Bài viết Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng kiểm soát bệnh chảy gôm trên cây cam (Citrus sinensis) nghiên cứu được tiến hành với mục đích tìm kiếm các chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm Phytophthora spp., tác nhân chính gây bệnh chảy gôm trên cây cam.
Vietnam J Agri Sci 2022, Vol 20, No 8: 1066-1075 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2022, 20(8): 1066-1075 www.vnua.edu.vn TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG KIỂM SỐT BỆNH CHẢY GƠM TRÊN CÂY CAM (Citrus sinensis) Phạm Hồng Hiển1, Bạch Thị Điệp2, Nguyễn Thị Chúc Quỳnh2, Phùng Quang Tùng2, Đặng Thị Thanh Tâm3* Ban Khoa học Hợp tác quốc tế, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Viện Bảo vệ thực vật Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam * Tác giả liên hệ: thanhtam@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 02.04.2022 Ngày chấp nhận đăng: 05.07.2022 TÓM TẮT Nghiên cứu tiến hành với mục đích tìm kiếm chủng vi khuẩn có khả đối kháng với nấm Phytophthora spp., tác nhân gây bệnh chảy gơm cam Từ 38 chủng vi khuẩn phân lập từ đất trồng cam Hịa Bình Tiền Giang, tuyển chọn 01 chủng vi khuẩn ký hiệu LHB15 có khả đối kháng mạnh với nấm Phytophthora citrophthora 18PMS P palmivora 17PMS Dựa đặc điểm hình thái phân tích trình tự đoạn 16S rRNA, chủng vi khuẩn LHB15 xác định thuộc loài Bacillus siamensis Chủng B siamensis LHB15 sinh trưởng tốt điều kiện nhiệt độ 37C pH7 Chủng B siamensis LHB15 có khả ức chế cao nấm P citrophthora 18PMS đất rễ cam sau 45 ngày xử lý Kết cho thấy chủng vi khuẩn đối kháng có tiềm ứng dụng phát triển chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh chảy gơm cam Từ khóa: Đối kháng, bệnh chảy gôm, Phytophthora citrophthora, Phytophthora palmivora, Bacillus siamensis Selection of Potential Bacterial Strain for Controlling Gummosis Disease in Citrus (Citrus sinensis) ABSTRACT The research aimed to identify potential biocontrol agents in controlling Phytophthora spp that causes gummosis disease of citrus (C sinensis) Out of 38 strains isolated from the soil samples collected from Hoa Binh and Tien Giang provinces, the strain LHB15 showed strong antagonistic activity against P citrophthora 18PMS and P palmivora 17PMS Analysis of morphological characteristics and 16S rRNA sequence, the strain LHB15 was identified as B siamensis The optimal condition for the growth of B siamensis LHB15 was determined in LB at 37C and pH Testing the antagonistic activity against P citrophthora 18PMS in