Khóa luận tốt nghiệp Sư phạm sinh học: Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa in vitro của nước sắc lá ổi (Psidium guajava .L)

PHAM VI NGHIÊN CUU Trong điều kiện của dé tai, các phương pháp xác định khả năng kháng oxi hoá in vitro được lựa chọn là năng lực khử Fe?’ va bay gốc tự do DPPH; các giống di được chọn l

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRUONG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

to LL og

BACH NGUYEN HUYEN TRAN

KHOA LUAN TOT NGHIEP DAI HOC

NGANH SƯ PHAM SINH HỌC

TP HO CHÍ MINH - 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRUONG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

go LL os

BACH NGUYEN HUYEN TRAN

KHAO SAT HOAT TINH KHANG OXI HOA

IN VITRO CUA NƯỚC SAC LA OI

KHOA LUAN TOT NGHIEP DAI HOC

NGANH SU PHAM SINH HOC

NGƯỜI HUONG DAN KHOA HỌC

ThS Nguyén Thi Hang

TP HO CHÍ MINH - 2023

LỜI CẢM ƠN

Lời dau tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến giảng viên ThS Nguyên Thi Hang - người đã tận tình giúp đỡ và hướng dan em trong quả trình học tập, nghiên

cứu và hoàn thiện dé tài nay,

Em xin chân thanh cảm ơn quy Thây/Cỏ, các c6/ chị nhân vién, anh chị, các ban

sinh viền nghiên cứu khoa học thuộc phòng thí nghiệm Di truyền - Tiến hoá, Vi sinh

- Sinh hoá, phòng Sinh học trung tâm, phòng Sinh lí thực vật - Phương pháp dạy học,

Phòng Thực vật hoc thuộc khoa Sinh học trường Đại học Sư phạm Thanh phả Ho

Chí Minh đã hỗ trợ các thiết bị và dụng cụ cho đề tài của em

Em xin chân thành cam ơn các nhà vườn ở huyện Bình Chánh và quận Bình

Tân đã tạo điều kiện và hỗ trợ em trong việc thu mẫu và thực hiện đề tài.

Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị khoá trước và các em đã hỗ trợ em hoàn

thành khoá luận, em xin cảm ơn anh Phùng Anh Tài (K43), anh Trần Thanh Bình (K44) em Lam Kha Ngân (K46) đã gitp đỡ em trong qua trình hoàn thanh khoá luận.

Chân thành cảm ơn phòng Di truyện - Tiến hoá thuộc khoa Sinh học, trường

Đại học Sư phạm Thành phổ Hỗ Chí Minh đã cung cấp các thiết bị và dung cụ cũng

nhục nơi nghiên cứu cho dé tài của em

Thành phố Hỗ Chi Minh, ngày 28 tháng 04 năm 2023

SINH VIÊN THỰC HIỆN KHOÁ LUẬN

a MUC LUC

LOL CAM 1951 ĐH |

00/09A ii

DANH MỤC CÁC CHU VIET TAT , - 622262221 2112112 112 11 2112110210021 c2 iv

DANH MUC HINH ANH oo cccccssessssossesssesseessvensvensvossvassvnnsvannensnnanvnessvarersiensarenevesene V

I, LÍ DO CHON ĐỀ TAL o cccccccccccssesssesseessesseessessvsssessesssesseesvesnesseeseseetsetesetssesenesess I

II MỤC TIBU NGHIÊN CUUoooeocccccceccceccceccceseessscsssesssessseesnesseeesiessiesseesseesseesueesees 2

IL DOL TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2222 ©222222222EEE2E22222231222127211721122112-212-ce 2

IV NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU 2° 2s S2SS2SEê2EEE221E23E222022272222222222-e- 2

V PHAM VI NGHIÊN CỨU - 2° 2s2S CS E21122122211211111111.11.11 11.0, 2

Chương 1 TONG QUAN 22-2 2-2222222S32S3E23E2222212211211221221222 1122112211222 222ce 3

1.1 TONG QUAN VE GĨC TỰ DO 2-5222 S32S3221122172322112212212 E2 3

1.1.1 Nguồn gốc của các gốc tự đo trong cơ thê 22©2czccczcczsrrcscee 3 1.1.2 Tác hại của gốc Ce (ee 6

11.1.3; Chất chống ưxiibộitự WEIEA 000sssscesossssscssscsoscssesssssseisosvvasivenssesosesoeosed 61.2 TONG QUAN CÁC PHƯƠNG PHÁP VE KHAO SÁT KHẢ NANG

