TÓM TẮTSâm Ngọc Linh Panax vietnamensis Ha et Grushv., là một loại dược liệu quý, có nhiềutác dụng có lợi như chống ung thư, chống lão hóa tế bào hay ức chế căng thăng tâm lý.Nghiên cứu
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH
KHOA KHOA HỌC SINH HỌC
KHAO SAT ANH HUONG CUA CHAT DIEU HÒA SINH TRUONG DEN QUA TRINH VI NHAN GIONG SAM NGOC LINH
(Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOCSinh viên thực hiện : PHAM TRAN XUAN ĐIỆP
Mã số sinh viên : 1916026Niên khóa : 2019 - 2023
TP Thủ Đúc, 03/2024
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH
KHOA KHOA HỌC SINH HỌC
KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP
KHAO SÁT ANH HUONG CUA CHAT DIEU HÒA SINH TRUONG
DEN QUA TRÌNH VI NHÂN GIÓNG SAM NGỌC LINH (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.)
Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện
ThS NGUYEN THỊ QUYEN PHAM TRAN XUAN ĐIỆP
TP Thu Đúc, 03/2024
Trang 3LỜI CẢM ƠN
ĐỀ hoàn thành được khóa luận này, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến BanGiám Hiệu và tất cả quý thầy cô Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh cùng vớitất cả quý thầy cô trong khoa Khoa học Sinh học đã trực tiếp giảng dạy, trang bị nhữngkiến thức bồ ích trong suốt quá trình học tập
Em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Nguyễn Thị Quyên đã luôn nhắcnhở, giúp đỡ, định hướng, tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoànthành khóa luận tốt nghiệp
Em cũng xin được chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn sinh viên học tập vàlàm khóa luận tốt nghiệp tại phòng Nuôi cấy mô tế bào thực vật Bio203 và phòng Dượcliệu Bio309, tòa nhà Al khoa Khoa học Sinh học, Trường Dai học Nông Lâm TP HồChí Minh đã nhiệt tình hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thựchiện khóa luận tốt nghiệp
Và đặc biệt hơn cả, con xin cảm ơn công lao sinh thành, dưỡng dục của ba mẹ,cùng với sự động viên giúp đỡ của bạn bè và tất cả những người thân đã luôn bên cạnhtrong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp
Cuối cùng em xin kính chúc quý thầy cô, gia đình, anh chị và bạn bè luôn mạnhkhỏe và hạnh phúc trong cuộc sông.
Trang 4XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN
Tôi tên Phạm Trần Xuân Điệp, MSSV: 19126026, Lớp: DH19SHD thuộc ngành Côngnghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là khóaluận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiêncứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước
hội đồng về những cam kết này
Tp Hồ Chi Minh, ngày 28 tháng 02 năm 2024
Người viet cam đoan (Ký và ghi rõ họ tên)
Phạm Trần Xuân Điệp
ii
Trang 5TÓM TẮT
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), là một loại dược liệu quý, có nhiềutác dụng có lợi như chống ung thư, chống lão hóa tế bào hay ức chế căng thăng tâm lý.Nghiên cứu này được thực hiện nhằm khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinhtrưởng đến khả năng tao mô seo, phát sinh phôi và sự tăng trưởng chdi từ mẫu sâm NgọcLinh dé tạo ra nguồn vật liệu nhanh chóng với quy mô lớn bằng phương pháp nuôi cấy
mô Mẫu sâm Ngọc Linh được nuôi cấy trên môi trường MS bồ sung kết hợp 2,4-D vàBAP ở các nồng độ khác nhau dé khảo sát khả năng tạo mô sẹo Mô sẹo được chuyềnsang môi trường MS (0,7 mg/l IBA) bố sung TDZ ở các nồng độ khác nhau dé khảo sát
sự phát sinh phôi Phôi tiếp tục được chuyền vào môi trường MS bồ sung kết hợp BAP
và NAA ở các nồng độ khác nhau cho sự tăng trưởng chéi Kết quả sau 8 tuần cho thấy,mẫu sâm Ngọc Linh được nuôi cấy trên môi trường MS có bồ sung 1,5 mg/1 2,4-D cho
tỉ lệ tạo mô sẹo tốt nhất là 90% và thời gian cảm ứng tạo mô sẹo ngắn nhất là 14 ngày
Mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS (0,7 mg/l IBA) có bé sung 0,8 mg/l TDZ cho
sự phát sinh phôi tốt nhất, sau 8 tuần nuôi cay tỉ lệ phát sinh phôi dat 69,29%, số phôitrung bình là 11,25 phôi/mẫu Môi trường MS có bồ sung 1 mg/l BAP kết hợp với 1mg/l NAA thích hợp cho quá trình tạo chỗi từ phôi sim Ngọc Linh với tỉ lệ phát sinhchéi sau 8 tuần nuôi cay là 83,51%, số chồi trung bình là 5,7 chéi/mau và chiều cao chỗitrung bình là 3,57 cm.
Từ khóa: Panax vietnamensis Ha et Grushv., mô sẹo, phôi, chéi, 2,4-D, BAP, TDZ,NAA.
ili
Trang 6Ngoc Linh ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), a valuable medicinal herb, exhibits numerous beneficial effects such as anti-cancer properties, anti-aging cell properties, and the ability to inhibit psychological stress This study aimed to investigate the impact of growth regulators on callus formation, embryogenesis, and shoot development from Ngoc Linh ginseng samples, aiming to quickly generate large-scale materials employing tissue culture Ngoc Linh ginseng samples were cultured on MS media supplemented with various concentrations of 2.4-D and BAP to assess callus formation capability The generated callus was then transferred to MS medium (0.7 mg/l IBA) supplemented with different concentrations of TDZ to study embryogenesis Subsequently, embryos were transferred to MS media supplemented with varying concentrations of BAP and NAA for shoot development After 8 weeks, results revealed that Ngoc Linh ginseng samples cultured on MS media supplemented with 1.5 mg/1 2.4-
D exhibited the highest callus formation rate of 90% and the shortest induction time of
14 days Callus cultured on MS medium (0.7 mg/l IBA) supplemented with 0.8 mg/l TDZ resulted in the highest embryogenesis rate, reaching 69.29%, with an average of 11.25 embryos per sample MS medium supplemented with 1 mg/l BAP combined with
1 mg/l NAA was found to be suitable for shoot development from Ngoc Linh ginseng embryos, After 8 weeks of culture, the shoot generation rate of 83.51%, with an average
of 5.7 shoots per sample and an average shoot height of 3.57 cm.