greenhouse conditions showed a strong reduction in the presence of fungi on soil and citrus roots after 45 days of treatment The study indicated that the B siamensis LHB15 is a potential strain for controlling gummosis in citrus Keywords: Antagonistic activity, gummosis, Phytophthora citrophthora, Phytophthora palmivora, Bacillus siamensis ĐẶT VẤN ĐỀ Cam l cồy ởn quõ quan trừng nhỗt trờn th gii vi sõn lng c tớnh 124.246 nghỡn tỗn nởm 2016 (Rajput & cs., 2020) Ở Việt Nam, cam tr÷ng quan trõng vĉi diện tích không 100 nghìn hecta, sõn lng ọt 1.545,9 nghỡn tỗn, tởng 33,2% so vi nëm trāĉc tính đến 1066 nëm 2021, vĉi vùng tr÷ng cam trõng điểm nhā Hđa Bình, Tiền Giang, Nghệ An (Tùng cĀc Thøng kê, 2021) Tuy nhiên, ngành công nghip cam luụn phõi ứi mt vi rỗt nhiu tỏc ỷng bỗt li cỵa cỏc nhõn tứ vụ sinh v bệnh häi Trong bệnh häi cam bệnh chây gôm bệnh mĉi nùi nhāng cũ khõ nởng gõy thit họi ln cho nởng suỗt v chỗt lng Phm Hng Hin, Bch Th ip, Nguyn Thị Chúc Quỳnh, Phùng Quang Tùng, Đặng Thị Thanh Tâm cam c tớnh giõm khoõng 10-30% nởng suỗt mỳi nởm (Mounde & cs., 2009) Nguyên nhân gây bệnh chỵng nỗm thuỷc chi Phytophthora sứng ỗt Bnh lõy lan v gõy họi tỗt cõ bỷ phờn cỵa cõy, gõy chõy mỵ, c bit cỏc trững vi mêt đû dày khó nāĉc Cây bð bệnh biểu triệu héo rÿ vàng ýa, sinh trāĊng chết bð nhiễm bệnh nặng Bệnh chây gơm bệnh có săc tàn phá cĆc lĉn làm cho vāĈn cåy ën trái b suy kit hon ton Bnh c ghi nhờn thỗy 90% trững vi tợ l bnh trung bỡnh 45% (Mekonen & cs., 2015) Để kiểm soát bệnh thỡ cỏc loọi thuức tr nỗm nỷi hỗp nh metalaxyl fosetyl-Al thāĈng đāČc sĄ dĀng đät hiệu quâ cao Tuy nhiên, sĄ dĀng lội thùc thi gian di s xuỗt hin cỏc chỵng nỗm khỏng thuøc (Graham & Feichtenberger, 2015) Hiện nay, bên cänh chiến lāČc nghiên cău phát triển giøng kháng bệnh biện pháp sinh hõc nhā sĄ dĀng dðch chiết thc vờt kớch thớch h thứng khỏng cỵa cõy trững, vi sinh vờt ứi khỏng (nỗm, khuốn) l cỏc giâi pháp thân thiện vĉi mưi trāĈng, có hiệu q kinh tế hiệu quâ cao quân lý bệnh chây gôm Mût sø vi sinh vêt đøi kháng hiệu quâ đāČc nghiên cău ăng dĀng nhā Bacillus spp., Trichoderma viride, T hamatum, T harzianum, T lignorum, Gliocladium virens Pseudomonas fluorescens (Jagtap & cs., 2012) Đặc biệt, cỏc chỵng vi khuốn thuỷc chi Bacillus l ứi tng đāČc quan tâm khâ nëng bâo vệ tr÷ng khỏng lọi cỏc bnh nỗm cú nguữn gức ỗt gõy (Jamali & cs., 2004) Chớnh vỡ vờy, hng tip cờn cỵa nghiờn cu hin l phõn lờp c cỏc chỵng Bacillus cú khõ nởng ứi khỏng vi nỗm Phytophthora spp gõy bnh chõy gửm trờn cồy cam Đåy hāĉng nghiên