1.2.1 Phương pháp khảo sát năng lực khử Fe (reducing power) 7

1.2.2 Phương pháp khảo sát năng lực khử sắt (FRAP) :552c 2522 §

1.2.3 Phương pháp khảo sát khả năng bắt gốc tự đo (DPPH) - 9

1.2.4 Phương pháp khảo sát hiệu quả trung hịa gốc tự do ABTS+ (TEAC) 9

1.2.5 Phương pháp chống oxi hố bằng cách bay các gốc tự đo (TRAP) 10

1.2.6 Phương pháp xác định kha năng hap thy gốc tự do chứa oxi hoạt động (OR.ÁC) 2002222220 22102211221022112210212 T12 T11 T1 1 HH re 10

00) 0190/0909 ›°:O0'A15 H

I.3.1 MiitrÍiphơnilÏGđÌ::::-:::-:o:-ccc:cccsiiosiiissiosoiiagii2S120215551565884615551886816215833582518535856 Il

1.3.2 Đặc điểm sinh thai ccccccceccccecseecessessessessessessessesscesessesscsseaseeseensesveeseeeeees H

1.3.3 Đặc điểm sinh học của các giống Ơi nghiên cứu trong đẻ tài 14

1.2.4 Tác dụng của lá ơi theo Đơng Y -22- 2-222222EEE 2x2 erxrrrrrrrcrrves 18

1.4 CÁC NGHIÊN CỨU LIEN QUAN DEN DE TÀI -2-©cz- 19

1.4.1 Trong nước c1 SH HH HH TH TH HH ng ng 19

1.4.2 Ngoài RƯỚC Su HS nh Hà HH1 11 t0 ch ng 011101 1c 19Chương 2: DOI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 DOL TƯỢNG NGHIÊN CUU oo.ccccccccccssecssecssecsseesseessessseeseeesenssessseteseescenseenees 21 2.2 THIẾT BỊ VA HOA CHAT c ccccccesccssessessessessesseseesscsseceesecssesseeetsecssrsessessees 23

mẽ 23

2.2.2 Hoá chất -2 2 2sSE21E25211221122111211121112112 211171117111 71471071071 72 23 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 2-©72+222+2Z22EEZ£EEZ2EEz2EEcrEzcrvee 24

2.3.1 Phương pháp thu và xử lí mẫu 2- 2-5222 z2SzcEEcExcsrrsrrkcsrred 24

2.3.2 Phương pháp thu nhận nước sắc - 2-22 z+2se+Seeczxeccxxecrxvce 25

2.3.3 Phuong pháp khảo sát kha nang kháng oxi hoá in vitro 26

23441 (Phiercnng poli te SOMO sscassscassscssssonssssoansnasssassssaseaaancaansasvnsaassasssnsssnases 28Chương 3: KET QUA NGHIÊN COU oo ccoscsossssssassussssaisssssscssncsarsasssdsssoonsasosansuannnas 29

3.1 KET QUA NGHIÊN CỨU 2: se tt 13SE1122E1121117711272222230-22 29

3.1.1 Kết quả năng lực khử F€* 2-2222 2221222222142 293.1.2 Kiếp dua bầy góc tạrlö(DPPH toonnneinninnanoiniainniiiiipidiiittiidiaannai 36

BE WEA TU Na ca nan nen a0 0nnnnne 45KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ, 222-5222 2É 11021122 5 1c y ng grg 48

s05 ta 48TÀI LIEU THAM KHAO ccccccssessssssssesssessvessvenssessersserssvessnesseesseeavensvenssnnnenenennees 49

PHỤ DUG 5 i scsseasssasssassssasssassoaissasssarssassseosveaasssssosveaasvoavscassvasisasssasisaasioassoaiveasssassvasseaies a

DANH MỤC HINH ANH

Trang

Hình 1.1 Nguồn gốc xuất hiện các gốc tự do ROS -.2-©222©czzccczcerzcrrrccee 3Hình 1.2 Quá trình hô hấp của tẾ bảo - 5s 22002210221 21 1211121122111 xe 4

Hình 1.3 Chuỗi truyền điện tử của quá trình hô hap của tế bào 5

Hình 1.4 Tác hai của gốc tự do ROS đới với cơ thé MGUY I ccccseeecceeessteesnneeeeees 6 Hình 1.5 Vị trí thu lá ôi giỗng ôi Nữ hoảng và Ruby đö 2: ¿55552 12

Hình 1.6 Vị trí thu lá ôi giỗng ôi SO cece cc eeceecceecceeneeseestesseeeenneesneenenneees 13

Hình 1.7 Vj tri thu lá ôi giỗng ôi Huyền Chau cccceccceeccssecssecsssessseessseesseesseeeees l3

Hình 1.8 Hình thái lá ôi Nữ hoàng -22-22 2222222221222 221122112211.cEeccrre 14 Hình 1.9 Hình thai lá ôi Ruby đó 22 2 2102252212112 1211212222121 112cc, l6 Eiimhi1:10:inihi(NôijIRIDNISE+.:ss::sss::s5:c2:c221942:221012450250625005102E40053237203522193338241333:3331322 17 Hình 2.1 Vị trí toa độ của địa chỉ thu nhận lá ôi Huyền 61 ốỔố 21 Hình 2.2 Vị tri toa độ của địa chi thu nhận lá ôi Nữ hoàng va Ruby đỏ 22