Keywords: Panax vietnamensis Ha et Grushv., callus, embryo, shoots, 2.4-D, BAP, TDZ, NAA.
iv
Trang 7MỤC LỤC
LOI CAM ƠN 5-52 SE22221221221221212122112111112121121121211112111111111211121 1 re iXÁC NHAN VA CAM DOAN ( 0 scesssssssssesessesesecsesecscecsecscsececsesecacsececsesecseseeesscecaeaeees iiTÓM 00 ©2222 2222222122112212211211221211211221121121112112112112111112111121121121221 1e iiiABSTRACT -©5225222222E2212211211211121121121121111211111112111111211121 2121112 iv (a VvDANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TẮTT 2- 22222EE+EE2EE+EE22EE2EE222222E22e22xerxee viiiTẠP BH E01 ueeeioieieoniaoGtraogigsgosGtgisiBiisittgidbsisgfitogidrsogieso ixDANH SÁCH CAC HÌNH 22 2SS22E222E22E22E122122112212112212112112212211221 2122 xe xCHƯƠNG 1 MO DAU coeoeoceoccsccscssessessessesseeseesescseseeeesestsetsessesiessessetiessessesseseeeseesees |
1.2 oán y.Ắ 11:3: NOI dune: thie HIỂT Ha se tui weet sews elmer ome ie eS 2CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU 0 ccccccsscssessesseesessetseeseesetsessessessessessessessesseess 32.1 Giới thiệu về cây sâm Ngoc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 32.1.1 Phan 0084.043 32.1.2 Dac Giém phar 06 na 444 Ả 3
ON RON cha na a a: 32.1.4 Đặc điểm sinh thái cess eseeeeseessssesseesuesseesessieesssusesessesssessuseeeesessueeees 52.1.5 Tac áo 52.1.6 Thành phần hóa học 2-22: ©22©22+2222EE+2EE22EEEEEEE2EE22EE22EE2EEEEEEEErrrxrrrrrrrev 62.2 Sơ lược về nuôi cay 347 nâng | ố ố ẽ ố 62.2.1 Tổng quan về nuôi cây mô tế bào thực vật -2 2+ ©22E+2E22E22EezEczxzreced 62.2.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô 2-2-2 22222EE2EE22E+SEE2EEEEEEEEEE2EEEEE2EESEErrrrrrree 62.2.1.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật -¿-z22z+2z+csz2 Ỹ2.2.2 Một số phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật -22-z52-z55+2 73.2.2.1 Nuôi cây đỉnh sinh HưỡNg esa cecsssceerscircmenrermeenurenaneneieneenmnecnraronsie 72.2.2.2 Nuôi cấy mô SẹO -2-©22©222222E2EEE22112117112212111211211211211211211211211 11 1e 12.2.3 Một số hiện tượng bat thường trong nuôi cây mô tế bào thực vật 72.2.3.1 Hiện tượng hóa nâu mẫu và môi trường nuôi cấy - 2 225522522 8
Trang 82.2.3.2 Hiện tượng thủy tỉnh thỂ - 2-52 2S+SS‡2E92E92E2212322112122112112121212121 2 cce §2.2:4, Kha đãng phat Sith) CO Quan sxeeseseeesbisniisiitssixeoiigiSEA49009191953560910130000005909820 82.2.4.1 Sự hình thành va phát triển của mô sẹo -2 2 2222222++2z2z++zzzzz+zzxe2 §2.2.4.2 Khái niệm và quá trình hình thành phôi vô tính - -+ =+<c++ 9 2.2.4.3 Sự phát sinh và biệt hóa mô của phôi vô tính -. - eect eects 92.2.5 Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng -2 222z+2z+22++2+zz2 102.2.5.1 Ảnh hưởng của auXin - 22 2¿222222222E1222E222122E122112211221122112212221 22 xe 102.2.5.2 Ảnh hưởng của cytokinin 2-22 ©22+2++2E£+EE£2E2EE2EE2EEEEErExerkrrkrerree 112.3 Tinh hình nghiên cứu trong va ngoài nước sâm Ngọc Linh - 11CHƯỚNG3, VAT LIẾU Và PEGS FHADsesesnoiinanlieediansiionsgieisedsgin 153.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - 2: 2¿222+2++2E++E++£E+2E+zExzrxzrxerrrzrxers 153.2 Vat liu nghién UU a 153.2.1 Đối tượng nghiên COU eccccccccssessessessesseesessesseesessessessessessessessesstsetseesseeseeseees 15
EL | ee 153.2.3 Hóa chat sử dung trong nghiên cứu - + ¿©22©52+5++x2x2Eezxzxerxerrerrrres 153.2.4 MOi truOng nu maăỘOOODỒ i53.2.5 Điều kiện nuôi cấy 2-22 222222 2222231271222112211211211211211 21121121121 1e 163.3 Ph0ffÐriliápiri ei Gia Oi s,s sk ccs eco arn shea siaraclaled sa stiswsseSansbileds E40 0a6lseoslliecssee 17
3.3.1 Nội dung 1: Khao sát sự ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BAP đến khả năng tạo
MO SEOSAHT NOC DANG se sssssessceisberhosiiEsseauA.EDOisuiSLiE010ugán8n856us0E8050000/A10u0.08016uaim282081-0g2d5E 173.3.2 Nội dung 2: Khao sat sự ảnh hưởng của TDZ đến sự phát sinh phôi từ mô sẹo sâm01:0 183.3.3 Nội dung 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của BAP kết hợp với NAA đến sự tăng trưởngchi từ phôi sâm Ngọc Linh 2- 2 ©22+2222E22E22EE22E22E122322212212221221221122121222x e2 19
CE gf nh nhghgnugữngthgdgãguG:ugng2/otu162d0.4014gg t0 20CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -2-©2¿+2+2222E22E22E222222222222e2 214.1 Nội dung 1 Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BAP đến khả năng tạo mô sẹo từ
Sâm Nooo THHHiseiseisesiasssissiiietiSSiDSERSMGSSSESIRGLASSSESIS.ĐIGSESSES4GS1E4G438380g43S48Q43314314838440985.0183/80 21
4.2 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng TDZ đến sự phát sinh phôi từ mô sẹo sâm
BSUS Gi CTH TA sa caseseern tsetse casein aide ancl el te nthe lars a rt ili ent tance 254.3 Anh hưởng của BAP kết hop NAA đến sự tăng trưởng chdi từ phôi sâm Ngọc Linh
VI
Trang 9CHƯƠNG 5 KET LUẬN VA DE NGHỊ, 2-72 +s+E+E2E£ESEE2EEEE2EEEEEEEEErErrrrkee 32{5 nố aỶ 32J0 32TÀI LIEU THAM KHẢO 2-22 222222EE2EE22E222122E22212211221221221127122112212122 2 33T0 ac 38
vil
Trang 10DANH SÁCH CAC CHU VIET TAT
Trang 11DANH SÁCH CÁC BANG
Bảng 3.1 Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) - 16Bảng 3.2 Ảnh hưởng của 2,4D kết hợp với BAP đến khả năng tạo mô sẹo theo từngOCC CG creates ee ee 17Bang 3.3 Anh hưởng của TDZ đến sự phát sinh phôi từ mô seo sâm Ngọc Linh 18Bảng 3.4 Ảnh hưởng của NAA kết hợp với BAP đến sự tăng trưởng chôi theo từng
Bang 4.1 Ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng tạo mô sẹo - 2-22 52 22Bang 4.2 Anh hưởng của BAP đến khả năng tạo mô sẹo -5-©22- 55+: 22Bang 4.3 Anh hưởng của 2,4-D kết hop với BAP đến khả năng tao mô sẹo 23Bang 4.4 Thời gian cảm ứng tạo mô sẹo sau 6 tuần nuôi cấy -5¿ 24Bảng 4.5 Sự phát sinh phôi sau 8 tuần nuôi cấy -2 22©22+2z+2++z+zzz++zxzex 26Bang 4.6 Ảnh hưởng của yếu tố nồng độ BAP đến số chdi trung bình và chiều cao chỗồitrufip DHimaesretriritsetfeVp50BURDLA4602f2atit0i0nElBffbltlip9:gr4bisttButsstiodtbpebtbbibfo.gss4dfsaeniuei 29Bang 4.7 Ảnh hưởng của yếu tổ nồng độ NAA đến số chồi trung bình và chiều cao chồi0010): 29Bảng 4.8 Ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với NAA đến số chồi trung bình vàchiéu cao choi trung Bink 0777 30
1X
Trang 12DANH SÁCH CÁC HÌNH
?001089010.) 000.20 11 3Hình 2.2 Một số nghiên cứu chính về sâm Ngọc Linh qua các giai đoạn (Hà va ctv,DU) sơ cong s22 057.2 net cheg oto fc Zru án đc ti Ðg nao cimer free r2 e0 12Hình 4.1 Mô sẹo sau 3 tuần và 6 tuần nuôi cấy -2-©2222++2z+2zxzzxerrrerxeer 25Hình 4.2 Phôi sau 8 tuần nuôi cấy -22-©22-2222222+22EE222E22EEEEErrrrrrrrrrrrrrree ayHình 4.3 Ảnh hưởng của BAP kết hợp với NAA đến ti lệ phát sinh chồi từ phôi sâmNgọc Lái e9 1166 01056 431163568 33806568 D3998 GEGSEEXSELSEGESSXS3SSSkSSkESSEGSEXSGSUESSSSISIEUESGEESSUEB 28Hình 4.4 Choi sau 8 tuần nuôi cấy 22 22©22222222212221222122121172112221 212 ezEve 31
Trang 13CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Nhân sâm là một dược liệu quý đã được sử dụng từ lâu ở nhiều khu vực như Châu
Mỹ (Panax quinquefolius) hay các nước Đông A, đặc biệt là ở Hàn Quốc và Trung Quốc(Panax ginseng) nhan sâm được coi là một loại thần dược trong việc duy trì sinh lực vàthé chất Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) được tìm thay ở khu vựcnúi Ngoc Linh thuộc hai tinh Kon Tum va Quảng Nam là một loài thuộc chi Panax.