cău triển võng có khõ nởng ng dng cao thc tin sõn xuỗt Tuy nhiên, nghiên cău, ăng dĀng theo hāĉng quân lý bệnh chây gôm cam vén chāa phát triển Ċ Việt Nam Chính vêy, chúng tơi tin hnh nghiờn cu, phõn lờp, tuyn chừn cỏc chỵng vi khuốn thuỷc chi Bacillus ứi khỏng vi nỗm gõy bệnh chây gôm cam täi Việt Nam Kết quâ nghiên cău phĀc vĀ phát triển chế phèm sinh hõc phịng trĂ bệnh chây gơm cam täi Việt Nam PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liu Hai chỵng nỗm P citrophthora 18PMS v P palmivora 17PMS gây bệnh chây gôm cam phân lêp täi Việt Nam, đāČc lāu gią täi Viện Bâo vệ thĆc vêt, đāČc sĄ dĀng nghiên cău để ỏnh giỏ khõ nởng ứi khỏng cỵa cỏc chỵng vi khuèn phân lêp 2.2 Phân lập tuyển chọn vi khun i khỏng vi nm Phytophthora spp Mộu ỗt t cỏc vựng trững cam cỵa tợnh Hũa Bỡnh v Tin Giang c thu thờp theo phng phỏp cỵa Drenth & Guest (2004) C th, mộu ỗt c lỗy im cỵa tng cõy theo hỡnh tam giỏc u ũ lỗy gức cõy lm trung tồm, sau ũ trỷn u thnh mộu (01 mộu/cõy) Mộu ỗt lỗy tọi nći cò rễ tć phát triển theo chiều sâu cỵa r cỏch mt ỗt t 0-20cm Mỳi lỗy méu theo đāĈng chéo góc Méu thu thêp ghi rụ thửng tin: ngy, a im, tờn chỵ Cỏc chỵng vi khuốn thuỷc chi Bacillus spp c phõn lờp theo phng phỏp cỵa Saidi & cs (2009) Cồn 5g ỗt thu thờp v hũa 45ml nc vụ trựng bình tam giác Bình méu đāČc đun nịng Ċ điều kiện 80C 10 phút Dðch huyền phü đāČc pha loóng nhiu lổn v cỗy trõi trờn mửi trng LB c v c ỵ iu kin 28C khoâng thĈi gian 3-5 ngày (Saidi & cs., 2009) Các chỵng vi khuốn c la chừn l cỏc chỵng cũ c im hỡnh thỏi c trng cỵa chi Bacillus Cỏc chỵng la chừn c lm thuổn bỡng cỗy ria lp lặp läi khuèn läc möi trāĈng LB đặc Khuèn läc sau làm thuæn đāČc lāu gią øng thäch nghiêng glycerol Để đánh giá sć bû khõ nởng ứi khỏng cỵa cỏc chỵng vi khuốn, khứi thọch cha nỗm gõy bnh P citrophthora 18PMS v P palmivora 17PMS c cỗy vo gia ùa petri cha mụi trng PDA Vi khuốn ứi khỏng c cỗy gúc xung quanh khứi thọch cha nỗm gõy bnh v cỏch vành đïa petri 1cm đāČc gią Ċ điều kiện 30C ngày tiến hành đánh giá khâ 1067 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả kiểm sốt bệnh chảy gơm cam (Citrus sinensis) nëng c ch cỵa vi khuốn ứi vi nỗm bnh Chỵng vi khuốn cũ tớnh ứi khỏng (chỵng tim nởng) c lāu gią sĄ dĀng cho nghiên cău 2.3 Đánh giá hột tính đối kháng vi khuẩn ó tuyn chn Cỏc chỵng vi khuốn tim nởng ó phån lêp đāČc đánh giá hột tính đøi kháng theo phng phỏp cỵa ivkovi & cs (2010) da trờn kớch thc vựng c ch nỗm bnh (ivkovi & cs., 2010) Chỵng vi khuốn tim nởng c ững nuụi cỗy vi nỗm gõy bnh theo kiu ứi