Hình 2.3 Vị trí toa độ của địa chỉ thu nhận lá ôi S6 ooo cc cee ceeecceseceeeceseeeseeeeees 22Hình 2.4 Sơ đồ quy trình thu vả xử lí mẫu 52622222215 21122211151 22122222 24Hình 2.5 Sơ đô quy trình thu nhận nước sắc nông để HG : ao- se 25Hình 2.6 Sơ đồ quy trình phương pháp xác định năng lực khử - 26Hình 2.7 Sơ đồ quy trình phương pháp bay gốc tự do DPPH 27

Hình 3.1 Dé thị the hiện tương quan giữa tỉ lệ phần trăm bẫy gốc tự do DPPH và

nông độ nước sắc lá ôi Nữ hoảng theo phương trình logarithmic - 38Hình 3.2 Đỗ thị thé hiện tương quan giữa tỉ lệ phần trăm bẫy gốc tự do DPPH vànông độ nước sắc lá ôi Ruby đỏ theo phương trình logarithmiic - eee 40

Hình 3.3 Đồ thị thé hiện tương quan giữa ti lệ phan trăm bay gốc tự do DPPH va

nông độ nước sắc lá ôi Sẻ theo phương trình logarithmic 52 42

Hình 3.4 Đỗ thị thẻ hiện tương quan giữa tỉ lệ phần trăm bay gốc tự do DPPH và

nông độ nước sắc lá ôi Huyền Châu theo phương trình logarithmic - “đ

Bảng 3.2 Giá trị OD của nước sắc lá ôi Ruby đỏ theo nồng độ 30

Bảng 3.3 Giá tri OD của nước sắc lá ôi Sẻ theo nồng độ :-5555s: 31

Bang 3.4 Giá trị OD của nước sắc lá ôi Huyền Châu theo nông độ 32

Bảng 3.5 Giá trị OD của nước sắc lá ôi ở các gidng khác nhau ở nông độ 0,01% 33

Bảng 3.6 Giá trị OD của nước sắc lá ôi ở các giống khác nhau ở nông độ 0,05% 34Bảng 3.7 Giá trị OD của nước sắc lá ôi ở các giống khác nhau ở nồng độ 0,1% 34

Bảng 3.8 Giá trị OD của nước sắc lá ôi ở các gidng khác nhau ở nông độ 0,5% 35

Bảng 3.9 Giá trị OD của nước sắc lá ôi ở các gidng khác nhau ở nồng độ 1% 35

Bảng 3.10 Ti lệ phan trăm bẫy gốc tự do DPPH của nước sắc lá ôi Nữ hoàng theo

Bảng 3.12 Ti lệ phần tram bay gốc tự do DPPH của nước sắc lá Sẻ theo nồng độ 41Bảng 3.13 Ti lệ phan trăm bay gốc tự đo DPPH của nước sắc lá ôi Huyền Châu theoBồH HỘI 22210662 c06200652006-2 06622152010222009210122191152321362210320217022060272003212300221022311240 1ES2 43

MO DAU

I LÍ DO CHON DE TÀI

Gốc tự do là các sản phẩm của quá trình sinh hoá trong cơ thé Chúng đượckiểm soát ở những nông độ nhất định Tuy nhiên, đưới áp lực của cuộc sống và môitrường ô nhiễm, nồng độ các gốc tự do trong cơ thé có chiều hướng gia tăng Khinông độ các gốc tự do trong cơ thé tăng quá mức, chúng sẽ phá huỷ màng tế bao, tác

động đến các đại phân tử trong tế bào như DNA, protein, từ đó làm biến đôi cầu

trúc protein, ức chế các enzyme, gây ra đột biến gene, Vì vậy, ngày nay, chúng ta

gặp phải nhiều van dé vẻ sức khoẻ có liên quan đến gốc tự do như các bệnh xơ vữa

động mạch, tiều đường, ung thư, Bên cạnh việc sử dụng các liệu pháp trị liệu trong

y được, người ta còn dùng rất nhiều các sản phẩm, thực phẩm chức năng dé tăng

cường sức khoẻ, đặc biệt là chống oxi hoá.

Ngày nay, với sự phát triển của nên y học, chúng ta có rất nhiều phương pháp

khác nhau được áp dụng cho việc phòng va chữa trị bệnh Bên cạnh sự phát trién của

Tây Y thì nền Đông Y cũng phát triển với nhiều nghiên cứu tiễn bộ hơn Các loại

được liệu ngày càng được nghiên cứu va ứng dụng nhiều hơn trong phòng, trị bệnh.