Những kết quả nghiên cứu mới nhất cho thấy danh sách saponin của sâm NgọcLinh lên tới 52 loại (Đức và ctv, 1993, 1994a; Vân và ctv, 2015) Hoạt chất chính cótrong sâm Ngọc Linh là ginsenosid (Yamasaki, 2000), có nhiều tác dụng có lợi nhưchống ung thư (Konoshima và ctv, 1999) và tác dụng ức chế căng thăng tâm lý(Yobimoto và ctv, 2000) Ngoài ra còn có các acid amin, acid béo, các nguyên tố đalượng và vi lượng.
Nguồn cung sâm Ngọc Linh hiện tại rất khan hiếm và điều này được cho là dophạm vi môi trường sống hẹp, cây tự nhiên sinh trưởng và phát triển rất chậm cùng với
sự khai thác quá mức của loài này Vì vậy sâm Ngọc Linh được xếp vào loài có nguy cơtuyệt chủng (Sách đỏ Việt Nam, 1996).
Một trong những cách thiết thực và hiệu quả nhất dé giải quyết van dé nan giải
về nguồn cung hiện nay là nuôi cấy sâm Ngọc Linh trong điều kiện in vitro, nhằm tao
ra nguồn giống nhanh chóng với số lượng lớn Xuất phát từ những giá trị thực tiễn trên
đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình nhân giống
sâm Ngọc Linh” được thực hiện.
Trang 141.3 Nội dung thực hiện:
Nội dung 1: Anh hưởng cua 2,4-D két hop voi BAP dén kha nang tao m6 seo tu
cu sam Ngoc Linh.
Nội dung 2: Ảnh hưởng của TDZ đến sự phát sinh phôi sâm Ngọc Linh
Nội dung 3: Ảnh hưởng BAP kết hợp với NAA đến sự tăng trưởng chỗi từ phôisâm Ngọc Linh.
Trang 15CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU
2.1 Giới thiệu về cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
2.1.1 Phân loại khoa học
Loài : Panax vietnamensis Ha et Grushv.
Tên khác: Sâm Việt Nam, sâm K5, cây thuốc giấu
Tên nước ngoài: Vietnamese ginseng Hình 2.1 Cây Sâm Ngọc Linh 2.1.2 Đặc điểm phân bố (Nguôn: baotonduoclieu.vn).
Sâm Ngọc Linh được tìm thấy ở trên núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Kon Tum vàtỉnh Quảng Nam Cây sâm bắt đầu xuất hiện ở độ cao từ 1.200 m trở lên, đạt mật độ caonhất ở khoảng từ 1.700 — 2.000 m dưới tán rừng già Từ năm 2000 trở lại đây, Viện Dượcliệu tiễn hành tái điều tra về điều kiện khí hậu, thé nhưỡng va đặc điểm sinh thái cây ởvùng trồng sâm đưới tán rừng tự nhiên đã cho thấy, hiện nay chỉ có thể tìm thấy sâmNgọc Linh còn sót lại ở độ cao 1900 — 2200 m, song cũng rất hiếm Cây trồng dưới tánrừng tự nhiên ở độ cao 1800 — 1900 m trong hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum có độ tánche của rừng là 70 đến 90% mới phù hợp với độ sinh trưởng và phát triển tốt (NguyễnThượng Dong và ctv, 2007).