xng hai bờn trờn ùa petri cha mửi trng PDA Vi khuốn c cỗy cỏch vnh ùa 1,5cm ùa ứi chng chợ cỗy nỗm bệnh P citrophthora 18PMS P palmivora 17PMS Đïa thí nghim c ỵ iu kin 30C 12 ngy tiến hành thu sø liệu kích thāĉc vùng ăc ch vi nỗm bnh (vựng nỗm bnh khụng phỏt trin) DĆa vào kích thāĉc phân lội hột tính đøi khỏng cỵa cỏc chỵng vi khuốn nghiờn cu Hoọt tớnh đøi kháng đāČc phân loäi theo măc: đøi kháng yếu (> 0-5mm), đøi kháng trung bình (> 5-10mm), đøi kháng mọnh (> 10-15mm), ứi khỏng rỗt mọnh (> 15-20mm) Thớ nghim c lp lọi lổn ứi vi mỳi chỵng vi khuèn 2.4 Định danh chủng vi khuẩn đối kháng ó tuyn chn tin hnh nh danh chỵng vi khn có hột tính đøi kháng, tiến hành phân tích trỡnh t 16S rRNA DNA tựng sứ cỵa cỏc chỵng vi khuèn tuyển chõn đāČc tách chiết bìng GeneJET Genomic DNA Purification Kit (ThermoFisher Scientific) theo hng dộn cỵa nh sõn xuỗt Trỡnh t 16S rRNA c nhõn lờn bỡng cặp m÷i 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3’) 1492R (5'-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3’) Sân phèm PCR đāČc điện di gel agarose 0,8%, tinh säch giâi trình tĆ Kết quâ giâi trình tĆ 16S rRNA cỵa chỵng tuyn chừn c cởn trỡnh t Ngân hàng Gen nhĈ công cĀ Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi) Cây phân lội đāČc xây dĆng bìng phỉn mềm MEGA6 1068 2.5 Nghiên cứu số đặc điểm sinh trưởng chủng vi khuẩn B siamensis LHB15 Tiến hành đánh giá khâ nëng đ÷ng hóa ngn cacbon, khâ nëng yếm khớ, kh nitrate, phõn giõi cellulose, õnh hng cỵa nhit ỷ v pH n khõ nởng sinh trng cỵa chỵng B siamensis LHB15 - Khâ nëng đ÷ng hóa ngn cacbon cỵa B siamensis LHB15 Chỵng vi khuốn B siamensis LHB15 c nuụi cỗy trờn mửi trng LB Sau ũ chuyn tĂng khuèn läc đćn vào øng nghiệm chăa 5ml môi trāĈng khoáng cć bân ((NH4)2SO4 (2,0 g/l); MgSO4.7H2O (0,2 g/l); NaH2PO4.H2O (0,5 g/l); CaCl2.2H2O (0,1 g/l); K2HPO4 (0,5 g/l)) có bù sung ngu÷n cacbon khác nhā: D-glucose, Saccarose, tinh bût, Glycerol Maltose vĉi n÷ng đû 1% Ống đøi øng không bù sung vi khuèn Sau ngày, tiến hành nhó dung dðch Bromothymol blue vào mơi trāĈng, mưi trāĈng chuyển tĂ màu xanh sang màu da cam màu vàng nhät vi khn có khâ nëng đ÷ng hóa ngn cacbon - Khâ nởng s dng nitrate Chỵng vi khuốn B siamensis LHB15 đāČc ni mưi trāĈng LB Sau đị chuyển khn läc đćn vào øng nghiệm chăa 5ml möi trāĈng chõn lõc (meat extract g/l; peptone 10 g/l, KNO3 g/l, pH = 7,0) ng vi khuốn c nuụi cỗy mửi trng chừn lừc c ỵ iu kin 28C ngày Ống đøi øng không bự sung vi khuốn Sau thi gian nuụi cỗy, th hột tính lỉn lāČt vĉi giõt dung dðch thùc thĄ Griess