Đề hỗ trợ việc điều trị một số loại bệnh như ung thư, tiểu đường ngoài việc sử

dụng thuốc Tây y thì dân gian thường sử dụng một số cây thuốc được lưu truyền,trong đó cách phô biến là sắc thuốc Một số dược liệu đã được các nhà khoa học

nghiên cứu và đưa ra các dan chứng cụ thẻ, tuy nhiên còn rất nhiều loại chưa được công bỗ bằng chứng khoa học cụ thé.

Theo Đông Y, lá di là một loại được liệu có thé dùng để chữa trị các bệnh như:

tiêu chảy, đau bung đi ngoài, trị vết thương, Một số công trình nghiên nghiên cửucủa tác giả (Chang Ho Jeong và cộng sự (2012); Đỗ Văn Mãi (2021); ) đã cho thaycao chiết của lá/ quả ôi có hoạt tính kháng oxi hoá Ở Việt Nam, ôi được xem là mộtloài cây ăn quả phô biến, có nhiều giống khác nhau, được trồng ở nhiều nơi Trongquá trình chăm sóc, lá di thường xuyên được tia cắt, chưa được tận dụng triệt dé

Từ những dẫn liệu trên, với mong muốn cung cấp những bằng chứng khoa họccho những nghiên cứu ứng dụng trong được liệu sau nảy hoặc cho cách sử dụng của

dan gian, đề tài “Khao sát hoạt tinh kháng oxi hoá in vitro của nước sắc lá ôi (Psidium

guajava L)” được thực hiện.

H MỤC TIỂU NGHIÊN CỨU

Xác định hoạt tính kháng oxi hoá in vitro của nước sắc lá ôi trồng tại các nhả

vườn ở khu vực Tp.HCM.

Ill DOI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Nước sắc lá ôi thuộc các giống: Nữ hoàng: Ruby Đỏ; Sẻ; Huyền Châu

IV NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU

Dé thực hiện được mục tiêu nêu trên, dé tài thực hiện các nhiệm vụ nghiên cứu

cụ thé như sau:

1 Nghiên cứu tài liệu 1a các công trình bài bao đề tìm hiéu về phương pháp quy

trình thực hiện.

Thu lá ôi thuộc các giống khác nhau trên địa bàn Tp.HCM va bảo quản.

Thu nhận nước sắc lá ôi.

Thực hiện thí nghiệm xác định năng lực khử Fe”* của nước sắc lá ôi.

wrt YN Thục hiện thi nghiệm xác định khả nang bay gốc tự do DPPH của nước sắc lá

ôi.

6 Thu nhận, xử lí số liệu bằng phan mém thống kê

7 Viết báo cáo khoá luận tốt nghiệp.

V PHAM VI NGHIÊN CUU

Trong điều kiện của dé tai, các phương pháp xác định khả năng kháng oxi hoá

in vitro được lựa chọn là năng lực khử Fe?’ va bay gốc tự do DPPH; các giống di

được chọn là: Nữ hoàng, Ruby Do, Se, Huyền Châu được thu nhận ở khu vực

Tp.HCM.

Chương 1 TONG QUAN

1.1 TONG QUAN VE GÓC TỰ DO

1.1.1 Nguồn gốc của các gốc tự do trong cơ thể

Gốc tự do (free radical) được biết đến là những nguyên tử hay phân tử bị mắt đi

một điện tử ở lớp vỏ ngoài cùng Nó có thẻ lấy điện tử từ các phân tử khác đẻ đạt

được trạng thái ôn định [1] Có hai nhóm gốc tự do phô biến trong tế bảo: các gốcoxygen hoạt động (Reactive Oxygen Species - ROS) và các gốc nitrogen hoạt động

(Reactive Nitrogen Species - RNS) Một số gốc ROS phổ biến trong tế bào là (gốc

superoxyde; gốc hydroxyl, gốc peroxyde ) một số gốc RNS là ( gốc oxide nitrice:

gốc peroxynitrite ) ROS va RNS có thé tao các phản ứng đây chuyén với các phân

tử xung quanh và gây tôn thương các đại phân tử sinh học trong tế bảo như DNA,

protein, lipid, Vi ROS được đánh giá là đóng nhiều vai trò ở cơ thé người và được

sản sinh từ nhiều nguôn, một trong số đó 1a ti thé, một bào quan phô biến trong tế bàodẫn đến số lượng gốc tự do ROS trong tế bào chiếm đa số [2]

—-1} thông vin Mitochendnion

chuyên điu tr nk tryyờy đến sử

€Cydooxygxna vdooxygenas< me

K&K**.Cu* liroxygenas Onidases

† NADPH osidase

Femen reaction

Hình 1.1 Nguồn gốc xuất hiện các gốc tự do ROS [3]

Gốc tự do là sản phâm của các quá trình sinh hoá trong cơ thê, cụ thê là các

phan ứng oxi hoá khử Trong tế bào, quá trình sinh hoá gồm 2 quá trình quan trọng

là đồng hoá và đị hoá Theo đó, quá trình đị hoá và tận cùng là hô hắp tế bảo là nguyên

nhân chính tạo ra các gốc tự do trong cơ thể sinh vật Quá trình hô hấp tế bao (chủ

yếu là hiểu khí) gồm 3 giai đoạn chính: 1) Đường phân (phân giải đường) được dién

ra trong tế bào chất; 2) Chu trình Krebs (hay còn được gọi là chu trình Citric Acid)

điển ra ở chất nên tỉ thé; 3) Chuỗi truyền electron được thực hiện ở mang trong tỉ thể

(hình 1.3) [4].