2.1.3 Đặc điểm hình thái
Theo Nguyễn Thượng Dong và ctv (2007), thì sâm Ngọc Linh là cây thân thảo,
sống lâu năm, cao 40 — 60 cm, đôi khi trên 1 m Thân rễ nạc, đường kính 1 - 3,5 cm,chiều dài tùy theo số năm sinh trưởng, màu vàng nhạt hay màu vàng dat, có nhiều đốt,mang những vết sẹo do thân lụi hàng năm để lại, mỗi vết tương đương với một năm tuổi.Thân rễ mang nhiều rễ con và những vét nhăn dọc, dễ bẻ gãy, mùi thơm nhẹ, vị đắnghơi ngọt Ở cuối thân rễ có rễ củ thường ít phát triển, có dạng con quay, hình trụ, đôi khi
Trang 16có dạng hình người, màu vàng nhạt, mang nhiều rễ con và có vân ngang Cây sâm trồng
có rễ củ phát triển hơn
Thân mọc thắng đứng, màu xanh hoặc hơi tím, đường kính 5 — 8 mm, thườngrụng hằng năm sau mùa sinh trưởng Tuy vậy, đôi khi có 2 — 3 thân vẫn tồn tại vài năm.Thân rễ có thể phân nhánh nhiều lần và hình thành một bụi sâm nhưng rất hiếm
Lá kép hình chân vịt, mọc ở đỉnh thân Cuống lá kép dài 2 — 12 cm, mỗi lá képthường có 5 lá chét hình trứng ngược, hình mác hoặc bầu dục, mép khía răng cưa, đầu
lá nhọn, đôi khi có mũi nhọn, gốc lá hình nêm Lá chét ở giữa lớn nhất dài 15 cm, rộng
3 — 5 em Gan lá hình lông chim, thường có 10 cặp, gân phụ hình mạng Phién lá màuxanh lục, mảnh, dé rách, có nhiều lông cứng đài 1 — 2 mm, mặt đưới ít hon Cây nảymam từ hạt chỉ có 1 lá kép với 5 lá chét, năm thứ 3 da số 2 lá kép, năm thứ 4 da số 3 lákép, năm thứ 5 và 6 đa số 4 — 5 lá kép, rất hiếm gặp cây 6 lá kép
Cụm hoa thường xuất hiện ở cây có 3 lá kép trở lên Cuống cụm hoa đài 10 — 12
cm mang một tan đơn ở tận cùng, đôi khi có thêm 1 — 4 tán phụ hay một hoa don ở phía
dưới tán chính Mỗi cụm hoa có 50 — 120 hoa, cuống hoa dài 1 — 1,5 em Hoa màu vànglục nhạt, đường kính 3 — 4 mm, gồm 5 lá đài hợp thành hình chuông, trên chia thành 5răng nhỏ, hình tam giác, 5 cánh hoa, 5 nhị màu trắng Bao phấn hình xoan, đính lưng,
dia hoa hơi lồi Bầu cao 1 — 1,5 mm, có 2 lá noãn Hoa thường nở vào buổi sáng từ 9
đến 11 giờ Lúc này nhiệt độ không khí thường khoảng từ 18 — 20°C và độ âm từ 85 —90% Hoa nở dan từ ngoài vào và từ đưới lên Đài hoa rụng trong khoảng 1 — 2 ngày saukhi nở và tán bắt đầu kết quả Mùa hoa thay đồi tùy theo vùng nhưng thường bat đầu từtháng 4 đến tháng 6
Quả mọng, khi chín màu đỏ tươi, đa phần có chấm đen ở đỉnh như Nhân sâm,một số quả không có cham den ở đỉnh như quả Tam thất Qua sâm có 1 6 1 hạt và hiếmgặp quả 2 ô 2 hạt, hạt hình thận, một số ít có hình cầu det chứa 2 hạt, nhưng còn có cảquả 3 ô 3 hạt Mỗi chùm hoa trung bình có từ 20 đến 30 quả, trọng lượng trung bình củamột quả là 200 mg Đối với quả sâm Ngọc Linh quả nào khi có chấm đen ở đỉnh thì mọcmam còn những qua nào không có cham den ở đỉnh thì không nảy mam Trên một bôngcàng có nhiều quả có 2 hạt và 3 hạt thì hệ số nhân giống càng cao Mùa quả từ tháng 7đến tháng 9 Quả tập trung ở trung tâm của tán Sau hai tháng, quả bat đầu chuyên từmàu xanh đên màu xanh thâm, vàng lục rôi đỏ cam và đỏ tươi với 1 châm đen ở trên
Trang 17đỉnh quả Hạt màu trắng ngà hay màu vàng nhạt, dài 6 — 8 mm, rộng 5 — 6 mm, day 2
mm, bề mặt lồi lõm Khối lượng của 1 hat tuoi là 95 mg (Trần Thị Liên và ctv, 2020).2.1.4 Đặc điểm sinh thái
Sâm Ngọc Linh là loại cây đặc biệt ưa am và ưa bóng, thường mọc rải rác haytập trung thành từng đám nhỏ dưới tán rừng kín thường xanh cây lá rộng, đôi khi xen cảcây lá kim, độ tán che có thể lên tới 80% hoặc hơn Môi trường nơi sâm mọc luôn amướt, thường xuyên có mây mù Nhiệt độ không khí trung bình ước tính từ 15 đến 18°C,lượng mưa xấp xỉ 3.000 mm/năm Dat rừng ở đây được tạo thành do lá cây mục lâungày, có màu đen, tơi xốp, hàm lượng mùn cao và dường như chứa nhiều nước SâmNgọc Linh sinh trưởng mạnh trong mùa xuân — hè Mùa hoa quả bat đầu từ tháng 5 đếntháng 10, cây ra hoa và quả tương đối đều hàng năm Sau khi quả chín rụng xuống đất,tồn tại qua mùa đông khoảng trên 4 tháng và sẽ nảy mầm vào đầu mùa xuân năm sau.Quan sát quan thé sâm Ngọc Linh mọc hoang dai, thay trong cùng một đám có nhiềucây ở các lứa tuổi khác nhau Điều đó chứng tỏ sâm Ngọc Linh có khả năng tái sinh tựnhiên từ hạt khá tốt (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004)
2.1.5 Tác dụng dược lý
Theo tiễn sĩ Nguyễn Bá Hoạt, Phó viện trưởng Viện Dược liệu Việt Nam, nhữngkết quả nghiên cứu dược lý thực nghiệm sâm Ngọc Linh đã chứng minh tác dụng chốngstress vật lý, stress tâm lý và tram cảm, kích thích hệ miễn dịch, chống oxi hóa, lão hóa,phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan
Theo dược sĩ Đào Kim Long, sâm Ngọc Linh có những tính năng tuyệt hảo nhưtăng lực, phục hồi sự suy giảm chức năng giúp cho tình trang của cơ thé trở lại bìnhthường, kháng các độc tố gây hại tế bào, giúp kéo dài sự sống của tế bào và tăng các tếbào mới Đặc biệt, sâm Ngọc Linh có những tính năng mà sâm Triều Tiên và sâm TrungQuốc không có là tinh kháng khuẩn, chống tram cảm, giảm lo âu, chống oxi hóa và hiệplực tốt với thuốc kháng sinh, thuốc trị bệnh tiểu đường
Về độc tính đã nghiên cứu thay với liều 34 g/kg thể trọng của bột chiết toàn phan
rễ củ sâm Ngọc Linh và với liều 10,6 g/kg thé trọng của saponin toàn phan của rễ củsâm Ngọc Linh đều không gây trên súc vật thực nghiệm những triệu chứng nào ngộ độc.Những thí nghiệm tác dụng trên hệ thần kinh trung ương, tác dụng tăng lực, tăng sứcbền của cơ thể, trên nội tiết sinh dục, trên hệ tim mạch đều cho những kết quả gầnhay tương đương với khi thí nghiệm với sâm Triều Tiên Tuy nhiên, sâm Ngọc Linh
Trang 18không gây tăng huyết áp như sâm Triều Tiên Hiện nay, sâm Ngọc Linh hầu như không thấy được tiêu thụ và sử dụng dưới rễ củ đơn độc mà được sử dụng phối hợp với nhiều
vị thuốc khác trong một thang thuốc hay một dạng bào chế như viên, nước, siro vớiliều 2 — 6 g một ngày (Đỗ Tat Lợi, 2006)
Ngoài các tác dụng dược lý trên, PGS.TS Nguyễn Thượng Dong (2006), cũng
đã chỉ ra sâm Ngọc Linh còn có tác dụng chống phóng xạ, kháng viêm và giảm đau Tácdụng bảo vệ gan và gia tang hàm lượng cytochrom P450 trong vi thé gan
2.1.6 Thành phần hóa học
Kết quả nghiên cứu từ các nhà khoa học đều chỉ ra rằng, trong sâm Ngọc Linh có
chứa tới 52 loại saponin (Duc và ctv, 1993, 1994a; Van và ctv, 2015) Đặc biệt, saponin
loại ocotillol cao đáng ngạc nhiên, trong đó thành phần saponin M-R2 trong sâm NgọcLinh, có tác dụng chống stress va chống ung thư (Duc va ctv 1993, 1994a, 1994b, 1999)
Trong sâm Ngoc Linh đã xác định được 17 acid béo từ 8 — 20 cacbon, trong đó
chiếm tỉ lệ lớn nhất là acid linoleic (40,04%), acid palmitic (29,62%), acid oleic(13,26%), acid stearic (4,48%) va acid linolenic (2,61%) Dac biét acid linoleic valinolenic là những chất có tác dụng chống lão hóa tế bào (antioxydant)
Bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng đã xác định được 18 loại acid amin Thànhphan này bao gồm đủ 8 acid amin cần thiết cho cơ thé, một số acid amin có tỉ lệ rất caonhư arginin (46,66%), lysin (17,90%) và trytophan (10,20%) đã được xác định có tínhchống lão hóa tế bào
Ngoài ra, cũng đã xác định được 20 nguyên tố đa lượng và vi lượng của phan rễ
củ sâm Ngọc Linh; các hợp chat sterol như B-sitosterol và daucosterin; hợp chất glucidgồm đường tự do 6,19% và đường toàn phần 26,77%; tinh dầu 0,05 — 0,1% và vitamin
C chiếm 0,059% (Nguyễn Thượng Dong và ctv, 2007)
2.2 Sơ lược về nuôi cay mô tế bào thực vật
2.2.1 Tống quan về nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là thuật ngữ miêu tả các phương thức nuôi cấy trênnhiều bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vôtrùng Môi trường có các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, cáchormone tăng trưởng và đường (Dương Công Kiên, 2002).
