chúng tơi tiến hành phân lập sàng lọc vi sinh vật nội sinh đối kháng với vi nấm Corynespora cassiicola, tác nhân gây bệnh rụng Corynespora cao su, kết phân lập 21 chủng vi khuẩn nội sinh, 14 chủng vi nấm nội sinh Qua thử nghiệm đối kháng phương pháp thử nghiệm kép vi sinh vật nội sinh C casiicola, xác định chủng T9 T16 có kết đối kháng với nấm C cassiicola Ở thử nghiệm nồng độ ức chế nấm C cassiicola dịch lọc vi khuẩn, chủng T9 T16 nồng độ 1:1 ức chế 100% nấm C cassiicola Còn thử nghiệm khả tiêu diệt nấm C cassiicola, sau lần phun dịch nuôi cấy, chủng T9 T16 tiêu diệt nấm bệnh C cassiicola Các chủng T9 T6 định danh phương pháp sinh hóa có đặc điểm tương tự vi khuẩn Bacillus thuringiensis Từ khóa: Bacillus thuringiensis, Corynespora cassiicola, bệnh rụng Corynespora, biện pháp sinh học, cao su, vi khuẩn nội sinh MỞ ĐẦU Bệnh rụng vi nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei gây cao su (Hevea brasiliensis), bệnh biết đến lần vào năm 1936 cộng hòa Sierra Leone [25] Ban đầu, C cassiicola coi tác nhân gây bệnh không đáng kể cao su Tuy nhiên, bệnh ngày trở nên nghiêm trọng trở thành đại dịch nhiều quốc gia Sau đó, bệnh tiếp tục ghi nhận Ấn Độ vào năm 1961 [19], Malaysia (1961) [14], Indonesia (1983) [23], Sri Lanka Cameroon (1986) [12], Thái Lan (1987) [17], Banglade (1988) [18], Việt Nam (1999) [4] Trung Quốc (2007) [9] Bệnh rụng gây hậu nghiêm trọng, làm ảnh hưởng đến sinh trưởng suất cho mủ cao su Việc sử dụng nhiều thuốc trừ bệnh có nguồn gốc hóa học dẫn đến suy thối đất tượng kháng thuốc Để đối phó với vấn đề này, việc kiểm soát sâu bệnh biện pháp sinh học ngày ý đến có nhiều nghiên cứu thực thời gian gần [15] Vi sinh vật nội sinh xem đối tượng quan trọng, phân lập sàng lọc để làm chế phẩm sinh học dùng cho việc phòng trừ loại nấm bệnh Lợi dụng đặc tính vi sinh vật sống nội sinh tế bào mô thực vật rút ngắn thời gian thích nghi chế phẩm sinh học Vi sinh vật nội sinh tạo nhiều chất kháng sinh nấm bệnh, kích thích sinh trưởng cho đồng thời không ảnh hưởng đến môi trường, sức khỏe cộng đồng [11, 22] Mục tiêu nghiên cứu tìm vi sinh vật nội sinh có khả kiểm sốt sinh học vi nấm C cassiicola VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vi sinh vật nội sinh phân lập từ 28 mẫu cao su khỏe mạnh, thu thập từ vườn cao su huyện Củ Chi, Hồ Chí Minh; huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dương; huyện Chơn Thành thị xã Đồng Xồi, tỉnh Bình Phước Vi nấm Corynespora cassiicola phân lập từ mẫu cao su bị bệnh, thu thập từ vườn cao su địa phương nói Phân lập vi sinh vật nội sinh Vi sinh vật nội sinh tiến hành phân lập từ mô thân sống cao su khỏe mạnh, không sâu bệnh Mẫu tiến hành 173 Nguyen Van Minh et al phân lập vòng sau thu thập Mẫu rửa phần mô vòi nước mạnh, cắt thành đoạn nhỏ 2-4 cm để dễ thao tác, sau khử trùng bề mặt mẫu, thực theo bước sau: ethanol 70% (5 phút), dung dịch sodium hypochlorite 2% (5 phút) ethanol 70% (30 giây) Rửa lại lần với nước cất vô trùng Sau khử trùng bề mặt mẫu, tiến hành dùng dụng cụ khử trùng cắt nhỏ hay nghiền lá, mô phân lập TSA ủ 37oC vài ngày vi khuẩn nội sinh phát triển, mơi trường PDA có bổ sung kháng sinh Chloramphenicol 0,05% bọc kín parafilm ủ 27±2oC từ vài ngày tháng vi nấm nội sinh phát triển [6, 7, 11] Phân lập vi nấm gây bệnh Các mẫu thu thập rửa nước, sau tiến hành khử trùng bề mặt mẫu qua bước: rửa nhanh mô bệnh ethanol 70%, ngâm hỗn hợp dung dịch natri hypochlorite 1% ethanol 10% (1-5 phút), rửa lại mô bệnh với nước cất Cắt nhỏ mô bệnh 2×2 mm sau đặt lên mơi trường PDA ủ nhiệt độ 27±2oC vài ngày nấm bệnh phát triển [2, 3] Thử nghiệm đối kháng vi sinh vật nội sinh nấm bệnh Sử dụng phương pháp thử nghiệm kép, nấm bệnh vi sinh vật nội sinh nuôi cách cm đĩa mơi trường PDA (đường kính 90 mm) 27oC ngày Nếu vi sinh vật nội sinh có có khả ức chế nấm bệnh thấy vùng xung quanh khuẩn lạc vi sinh vật nội sinh, sợi nấm bệnh khơng sinh trưởng sinh trưởng yếu Cịn vi sinh vật nội sinh khơng có khả ức chế phát triển nấm bệnh thấy nấm bệnh phát triển bình thường [8] Thử nghiệm tỷ lệ ức chế dịch lọc vi khuẩn nội sinh với nấm bệnh Vi khuẩn nuôi tăng sinh 50 mL môi trường PD (Potato Dextrose Broth), lắc 150 vịng/phút 37oC 48 Dịch ni cấy ly tâm 9.000 vòng/phút 15 phút 4oC Sau đem lọc qua màng lọc 0,2 µm Dịch khuẩn chuẩn bị pha với môi trường PGA (45oC) theo tỷ lệ: 1:1, 1:2, 1:4, 174 1:8, 1:16 đổ lên đĩa petri (đường kính 90 mm) Hút 20 µL dịch nấm bệnh có nồng 106 CFU/mL bơm vào đĩa petri chuẩn bị Ni ủ nhiệt độ phịng ngày xác định tỷ lệ ức chế theo công thức: I(%)=(CE)/C100%, đó: I tỷ lệ ức chế (%), C đường kính nấm mốc đĩa đối chứng (mm), E đường kính nấm mốc đĩa chứa dịch lọc vi khuẩn (mm) Vi khuẩn xem có khả ức chế nấm I≥20% Nếu I