Quá trình hô hap diễn ra ba giai đoạn kế tiếp nhau Đầu tiên là quá trình đườngphan phân giải một phân tử đường glucose thành hai phân tử pyruvate, tiếp đến cácphân tử pyruvate tiền đến chu trình Krebs ở chất nền ti thể và cuối cùng dùng năng

lượng được tích luỹ ở hai giai đoạn trên dé bước vào chuỗi truyền electrone [4]

ph» hy ng Chi xảy ra trong hô hấp hiếu khí

hap kị khú

NaDH NAD*'+H* FADH, FAD+2H* 2H*'+1/2O2*HO P+ADP ATP

Hình 1.3 Chuỗi truyền diện tử của quá trình hô hap của tế bào [6]

Trong chuỗi truyền electron, oxygen được sử dụng làm chất nhận điện tử cuốicùng dé tạo ra nước (hình 1.2) Trong chuỗi truyền điện tử, khoảng 5% trong các phảnứng nay, oxygen sẽ nhận một điện tử tạo thành anion superoxide (Os") - phương trình (1) và các ion này qua phản ứng sẽ sinh ra H202 — phương trình (2) [1].

Cơ chất— e- + O-O* — O2 * (1)

2 O2* + 2H” — H202 + O› (2)

Gốc này (O2*) phản ứng trực tiếp với môi trường giữa hai lớp phospholipidkép của màng ti thé, khi đó nó khử ester và giải phóng ra các acid béo (hình 1.1), làmmat ôn định cau trúc phosphor lipoprotein Vì vậy, dưới tác động của các gốc tự do,

cầu trúc màng tế bào sẽ thay đôi, từ đó có thé thay đồi tính thâm chọn lọc của màng.

Tương tự như phản ứng trên, quá trình cho va nhận điện tử xảy ra liên tục như

dây chuyên thông qua các phản ứng oxi hoá khử trong tế bào tạo thành các gốc tự dokhác nhau Khi nồng độ vượt quá mức cho phép trong tế bào, các gốc này có thê lay

điện tử của các đại phân tử như DNA, protein, lipoprotein, từ đó gây ra các ton

thương, đứt gãy, thay đôi cau trúc cho các phân tử/đại phân tử vả cuối cùng làm thay

đôi chức năng của chúng [3].

Nông độ các gốc tự do trong tế bảo được gia tăng bởi sự tác động của nhiều

nhân to khác nhau ké cả bên trong va bên ngoai cơ thé như: chất phóng xạ bức xạ

chat hoá học (từ thực phẩm hoặc ô nhiễm môi trường), vi sinh vật (nam mốc, ) và

rồi loạn nội bao (mat cân bằng nội môi, sốc nhiệt, )

1.1.2 Tác hại của gốc tự do

Khi néng độ ROS trong tế bao cao, chúng sẽ gây hại cho tế bào và cơ thê.Chúng tan công các đại phân tử sinh học, lấy điện tử và gây ra các tôn thương Đây

là nguyên nhân của rất nhiều bệnh nguy hiểm như: ung thư, xơ gan, tiêu đường,

[7] Khi nông độ ROS trong tế bao cao, chúng sẽ gây hại cho tế bao và cơ thé Chúng

tan công các đại phân tử sinh học, lấy điện tử và gây ra các tôn thương Đây là nguyênnhân của rất nhiều bệnh nguy hiểm như: ung thu, xơ gan, tiêu đường, [7]

Hình 1.4 Tác hại của gốc tự do ROS đối với cơ thé người [8]

1.1.3 Chất chống oxi hoá tự nhiên

Đề bảo vệ cơ thể khỏi tác động của các gốc tự do, tế bào được trang bị một hệ

thống bảo vệ bao gồm các chất chống oxi hoá Cụ thé là các enzyme như SOD

(Superoxide dismutase) có khả năng chuyên hoá gốc Oz, (anion dioxide) thành H;O;;Hay emzyme catalase có khả nang phân huỷ H2O>2 thành nước va oxygen

Bên cạnh đó còn các chất chống oxi hoá từ nguồn gốc tự nhiên có khả năng

xúc tác phản ứng hoặc các chất chống oxi hoá như: acid ascorbic (vitamin C) có kha

năng loại bỏ gốc tự do trong môi trường nước; vitamin E giúp ngăn quá trình oxi hoá

của các acid béo chưa bão hoà của mang [2]