Trang 192.2.1.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một lĩnh vực được nhà khoa học người ĐứcHaberlandt (1902) đặt nên móng ban đầu từ việc đưa thuyết tế bào của hai nhà sinh vật
học người Đức là Schleiden va Schwann vào thực nghiệm năm 1902, khai thác hiện
tượng toàn năng của tế bào thực vật Đó là khả năng của tế bào cho ra một cây hoànchỉnh trong điều kiện nuôi cấy thích hợp (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007).Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương phápnuôi cay mô tế bào thực vật
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật xét cho cùng là kỹ thuật điều khiển sự phátsinh hình thái của tế bào thực vật có định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóacủa tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật (Ngô Xuân Bình, 2009)
2.2.2 Một số phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Một trong những phương thức sinh trưởng dé đạt được mục tiêu trong nuôi cay
tế bao va mô thực vật là nuôi cay đỉnh sinh trưởng (gồm nuôi cấy chỗi đỉnh va chéi bên).Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinhdưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bé sung chất kích thích sinhtrưởng thích hợp Từ đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định mẫu
sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chôi Chdi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và
rễ dé trở thành cây hoàn chỉnh Cây con được chuyên ra đất dần thích nghi va phát triểnbình thường (Dương Công Kiên, 2002).
2.2.2.2 Nuôi cấy mô sẹo
Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tô chức, hình thành do sự phản phân hóa
từ tế bào đã phân hóa Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện diện củaauxin Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trườngkhông có chất kích thích tạo mô sẹo Nuôi cay mô sẹo được thực hiện đối với nhữngloài thực vật không có khả năng nhân giống đỉnh sinh trưởng, hoặc với những loại mẫunuôi cấy không thể trực tiếp hình thành chồi Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giốngnhư cây mẹ và từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc cho nhiều chổihơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (Dương Công Kiên, 2002)
2.2.3 Một số hiện tượng bắt thường trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
Trang 202.2.3.1 Hiện tượng hóa nâu mẫu và môi trường nuôi cấy
Hiện tượng hóa nâu hay hóa đen mẫu là hiện tượng thường thấy trong nuôi cấy
in vitro, sinh trưởng của mau bị ngăn chặn hay làm hư mẫu Hiện tượng này do mẫu cóchứa nhiều chất tannin hay hydroxyphenol thường có nhiều trong mô già
Than hoạt tính được đưa vào môi trường dé hap thụ hợp chat phenol, ngăn chặnquá trình hóa nâu hay đen mẫu, hoặc dùng polyvinyl pryolidone (một chất thuộc loạipolyamide) Có thé làm giảm sự hóa nâu bằng việc sử dung mẫu cấy nhỏ từ mô non, gây
ít vết thương trên mẫu khi khử trùng, ngâm mẫu trong dung dich ascorbic acid va citricacid vài giờ trước khi cấy hoặc cấy chuyền thường xuyên ở giai đoạn nuôi cay ban đầu(Hà Thị Mỹ Ngân và ctv, 2020).
2.2.3.2 Hiện tượng thủy tỉnh thể
Hiện tượng này có đặc điểm là thân, lá phồng to, chứa nhiều nước, cây có dạngtrong Day là dang bệnh ly thường thấy khi nuôi cấy trên môi trường mà việc trao đốikhí và môi trường bên ngoài bị ngưng lại, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây.Qua quá trình nghiên cứu, có một số phương pháp làm giảm quá trình hóa thủy tinh thểnhư sau: giảm sự hấp thu nước của cây bằng cách tăng nồng độ đường trong môi trườngnuôi cấy và dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao Giảm gây vết thương cho mẫu cấyqua chất khử trùng và tiếp xúc với môi trường cấy ít nhất Giảm nồng độ đạm trong môitrường nuôi cấy, giảm khí ethylene trong bình nuôi cay bang cách thông gió tốt, tăngcường ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy (Hà Thị Mỹ Ngân và ctv, 2020)
2.2.4 Khả năng phát sinh cơ quan
2.2.4.1 Sự hình thành và phát triển của mô sẹo
Mô sẹo là một khối tế bào vô tổ chức, có hình dạng không nhất định, do không
có lớp nhu mô Mô sẹo được tạo ra nhờ sự phản phân hóa, cho phép các tế bào đã trưởngthành trở lại trạng thái trẻ hóa Tuy phát triển không theo quy luật nhưng mô sẹo có khảnăng biệt hóa thành rễ, chdi và phôi dé có thé phát triển thành cây hoàn chỉnh Sự tăngsinh của mô sẹo là kết quả của sự cân bằng trạng thái sinh lí của mẫu cấy và tác độngcủa các chất điều hòa sinh trưởng ngoại sinh áp dụng trong môi trường nuôi cay
Sự hình thành mô sẹo chia ra ba giai đoạn là phát sinh mô sẹo, phân chia tế bào
và biệt hóa Trong phase phát sinh mô sẹo, sự trao đổi chất kích thích tế bào chuẩn bịphân chia, giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của mẫu được
Trang 21đưa vào điều kiện nuôi cấy Sau đó tế bào đi vào giai đoạn tăng sinh khối Giai đoạncuối cùng, tế bào đi vào giai đoạn biệt hóa, xuất hiện sự biệt hóa và xuất hiện các conđường trao đôi chất dẫn đến sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học (Trần VănMinh, 2003) Trong quá trình phát triển, mô sẹo thường xuất hiện hai loại tế bào Tế baocủa mô sẹo xp, không bao to, nhân nhỏ, tế bào chất loãng Tế bào của mô seo ran chắc,
có không bào nhỏ, nhân to và tế bào chất đậm đặc
Ngay sau khi mô sẹo được hình thành, có thể sử dụng nó làm nguồn nguyên liệucho nhiều thí nghiệm khác nhau như nuôi cấy tạo chồi, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy tếbao đơn, nuôi cấy phôi soma, sản xuất các hợp chất thứ cấp (Dương Công Kiên, 2003)
2.2.4.2 Khái niệm và quá trình hình thành phôi vô tính