giõt dung dðch thuøc thĄ Diphenylamine Sau bù sung thuøc thĄ Griess, dung dðch nuụi cỗy chuyn mu (ú, hững, da cam hay nõu) biểu thð có nitorite, tăc vi khuèn có khõ nởng kh nitrate Nu dch nuụi cỗy khụng chuyn màu, thêm 1-2 giõt thuøc thĄ Diphenylamin để kiểm tra s cú mt cỵa nitrat Dung dch chuyn mu xanh lam đāČc hiểu vi khuèn không khĄ nitrate - Khâ nëng sinh trāĊng điều kiện yếm khí Chuèn bð øng nghiệm chăa 5ml môi trāĈng chõn lõc (Peptone (2 g/l), NaCl (5 g/l), KH2PO4 (0,3 g/l), Bromothymol blue (1%), Phạm Hồng Hiển, Bạch Thị Điệp, Nguyễn Thị Chúc Quỳnh, Phùng Quang Tùng, Đặng Thị Thanh Tâm pH = 7,0) 0,5ml dung dðch glucose 1% Sau đò tiến hnh cỗy chỵng vi khuốn B siamensis LHB15 vo ứng möi trāĈng Tiếp đến, bù sung lĉp paraffin hỗp kh trỹng dy mm tọo iu kin k khớ v c ỵ iu kin 28C ngày Nếu øng möi trāĈng chuyển tĂ màu tĂ xanh sang màu da cam, màu vàng nhät hay màu xanh nāĉc biển đị vi khn yếm khớ - Xỏc nh khõ nởng phồn giõi cellulose Chỵng vi khuốn B siamensis LHB15 c nuụi cỗy trờn mửi trāĈng khoáng (1 g/l NH4NO3, 0,5 g/l K2HPO4, 0,5 g/l KH2PO4, 0,5 g/l MgSO4.7H2O, g/l NaCl, 0,1 g/l CaCl2, 0,02 g/l FeCl3, 0,05 g/l yeast extract, 15 g/l agar, pH = 7,0) có bù sung 1% Carboxymethyl cellulose (CMC) Cỗy chỗm im vi khuốn mi hoọt hũa trờn ùa petri cha mửi trng ó c chuốn b v ỵ điều kiện 30C Sau ngày, sĄ dĀng thuøc thĄ Lugol để xác đðnh khâ nëng phån giâi CMC cỵa vi khuốn Thớ nghim c lp lọi lổn - nh hng cỵa yu tứ nhit ỷ n khõ nởng sinh trng cỵa vi khuốn Chỵng vi khuốn B siamensis LHB15 c cỗy trờn mửi trng LB c v nuụi cỗy cỏc mc nhit ỷ 22, 25, 30, 37 v 55C Khõ nởng sinh trng cỵa vi khuốn c ỏnh giỏ sau hai ngy nuụi cỗy - nh hng cỵa pH n khõ nởng sinh trng cỵa vi khuốn Chỵng vi khuốn B siamensis LHB15 c cỗy trờn mửi trāĈng thäch đïa LB vĉi măc pH 5, 7, v 11 ỏnh giỏ khõ nởng sinh trng cỵa vi khuốn da trờn sinh khứi cỵa vi khuốn sau hai ngy nuụi cỗy (Nguyn Lồn Dng, 2014) 2.6 ỏnh giá khâ kiểm soát nấm P citrophthora 18 PMS chủng vi khuẩn B siamensis LHB15 điều kiện nh li ỏnh giỏ khõ nởng kim soỏt nỗm P citrophthora 18PMS cỵa chỵng vi khuốn B siamensis LHB15, tin hnh so sỏnh hiu lc kim soỏt nỗm cỵa chỵng ny vi cỏc cụng thc x lý khỏc cam lịng vàng säch bệnh nëm túi Cồy cam c trững bổu cỹng ỗt v giỏ th (2kg giỏ th/bổu) v ỗt c lõy nhim chỵng nỗm P citrophthora 18PMS (7ml dung dch bo t nỗm/bổu vĉi n÷ng đû 104 du đûng bào tĄ/ml) 50 ngày trāĉc xĄ lý Các công thăc xĄ lý đāČc bứ trớ nh sau: Cụng thc 1: Chỵng vi khuốn B siamensis LHB15 c nuụi cỗy ngy trờn giỏ th gọo ó c hỗp kh trựng ọt