Một số hợp chat tự nhiên khác cũng thê hiện khả năng kháng oxi hoá: alkaloid, flavonoid, querecetin [2]

Các hợp chat phenolic được nghiên cứu có kha năng khang oxi hoá cao nhờ

vào các cơ chế: chuyên nguyên tử hydro (HAT) hay cơ chế chuyền điện tử đơn (SET),

chuyên điện tử mắt proton hay khử sắt là cơ chế hoạt động chống oxi hoá của các hợp

chat phenolic Một trong các chất quan trong từ hợp chat phenolic trong việc kháng oxi hoá chính là chat flavonoid [9]

1.2 TONG QUAN CÁC PHƯƠNG PHAP VE KHẢO SÁT KHẢ NANG

KHANG OXI HOÁ IN VITRO

1.2.1 Phương pháp khảo sát năng lực khử Fe (reducing power)

Phương pháp này được ra đời vào năm 1986 bởi Makoto Oyaizu [10] Sau nàyphương pháp này được sử dụng phô biến ở các phòng thí nghiệm và được cải biên

bởi Elmastas [11] Phương pháp này được ra đời vào năm 1986 bởi Makoto Oyaizu

[10] Sau này phương pháp này được sử dụng pho biến ở các phòng thí nghiêm và

được cải biên boi Elmastas [11].

Nếu mẫu thử (nước sắc lá di) là chất chống oxi hoá thì thuốc sắc sẽ đóng vai

trò là chất khử (chat cho electron) và KsFe(CN)¢ là chất oxi hoá (chất nhận

electron) Theo phương pháp, nếu nước sắc có khả năng chống oxi hoá sẽ là chat

cho electron cho K3Fe(CN)s biến thành K;Fc(CN)s Khi cho K¿Fc(CN)s tác dụng

với FeCl; sẽ tạo thành phức hợp K3[Fe(CN)] (có màu xanh) Phức hợp trên sẽ được

đo ở bước sóng 700nm, chi số OD càng lớn chứng tỏ phức hợp Ks[Fe(CN).] càng

nhiều trong dung dịch, qua đó cho thấy nước sắc có khả năng khử càng cao vì cho

nhiều electron, từ đó chứng tỏ được khả năng kháng oxi hoá của nước sắc.

K:Fe(CN); kết hợp với FeCls (theo phương trình ) thành phức K:[Fe(CN)¿] có

màu xanh Cường độ màu được do ở bước sóng 700 nm Nếu ở bước sóng này, giá

trị mật độ quang OD cảng cao thì năng lực khử Fe * thành Fe?* càng lớn; suy ra

khả năng chống oxi hoá của mẫu càng tốt.[ 12]

Phương pháp này có ưu điểm khi có thé áp dung dé đàng tại các môi trường

điều kiện phòng thí nghiệm vì được đánh giá là nhanh chóng, đơn giản và tiết kiệm.

Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm chưa thé kết luận được khả năng

kháng oxi hoá của mẫu thử theo cả hai cơ chế HAT (thử nghiệm đựa trên sự chuyên

giao nguyên tử) và SET.

1.2.2 Phương pháp khảo sát năng lực khử sắt (FRAP)

Phương pháp khảo sát năng lực khử sắt (FRAP) được ra đời vào năm 1985 bởi

Wayner, và được ứng dụng rộng rãi trong các thí nghiệm khảo sát khả năng kháng

oxi hoá của các chất [13]

Không giống với các phương pháp khác, phương pháp nay xác định hoạt tính chống oxi hoá của nước sắc trong điều kiện môi trường acid (pH = 3,6) Nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên khả năng khử của mẫu thử (nước sắc lá ôi) có khả

năng khử phức Fe** + TPTZ (màu tía) thành Fe?* + TPTZ (màu xanh) Khi đó, độ

tăng cường màu xanh tỉ lệ với ham lượng chất chống oxi hoá có trong mẫu thử Mức

độ này được đo ở bước sóng 593 nm trong sự so sánh với chất chuẩn là dụng dịch

FeSO, hay BHT (Butylated Hydroxyl Toluene).| 13]

Phương pháp nay còn nhiều hạn chế khi phức màu xanh Fe?* dé dành kết tủa nhanh chóng sau thời gian bỏ sung FeCls dẫn đến sai số trong thí nghiệm Dé khắc

phục nhược diém trên Berker (2010) đã dé xuất bỏ sung NaC;:H›sSO¿ một hợp chất

hỗ trợ duy trì độ pH ồn định.