Phôi vô tính, phôi soma, phôi sinh trưởng hay phôi thé hệ cũng chi là một kháiniệm dé mô tả một cau trúc lưỡng cực bất định bao gồm cực chồi và cực rễ, mà dướiđiều kiện thích hợp có thích hợp có thé phát triển thành cơ thé có chức năng hoàn chỉnh(Dương Tan Nhựt, 2007) Phôi vô tinh có thé hình thành từ một tế bào don hay một cụm
tế bào Thông qua một quá trình phân chia có thứ tự, ở phôi sẽ diễn ra sự biệt hóa, trưởngthành và phát triển thành cây con (Maheswran và Williams, 1986)
Theo Duong Tan Nhựt và ctv (2008) sự tái sinh thực vật thông qua quá trình phátsinh phôi vô tính gồm 5 giai đoạn: (1) Nuôi cấy tạo phôi bằng cách chọn lựa mẫu cấy
sơ cấp cấy vào môi trường bồ sung chất điều hòa sinh trưởng, chủ yếu là auxin (đôi khi
là cytokinin); (2) Tăng sinh của quá trình nuôi cấy phôi trên môi trường rắn hoặc lỏng
có bố sung chất điều hòa sinh trưởng tương; (3) Giai đoạn trước khi trưởng thành củaphôi trong môi trường không có chat điều hòa sinh trưởng dé ngăn sự tăng sinh và kíchthích sự tạo phôi và phát triển sớm của phôi; (4) Giai đoạn phôi trưởng thành bằng cáchnuôi cay phôi trong môi trường bé sung ABA hoặc làm giảm áp lực thâm thấu; (5) Sựphát triển của cây trên môi trường không có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng
2.2.4.3 Sự phát sinh và biệt hóa mô của phôi vô tính
Phát sinh phôi vô tính là tiến trình từ một tế bào hay một nhóm tế bào sinh dưỡng
có thê phát triển thành cấu trúc lưỡng cực giống phôi hữu tính và không có liên kết maomạch với tế bảo gốc ban đầu Đối với phôi thực vật hai lá mam thì sau giai đoạn tiềnphôi sẽ là giai đoạn phôi hình cầu, phôi hình tim, phôi hình cá đuối, phôi trưởng thành
và giai đoạn phôi hai lá mam như phôi hữu tính Phôi của thực vật một lá mam sẽ trảiqua giai đoạn hình câu, bao lá mâm và lá mâm (một lá mâm) Sự tạo cơ quan phôi một
Trang 22lá mầm cơ bản giống ở cây hai lá mầm trừ vài khác biệt về số diét tử (một hay là hai)hay tính đối xứng của phôi (một hay thay vì hai mặt phẳng đối xứng như ở hai lá mầm)(Dương Tan Nhựt, 2007).
Sự hình thành phôi vô tính thông qua hai con đường là trực tiếp và gián tiếp.Trong con đường hình thành phôi vô tính trực tiếp, các phôi được hình thành trực tiếp
từ một hoặc một nhóm tế bào mà không qua quá trình tạo mô sẹo Nếu mô cấy có các tếbào phôi hợp tử đã có sẵn chương trình biểu hiện của các gen, thì chi cần một sự kíchthích phan chia tế bào là đủ dé hình thành phôi (Duong Tan Nhựt, 2007) Phát sinh phôigián tiếp là quá trình phôi vô tính được phát sinh thông qua mô sẹo và thông thường môsẹo sẽ tăng sinh dồi dào trước khi được cảm ứng hình thành phôi Những tế bào đã phânhóa, không còn khả năng sinh phôi thì chúng cần phải trải qua nhiều lần phân chia tếbảo liên tiếp dưới sự cảm ứng của auxin trong suốt quá trình dé được tái lập đi vào conđường sinh phôi (Bùi Trang Việt, 2002).
2.2.5 Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng
Theo Ngô Xuân Bình (2009), việc bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng nhưauxin, cytokinin là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơquan, cung cấp sức sống tốt cho mô và các tổ chức, là yếu tố quan trọng nhất trong điềukhiển sự phát sinh hình thái và tai sinh cây hoàn chỉnh Tuy vậy yêu cầu đối với những
chất này thay đôi tùy theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng
nội sinh của chúng.
2.2.5.1 Ảnh hưởng của auxin
Auxin bé sung vào môi trường nuôi cấy dé kích thích sự tăng trưởng của mô seo,huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, kích thích sự phát sinh rễ và kìmhãm sự kéo dài rễ, đặc biệt là khi sử dụng với cytokinin (Bùi Trang Việt, 2000)
Đề cam ứng tạo mô sẹo ở những cây lá rộng, 2,4-D thường được sử dụng ở nồng
độ từ 5 - 15 uM Dé cảm ứng mô sẹo ở cây hai lá mầm, người ta thường kết hợp auxinvới cytokinin trong môi trường nuôi cấy, còn ở cây một lá mầm thường dùng nồng độauxin cao hơn từ 5 - 10 M để tạo mô sẹo (Machakova và ctv, 2008)
Auxin là yếu tố cần thiết cho sự phát triển của phôi, nó có ảnh hưởng khác nhautrong từng giai đoạn của quá trình phát sinh phôi Nồng độ của auxin trong môi trườngcao sẽ ngăn cản sự phát sinh hình thái nhưng lại cảm ứng sự phát sinh phôi soma từ các
10
Trang 23tế bào có kha năng sinh phôi (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006) Auxinđược sử dụng nhiều nhất là 2,4-D với nồng độ từ 0,5 - 27,6 uM, NAA và các auxin khácđược sử dụng ít hơn (Evans và ctv, 1983).
2.2.5.2 Anh hưởng của cytokinin
Cytokinin có vai trò kích thích phan chia tế bào, kích thích sự hình thành hoa, phá
vỡ trạng thái ngủ của hạt và một số co quan khác, tăng cường sự tong hợp DNA va RNAtrong tế bào, điều tiết quá trình sinh tổng hợp protein trong tế bào, ảnh hưởng đến tạochi bat định, tăng sinh chỗồi bên và ngăn cản tạo rễ và ảnh hưởng đến sự tạo phôi
Ti lệ giữa cytokinin va auxin thì có kích thích tạo chéi hay tạo rễ, thông thườngcytokinin cao hon auxin thì kích thích tạo chéi, và ngược lại Ở nồng độ cytokinin cao
sé dua dén két quả tao thành các cum chéi Số lượng chéi hình thành tùy thuộc vào nồng
độ cytokinin Tuy nhiên, cũng có những bắt lợi nhất định trong việc chỉnh nồng độ décảm ứng tạo nhiều chồi, chồi được tạo ra trở nên nhỏ, không thể kéo dai và tạo ra những
lá bất thường Cytokinin nồng độ thấp kích thích phát triển chồi nách
Đối với cảm ứng mô sẹo, cytokinin giúp quá trình tạo sẹo hình thành nhanh hơn
Sự bổ sung cytokinin vào môi trường nuôi cay đã tăng cảm ứng hình thành phôi ở thựcvật Ở cỏ Creeping, sự kết hợp giữa 2,4-D và cytokinin kích thích sự tăng mô phôi nhiềuhơn khi sử dung 2,4-D riêng lẻ (Zhong va ctv, 1991) Tương tự, ở tiêu, phôi vô tính đượctạo ra trên môi trường 2,4-D và TDZ nhưng nếu môi tường chỉ chứa 2,4-D thì quá trìnhtạo phôi không xảy ra (Binzel và ctv, 1996).