đến mêt đû 108 cfu/g Hòa 1,1g giá thể gäo cú cha chỵng vi khuốn B siamensis LHB15 vo nc v ti dch vo bổu ỗt ó c lõy nhim bỡng nỗm P citrophthora 18PMS Cụng thc v công thăc đāČc tiến hành tāćng tĆ nhāng thay chỵng vi khuốn B siamensis LHB15 bỡng ch phốm cha nỗm Trichoderma (TRICễ-HCT) (vi lng s dng 0,42 g/bổu) hoc hoọt chỗt Metalaxyl (Acody 35WP) (vi liu lng s dng 0,022 ml/bỉu), tāćng ăng Cơng thăc (đøi chăng) khơng bù sung vi khuèn hay tác nhân ăc chế khác Tin hnh ỏnh giỏ tợ l cỏnh hoa hững mỗt mu cú nỗm Phytophthora ỗt v r cồy cam đāČc đánh giá trāĉc sau xĄ lý 30 45 ngày (Erwin & Ribeiro, 1996) Hiệu lĆc phòng chøng nỗm bnh c tớnh tọi thi im 30 v 45 ngày sau xĄ lý theo công thăc Henderson-Tilton: Ta Cb HQ % 1 100 Ca Tb Trong đò: Ta: Tợ l % cỏnh hoa mỗt mu cú Phytophthora sau xĄ lý (SXL); Tb: Tỵ lệ % cánh hoa mỗt mu cú Phytophthora trc x lý (TXL); Ca: Tợ l % cỏnh hoa mỗt mu cú Phytophthora ứi chng SXL; Cb: Tợ l % cỏnh hoa mỗt mu cú Phytophthora đøi TXL Sø liệu đāČc tính tốn bìng Excel xĄ lý thøng kê bìng phỉn mềm Statistics 9.1 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập tuyển chọn sơ vi khuẩn đối kháng nấm bnh Phytophthora spp T 221 mộu ỗt trững cam thu thêp Ċ Hịa Bình Tiền Giang, chúng tơi tiến hnh phõn lờp c 38 chỵng vi khuốn v ỏnh giỏ s bỷ khõ nởng ứi khỏng vi nỗm P citrophthora 18PMS P palmivora 17PMS (Bâng 1) 1069 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả kiểm sốt bệnh chy gụm trờn cõy cam (Citrus sinensis) ứi vi chỵng nỗm bnh P citrophthora 18PMS cú 3/22 chỵng vi khuốn phõn lờp trờn ỗt Hũa Bỡnh v 1/16 chỵng vi khuốn phõn lờp trờn ỗt Tin Giang cú tim nởng ứi khỏng ứi vi chỵng nỗm bnh P palmivora 17PMS, cú 5/22 chỵng vi khuốn phõn lờp trờn ỗt Hũa Bỡnh v 1/16 chỵng phõn lờp trờn ỗt tin Giang có tiềm nëng đøi kháng Nhā vêy, qua khâo sát s bỷ cú 06 chỵng tim nởng cũ khõ nởng ứi khỏng vi cõ hai chỵng nỗm gõy bnh l B1, B2, B7, LHB15, LHB31 v LHB41 Cỏc chỵng vi khuèn tiềm nëng ngu÷n vêt liệu để đánh giỏ khõ nởng ứi khỏng vi nỗm bnh Bõng Tuyển chọn sơ vi khuẩn đối kháng với nấm bệnh Phytophthora spp Số lượng chủng vi khuẩn đối kháng với Nguồn đánh giá Tổng số chủng vi khuẩn Khả đối kháng P citrophthora 18PMS P palmivora 17PMS Mẫu đất Hịa Bình 22 + - 19 17 Mẫu đất Tiền Giang 16 + 1 - 15 15 Ký hiệu chủng có tiềm đối kháng LHB31, LHB41, B1, B2, B7 LHB15 Ghi chú: (+): Có tiềm đối kháng; (-): Khơng có tiềm đối kháng Ghi chú: A: Chủng vi khuẩn khơng có tiềm đối kháng, B: Chủng vi khuẩn có tiềm đối kháng với nấm bệnh Hình Tuyển chọn sơ chủng vi khuẩn