Bên cạnh hạn chế trên, phương pháp FRAP được đánh giá là phương pháp đơngiản, nhanh chóng, tiết kiệm chi phí và không yêu cau các thiết bị chuyên dụng [13]

1.2.3 Phương pháp khảo sát khả năng bắt gốc tự do (DPPH)

Phương pháp khảo sát khả năng bắt gốc tự do được xây dựng bởi Blois vào năm

1958, Phương pháp này được sử dụng phé biến và phát triển, bd sung quy trình bởi

Brand — William vào năm 1995, và Bondet vào năm 1997 [14].

Phương pháp này sử dụng gốc 1,1 — diphenyl — 2 — picrylhydrazyl (DPPH) là

một gốc tự do bên, có màu tia và có độ hap thu cực đại ở bước sóng 517nm Khi có

mặt chất oxi hoá mẫu thử sẽ bị khử thành 2.2 - dipheny] - 1 - picrylhydrazine (DPPH

~ H) có mau vàng Do độ giảm độ hap thụ ở bước sóng 517nm để xác định khả năng

khử gốc DPPH của chat chống oxi hoá [13] Phương pháp này sử dụng gốc 1,1 diphenyl — 2 — picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, có mau tia và có độ hapthu cực đại ở bước sóng 517nm Khi có mặt chất oxi hóa, mẫu thử sẽ bị khử thành

-2,2 — diphenyl — 1 — picrylhydrazine (DPPH — H) có màu vàng Do độ giảm độ hap

thụ ở bước sóng 517nm dé xác định kha năng khử gốc DPPH của chat chống oxi hóa

điểm có thể xác định được nhiều loại chất chống oxi hoá tông hợp và tự nhiên Bên

cạnh đó thứ nghiệm TEAC có thé thực hiện ở phạm vị điều kiện pH rộng rãi, cũng

như có thé tan trong các môi trường khác nhau (đệm phosphate, ethanol, ) Chi phi

của phương pháp này rẻ và vận hành đơn giản [13] Phương pháp được công bó bởi

Miller và các cộng sự vào năm 1993, với ưu điểm có thê xác định được nhiều loại

chat chống oxi hóa tông hợp và tự nhiên Bên cạnh đó thử nghiệm TEAC có thé thực

hiện ở phạm vi điều kiện pH rộng rãi, cũng như có thẻ tan trong các môi trường khác

nhau (đệm phosphate, ethanol, ) Chi phí của phương pháp này rẻ và vận hành đơn

giản [ 13].

Cation ABTS+ (2, 2’ — azinonbis (3 — ethylbenzothiazoline — 6 — sulfonate) là

một gốc tự do bén- đây là một chất phát quang mau xanh, được đặc trưng ở độ hap

thu 734nm Khi cho mẫu thử dé kiểm tra khả năng chỗng oxi hoá vào dung địchABTS Sự hiện diện của chất chống oxi hoá trong dụng dịch sẽ cản trở sự tương tácgiữa các anion ABTS với các gốc peroxyl giảm sự hình thành cation ABTS [13]

Cation ABTS+(2,2’—azinonbis (3 — ethylbenzothiazoline —6-sulfonate)) là một gốc

tự do bén - đây là một chất phát quang màu xanh, được đặc trưng ở độ hap thu 734nm.

Khi cho mẫu thử để kiếm tra khá năng chéng oxi hóa vào dung dịch ABTS Sự hiện

diện của chất chong oxi hóa trong dụng dịch sẽ cản trở sự tương tác giữa các anion

ABTS với các gốc peroxyl giảm sự hình thành cation ABTS [13]

1.2.5 Phương pháp chống oxi hoá bằng cách bay các gốc tự do (TRAP)

Phương pháp trên sử dụng gốc peroxyl được tạo thành từ 2, 2` — azobis (2 —

amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) Khi cho AAPH vào môi trường plasma,

các chất khử sẽ bị oxi hoá Quá trình oxi hoá này được đo lường thông qua hàm lượng

oxi tiêu thụ bằng một điện cực Khi có mặt chất chéng oxi hoá trong môi trường

plasma, quá trình oxi hoá sẽ xảy ra chậm hon Giá trị TRAP của mẫu thí nghiệm được

tính toán dựa vào độ đài pha lag của mẫu so với độ đài pha lag của mẫu trắng và độ dai pha lag của chất chuẩn (dung dịch Trolox) [15].