2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước sâm Ngọc Linh
Dé bảo tồn, phát triển và nhân giống sâm Ngọc Linh, ở Việt Nam trong nhữngnăm qua một số các tác giả cũng như nhóm nghiên cứu đã thực hiện các nghiên cứu
khác nhau trên loài sâm quý hiêm nay.
11
Trang 241973 |Phát hiện loài mới
1985 |Định danh khoa học
Nghiên cứu sự hình thành rễ bắt định[2010 lỨng dụng công nghệ đèn LED
—}— Tạo rễ bắt định từ củ Môi trường tối ưu tạo củ ín vifro
012 —4— Phat sinh hình thái được cảm ứng từ rễ chính
N Ae 9ỏu 0u NNO uọljÔN uộjA ~
—Ï
o
=<jL2 Is 3—}— Tao re tóc
vic je F— Bước đầu nhân sinh khối quy mô lớn
¿ 3 £ 2015 Giai ma hé gen luc lap
Slolz= ọ Đánh giá di uyền bằng chỉ thị phân tử2I<Z.|©ÍS ’
ĐÌ@ = BS a r pot | Kay dưng chỉ + A phuc vu giam dinh
Giai đoạn từ năm 1973 - 1985 được xem là giai đoạn phát hiện và định danh.
Năm 1973, một nhóm các nhà nghiên cứu đã phát hiện 2 cá thé thực vật ở độ cao 1.800
m thuộc dãy núi Ngọc Linh, huyện Dak Tô (nay là huyện Dak Glei), tỉnh Kon Tum va
đặt tên là sâm đốt trúc hay sâm K5 (sâm khu 5) với tên khoa học sơ bộ là Panax
articulatus L., họ Araliaceae Năm 1985, hai nhà khoa học Hà Thi Dụng và Grushvisky
đã xác định đây là một loài sâm mới và định danh khoa học là Panax vietnamensis Ha
et Grushv Hà và Grushv., 1985).
Giai đoạn 1994 - 2002, nhóm nghiên cứu của Dương Tan Nhựt kết hợp với
Nguyễn Ngọc Dung đã bắt đầu tìm kiếm môi trường nhân nhanh mô sẹo sâm Ngọc Linh
Những năm sau đó, một số nghiên cứu chủ yếu tập trung vào tác dụng dược lý của các
hoạt chất (saponin và polyacetylen) tới sức khỏe con người Năm 2001, tác giả Komatsu
đã công bố kết quả nghiên cứu xác định phân loại loài của sâm Ngọc Linh, tác giả khang
định Panax vietnamensis có cùng khóa phân loại với các loài Panax khác và có môi
12
Trang 25quan hệ gần với 2 loài Panax japonicus và Panax pseudoginseng.
Từ năm 2008 đến 2014 là giai đoạn ghi lại dau ấn đậm nét của Dương Tấn Nhựt
và ctv khi đã hoàn thiện quy trình vi nhân giống và sản xuất rễ bat định sâm Ngọc Linh
Sâm Ngọc Linh là một loài đặc hữu và quý hiếm, nhưng tốc độ sinh trưởng bênngoài tự nhiên tương đối chậm, vì thế phương pháp nhân giống in vitro đã được tậptrung nghiên cứu và áp dụng Tiêu biéu của một số nghiên cứu nhân giống in vitro cây
sâm Ngọc Linh như:
Mai Trường va ctv (2014) nghiên cứu tạo và nhân phôi soma sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong môi trường lỏng nhóm tác giả đã sử dụng lácây sâm Ngoc Linh nuôi cấy trên môi trường MS có bồ sung 1 mg/1 2,4-D kết hop với0,2 mg/I kinetin để tạo mô sẹo sau đó, mô sẹo được cấy chuyền qua môi trường MSlỏng chứa 1 mg/1 2,4-D kết hợp với 0,2 mg/I kinetin và 500 mg/1 casein hydrolysate détạo huyền phù tế bao Sau 2 tháng huyền phù được chuyên vào môi trường B5 (lỏng) có
bổ sung 3 mg/l IBA Kết quả, sau nhiều tháng nghiên cứu phôi soma hình cầu được hìnhthành với số lượng lớn và có khả năng nhân 6n định
Cùng năm 2014, Hiền và ctv đã nghiên cứu phát sinh phôi trực tiếp từ lá, cuống
lá và thân rễ cây sâm Ngọc Linh in vitro 3 tháng tuổi được sử dụng nuôi cấy trên môitrường MS có bồ sung NAA hoặc 2,4-D cho kết quả sau 10 tuần nuôi cấy thì mẫu lá làthích hợp nhất cho hình thành phôi trực tiếp Mẫu lá được nuôi cấy trên môi trường MS
bổ sung 2 mg/I NAA cho hiệu quả phát sinh phôi trực tiếp cao nhất (29,49 phôi/mẫu)
Hương và ctv (2016) đã nghiên cứu đánh giá khả năng sinh trưởng và tích lũy
saponin của rễ bất định và rễ tơ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.).Trong nghiên cứu này, rễ bất định sâm Ngọc Linh (có nguồn gốc từ nuôi cấy mau lá invitro trên môi trường thạch có b6 sung 5 mg/1 IBA) và rễ tơ chuyền gen (được hình thànhbằng cách lây nhiễm mẫu mô seo in vitro với vi khuân Agrobacterium rhizogenes chủngATCC 15834) được sử dụng dé đánh giá khả năng sinh trưởng và tích lũy saponin Kếtquả cho thấy, sau 5 tháng nuôi cấy, tỉ lệ tăng sinh của rễ tơ là 20,87 lần và rễ tơ vẫn còntiếp tục sinh trưởng: trong khi tỉ lệ tăng sinh của rễ bất định là 13,52 lần và hầu như đãngừng tăng sinh từ sau tháng thứ 3 Kết quả phân tích hàm lượng saponin cho thấy, hàmlượng saponin tông thu được của rễ tơ (0,1010 mg) cao hơn rễ bất định (0,0681 mg)
Đặc biệt những năm gần đây, nhiều nhóm nhà khoa học đang đây mạnh nghiêncứu chuyền gen tạo rễ tóc Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) làm vật
13
Trang 26liệu cho nuôi cay bioreactor” dé thực hiện nuôi cấy sinh khối sâm trong điều kiện invitro trong các hệ thống bioreactor nhằm tạo ra nguồn vật liệu sâm ban đầu nhanh chóng,chứa đầy đủ được tính như sâm tự nhiên dé phục vụ cho các ngành sản xuất được liệunhằm thay thế cho nguồn nguyên liệu trong tự nhiên ngày một cạn kiện và thời gian thuhoạch mat đến 5-7 năm.