có khâ đối kháng với nấm P citrophthora 18PMS Bâng Hột tính đối kháng với nấm bệnh Phytophthora spp chủng vi khuẩn tiềm sau 12 ngày đồng ni cấy Chủng Kích thước vùng ức chế nấm bệnh (mm) Đánh giá hoạt tính đối kháng P citrophthora 18PMS P palmivora 17PMS P citrophthora 18PMS P palmivora 17PMS LHB 15 15,0 20,0 Mạnh Rất mạnh LHB 31 - 9,0 - Trung bình LHB 41 12,5 9,5 Mạnh Trung bình B1 17,0 10,0 Rất mạnh Trung bình B2 - 8,0 - Trung bình B7 13,0 10,0 Mạnh Trung bình Ghi chú: (-): Khơng đối kháng, (> 0-5mm): Đối kháng yếu, (> 5-10mm): Đối kháng trung bình, (> 10-15mm): Đối kháng mạnh, (> 15-20mm): Đối kháng mạnh 1070 Phạm Hồng Hiển, Bạch Thị Điệp, Nguyễn Thị Chúc Quỳnh, Phùng Quang Tùng, Đặng Thị Thanh Tâm Hình Biểu tính đối kháng với nấm bệnh P citrophthora 18PMS (A) P palmivora 17PMS (B) chủng LHB15 sau 12 ngày đồng nuôi cấy Bâng Kết quâ định danh chủng vi khuẩn đối kháng phân tích trình tự gen 16S rRNA Chủng B1 Tỉ lệ trình tự so sánh (%) Tỉ lệ tương đồng (%) 100 97,92 Trình tự tương đồng NCBI JN700086.1 Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum strain R08 B7 100 99,98 CP029069.1 Bacillus amyloliquefaciens ALB65 LHB41 99 97,78 KM853034.1 Bacillus amyloliquefaciens strain WP1O4 LHB15 99 98,93 MG722818.2 Bacillus siamensis SB1001 0,5 Hình Cây phân lội chủng LHB15 dựa trình tự 16S rRNA 1071 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả kiểm sốt bệnh chảy gơm cam (Citrus sinensis) 3.2 Đánh giá hột tính đối kháng ca chng vi khun ó tuyn chn T 06 chỵng vi khn có tiềm nëng, chýng tơi tiếp tĀc tiến hành đánh giá hột tính đøi kháng theo phāćng pháp ững nuụi cỗy trờn ùa petri (Bõng 2) Trong 06 chỵng chừn lừc cú chỵng vi khuốn (LHB15, LHB41, B1, B7) thể tính đøi kháng trung bình đến rỗt mọnh vi cõ hai chỵng nỗm P citrophthora 18PMS v P palmivora 17PMS sau 12 ngy ững nuụi cỗy trờn mửi trng PDA Trong ũ chỵng LHB15 (Hỡnh 2) biu hin ứi khỏng mọnh v rỗt mọnh, vựng c ch nỗm bnh ọt 15mm ứi vi P citrophthora 18PMS v 20mm ứi vi P palmivora 17PMS Chỵng LHB31 v B2 khửng ứi khỏng vi nỗm P citrophthora 18PMS, ứi kháng trung bình vĉi P palmivora 17PMS vĉi vùng ăc ch nỗm bnh tng ng l 9mm v 8mm (Bõng 2) 3.3 Định danh chủng vi khuẩn đối kháng tuyển chọn DĆa phân tích trình tĆ 16S rRNA, chýng tửi xỏc nh cỏc chỵng vi khuốn tim nởng (B1, B7, LHB15, LHB41) l cỏc chỵng thuỷc chi Bacillus (Bõng 3, Hỡnh 3) Trong ũ, chỵng vi khuốn B1, B7, LHB41 tāćng đ÷ng cao vĉi lồi (A) Bacillus amyloliquefaciens, chỵng vi khuốn LHB15 tng ững vi loi Bacillus siamensis Nh vờy, cỏc chỵng thu thờp