Giai đoạn 2019 đến 2021, Nhiều nhóm các nhà khoa học đang thực hiện nghiêncứu mở rộng điều kiện nuôi trồng sâm Ngọc Linh in vitro ở điều kiện nhà kính và tựnhiên Điển hình là nghiên cứu của Phan Công Du và ctv (2019) Kết quả nghiên cứucho thấy khi phân tích cây sâm 5 năm tuổi có nguồn gốc từ cây con in vitro tích lũysaponin G-Rgl 1,248% và G-Rbl 1,012% là tương đồng và saponin M-R2 1,417% làthấp hơn so với sâm Ngọc Linh tự nhiên (Quảng Nam và Kon Tum) Đây là cơ sở có thể
di thực cây sâm Ngọc Linh tới các vùng có điều kiện sinh thái tương tự nhằm mở rộngvùng trồng sâm Ngọc Linh
Bên cạnh đó, có rất nhiều nghiên cứu nhằm khảo sát hoạt chất, đánh giá di truyềnphan tử, xây dựng ngân hàng biểu hiện gen Một nhóm nghiên cứu các nhà khoa họcĐại học Quốc gia Seoul (Hàn Quốc) đã giải mã thành công hệ gen luc lap của Panaxvietnamensis và cho thay sự giỗng nhau ở cấp độ nucleotide giữa các loài Panax khácnhư Panax ginseng, Panax quinquefolius va Panax notoginseng (Kim va ctv, 2017).
Trong nghiên cứu này TDZ được sử dung cho sự phát sinh phôi từ mô sẹo sâmNgọc Linh, cho thay sự khác biệt so với một số nghiên cứu trước đó khi sử dụng NAA,2,4-D hay IBA dé tạo phôi sâm Ngọc Linh (Hiền va ctv, 2014; Mai trường va ctv, 2014).Bên cạnh đó sự kết hợp 2 yếu tô ở các thí nghiệm khảo sát khả năng tao mô sẹo và sựtăng trưởng chôi cho thấy sự tương tác hay không tương tác giữa các yếu tố, điều này
khác biệt so với các nghiên cứu đơn yêu tô trước đó.
14
Trang 27CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 4 năm 2023 đến tháng 1 năm 2024 tại phòng Nuôicay mô tế bào thực vật (BIO203), khoa Khoa học Sinh học, trường Đại học Nông Lâm
TP Hồ Chí Minh
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng: Củ sâm Ngọc Linh 5 năm tuổi được nuôi cấy trong phòng thí nghiệmNuôi cay mô tế bảo thực vật, khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thànhphố Hồ Chí Minh
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: Tủ cấy vô trùng, nồi hấp, tủ sấy, máy lắc, máy đo pH, cân điện tử, máykhuấy từ, máy cất nước
Dụng cụ: pence, dao, đĩa cấy, đèn cồn, chai thủy tinh, nút cao su, pipette, các thiết
bị khác như tủ lạnh, đèn huỳnh quang.
3.2.3 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Một số chất khử trùng như cồn Ethanol, HgCl (MERCK), dung dịch Javen,Tweens-20.
Các chat điều hòa sinh trưởng thực vat gồm 2,4-D (MERCK), BAP (MERCK),TDZ (MERCK), NAA (MERCK), IBA (MERCK).
3.2.4 Môi trường nuôi cấy
Môi trường được sử dụng trong nghiên cứu là môi trường MS (Murashige vàSkoog, 1962) Môi trường MS có bồ sung chất điều hòa sinh trưởng theo nồng độ tùythuộc vào từng nội dung khảo sát Môi trường nuôi cấy được chỉnh pH bang 5,8 và có
bổ sung thêm 30 g/l đường, 7 g/l agar Môi trường được chứa trong chai thủy tinh 500
ml với thể tích môi trường là 50 ml Sau đó đem hap khử trùng ở nhiệt độ 121°C, ápsuất 1,2 atm trong 20 phút Thành phần môi trường MS cơ bản được trình bày chỉ tiếttrong Bang 3.1.
15
Trang 28Bảng 3.1 Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962)
3.2.5 Điều kiện nuôi cấy
Mau cay của các nghiệm thức sau khi cấy phải được dé trong điều kiện nuôi cấy thíchhợp Các mẫu cấy được nuôi ở phòng tăng trưởng với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ/ngàydưới bóng đèn huỳnh quang Nhiệt độ nuôi cấy thường dao động khoảng 25 + 2°C, độ
am trung bình từ 60 - 65%
16
Trang 293.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Nội dung 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BAP đến khả năng
tạo mô sẹo sâm Ngọc Linh
Mục tiêu: Xác định được nồng độ 2,4-D kết hợp với BAP tốt nhất cho sự tạo mô
sẹo từ mẫu củ sâm Ngọc Linh in vitro
Cách tiến hành: Nguồn mẫu ban đầu là củ của cây sâm Ngọc Linh 5 năm tuổiđược tiến hành vô mẫu theo quy trình của Dương Tan Nhựt va ctv, 2010 Những đoạn
củ sạch sẽ được cắt thành từng lát mỏng có kích thước 0,5 cm x 0,5 cm x 1 mm (dai xrộng x dày) Sau đó, được cay trên môi trường MS có chứa 7 g/l agar, 30 g/l đường, có
bô sung 2,4-D có nồng độ thay đổi (0; 0,5; 1; 1,5 mg/l) kết hợp BAP có nồng độ thay
Trang 30Tổng số mẫu cấy tạo mô sẹo
Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) = x 100 (dém những mẫu phông, cong
Tổng số mẫu của thí nghiệm
lên hoặc bề mặt xù trắng).
Thời gian cảm ứng tạo mô sẹo (ngày) (thời gian mẫu bat đầu phồng, cong lên
hoặc bề mặt xù trắng).
Tình trạng mẫu (hình thái, màu sắc của mô seo)
Thí nghiệm được bố trí theo kiêu ngẫu nhiên 2 yếu tố, gồm 16 nghiệm thức với 3lần lặp lại, mỗi nghiệm thức gồm 3 chai, 3 mẫu/chai Tổng số mẫu cho một lần lặp lại
là 9 mẫu Các mẫu cấy được nuôi ở phòng tăng trưởng trong điều kiện tối hoàn toàn,nhiệt độ 21 — 23°C + 2°C, độ am 50 — 60%
3.3.2 Nội dung 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của TDZ đến sự phát sinh phôi từ mô
seo sâm Ngọc Linh
Mục tiêu: Xác định được nồng độ TDZ tốt nhất cho sự phát sinh phôi từ mô sẹosâm Ngọc Linh.
Cách tiến hành: Mô sẹo được cắt thành các mảnh nhỏ và cấy chuyên lên môitrường MS có bồ sung 0.7 mg/l IBA kết hợp với TDZ có nồng độ khác nhau thay đổi (0;0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 mg/l).
Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố tri theo kiểu ngẫu nhiên 1 yếu tố gồm 6nghiệm thức với 4 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức gồm 3 chai, 3 mẫu/chai Tổng số mẫucho một lần lặp lại là 9 mẫu Các mẫu cấy được nuôi ở phòng tăng trưởng với chu kỳchiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ 21 — 23°C + 2°C, cường độ chiếu sáng 3000 lux dướiánh sáng trắng, độ âm 50 — 60% Thí nghiệm được bồ trí như Bảng 3.3
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của TDZ đến sự phát sinh phôi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh
Nghiệm thức Môi trường Nông độ TDZ (mg/1) Mẫu/LLL