c u thuỷc chi Bacillus Da vo cõy phõn loọi, chỵng LHB15 cho hoọt tớnh ứi khỏng mọnh vi nỗm gõy bnh c xỏc đðnh đặt tên loài Bacillus siamensis LHB15 (B siamensis LHB15) Các nghiên cău vi khuèn B siamensis cho thỗy loi vi khuốn ny thng cũ c tớnh khỏng nhiu loọi nỗm bnh trờn cõy trững (Gorai & cs., 2021; Park & cs., 2021) Chỵng vi khuốn B siamensis LHB15 c ỏnh giỏ l chỵng tim nởng tiến hành nghiên cău såu hćn 3.4 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn B siamensis LHB15 Tin hnh nuụi cỗy, nhuỷm gram t bo, chýng tửi xỏc nh c hỡnh thỏi khuốn lọc chỵng vi khuèn B siamensis LHB15 vi khuèn gram dāćng (Hình 4D) Khn läc có màu tríng, l÷i, khơng trịn, bề mặt bóng, khơng nhẵn, khơng tiết síc tø mưi trāĈng, kích thāĉc 2-5mm (sau 72h, mưi trāĈng NA, Ċ t = 30C) (Hình 4B) Tế bào hình que ngớn, kớch thc (1,85-1,92) ì (0,64-0,71)àm Khuốn lọc rỡa rëng cāa vàng nhät, bề mặt nhën nuöi mưi trāĈng LB đặc (Hình 4A) (B) (C) (D) Hình Hình thái khuẩn läc mơi trường LB (A), môi trường NA (B), tế bào (C) nhuộm gram (D) chủng vi khuẩn B siamensis LHB15 Bâng Đặc điểm sinh học chủng B siamensis LHB15 Chỉ tiêu theo dõi Đặc điểm Khả đồng hóa cacbon Có khả đồng hóa nhiều nguồn cacbon khác D-glucose, Saccarose, tinh bột, Glycerol Maltose Khả phát triển điều kiện yếm khí Khơng có khả sinh trưởng điều kiện yếm khí Khả khử nitrate Có khả khử nitrate Khả phân giải cellullose Có khả sinh enzyme phân giải cellulose 1072 Phạm Hồng Hiển, Bạch Thị Điệp, Nguyễn Thị Chúc Quỳnh, Phùng Quang Tùng, Đặng Thị Thanh Tâm Hình Khâ đồng hóa D-glucose (A), khử nitrate (B), phân giâi cellulose (C) chủng vi khuẩn B siamensis LHB15 Bâng Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy độ pH đến sinh trưởng vi khuẩn B siamensis LHB15 (sau ngy nuụi cỗy) Kh nng sinh trng Nhiệt độ (C) 22 - 25 + 30 ++ 37 +++ 57 - Giá trị pH mơi trường Kích thước khuẩn lạc (mm) 4,00 5,00 2,17 11 Ghi chú: (-): Sinh trưởng yếu; (+): Sinh trưởng trung bình; (++): Sinh trưởng mạnh; (+++): Sinh trưởng mạnh Bâng Hiệu lực phòng chống nấm P citrophthora 18PMS đất chủng vi khuẩn B siamensis LHB15 Công thức Lượng bổ sung/bầu B siamensis LHB15 1,1g Trichoderma Tỉ lệ cánh hoa màu đất trồng cam (%) TXL 30 ngày SXL 45 ngày SXL 30 ngày SXL 45 ngày SXL 54,33a 49,20b 37,20c 36,52 63,08 a b b 28,56 48,15 74,98 82,39 - - 0,42g 48,67 49,60 46,80 0,022ml 52,67a 18,80c 17,20d a 47,67 a 68,00 88,40 a CV% 18,01 18,25 14,85 LSD0,05 8,40 7,77 6,46 Metalaxyl Đối chứng - Hiệu lực (%) Ghi chú: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê với P