1.2.6 Phương pháp xác định khả năng hấp thụ gốc tự do chứa oxi hoạt động

(ORAC)

Phương pháp này đo mức độ phân hủy do oxi hoá của fluorescein khi có sự hiệnđiện của gốc peroxy Phản ứng trong điều kiện này được so sánh với phản ứng trong

sự hiện điện của chất chuẩn Trolox (hay vitamin E), và mẫu thử Khi fluorescein bị

oxi hoá, cường độ phát huỳnh quang sẽ giảm đi, tiễn hàng đo độ giảm cường độ phátquang này liên tục trong 35 phút sau khi them chất oxi hoá vào Khi có mặt chất

chống oxi hoá, sự phân rã fluorescein sẽ chậm hơn [13].Phương pháp này đo mức độ phân hủy do oxi hóa của fluorescein khi có sự hiện điện của gốc peroxy Phản ứng

trong điều kiện này được so sánh với phan ứng trong sự hiện diện của chất chuan

Trolox (hay vitamin E), và mau thử Khi fluorescein bị oxi hóa, cường độ phát huỳnh

quang sẽ giảm đi, tiền hàng đo độ giảm cường độ phát quang này liên tục trong 35

phút sau khi thêm chat oxi hóa vào Khi có mat chất chống oxi hóa, sự phân rã

fluorescein sẽ chậm hơn [ 13].

Do điều kiện thí nghiệm, phương pháp kha sát năng lực khử Fe (reducing power)

và phương pháp bắt gốc tự do (DPPH) được lựa chọn đẻ thực hiện dé tài này.

1.3 TONG QUAN VE OI

13.1 Vi tri phan loại

Tén khoa hoc: Psidium guajava L., Ho sim (Myrtaceae)

Phân lớp: Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) - Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) —

Phân lớp Hoa Hồng (Roside) — Bộ Sim (Myrtales) - Họ Sim (Myrtaceae) — Chi

Psidium L — Loài Psidium guajava L [16].

Một số giống Oi phô biển ở Việt Nam: ôi Sẻ, ôi Huyền Châu, ôi Nữ hoàng ôi

xá lị nghệ, ôi ruột hồng da láng, ôi Dài Loan

1.3.2 Đặc điểm sinh thái Đặc điềm chung: Ôi là cây ăn quả phô biến, được trồng hầu như khắp các địa

phương, cả vùng đồng băng lẫn ở miền núi Là cây ưa sáng, sinh trưởng phát triển tốttrong vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới Giới hạn về nhiệt độ từ 15 — 45°C, nhiệt

độ tốt nhất cho cây sinh trưởng và cho nhiều quả là từ 23 — 28°C; lượng mưa 1000 —

2000 mm/nam Ôi ra hoa quả nhiều năm Cụm hoa thường xuất hiện trên những cành

non mới ra cùng năm Thụ phan nhờ gió hoặc côn trùng Vòng đời của cây Ôi có thể

tôn tại 40 — 60 năm Mùa hoa của cây Ôi sẽ rơi vào thang 3 — 4, quả sẽ rơi thang 8 —

9 Hiện nay với phương pháp nuôi cấy mô, các nhà nuôi trồng đã sản xuất ra giống ôikhông hat [17].

Đặc điểm sinh thái cụ thé của các giống Oi được nghiên cứu trong dé tài:

Về giống Oi: Nữ hoàng, Ruby, Sẻ được thu nhận tại xã Da Phước, huyện Binh

Chánh

Bình Chánh là vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa mang tính chất xích đạo có 2

mùa rõ rệt, mùa mưa (từ tháng 5 đến thắng 11), mùa khô (từ tháng 12 đến thing 4

năm sau) Nhiệt độ khu vực này tương đối ôn định, trung bình cao khoảng 26.6.

Lượng mưa trung bình khu vực Độ âm không khí trung bình năm khá cao 79,5%,

Thời tiết của huyện Bình Chánh với các đặc điểm khí hậu nóng âm, nhiệt độ tương đối ôn định, thuận lợi cho sản xuất nông lâm nghiệp, tuy nhiên vì lượng mưa tập trung theo mùa nên sẽ xảy ra hạn han ở một sỐ kỳ [18].

Khu vực xã Da Phước huyện Bình Chánh có nguồn đất phù sa được hình thành

các tram tích ven các sông, kênh rạch Đất có thành phan cơ giới cấp hạt sét là chủ yếu (45 — 55%), cấp hat cát cao gấp 2 lần cấp hạt limon Độ pH xap xi 4 các ion Ca2+, Mg2+, Na+ có tỉ lệ tương đối cao; CEC tương đối cao, độ Bazo cao, có các chất dinh dưỡng cao (min, dam, kali) là môi trường đất lí tưởng cho việc trồng cây

ăn trái [18].

Hình 1.6 Vị trí thu lá ôi giống i Sẻ

Về giống Oi Huyén Chau duge thu nhan tai quan Binh Tan thanh phô Hỗ Chí

Minh Khu vực thu mẫu lá ôi Huyền Châu thuộc phường Tân Tao A, là khu vực có thé nhưỡng là dat phù sa màu mỡ, địa hình thấp phù hợp cho việc trồng trọt các loại

cây ăn trái tiêu biêu như ôi [19].

a Hình chụp mặt trên lá ổi Nữ hoàng _b Hình chụp mặt dưới lá di Nữ hoàng

c Hình chụp mặt trên cành ôi d Hình chụp mặt dưới cành ôi

Nữ hoàng Nữ hoàng

Hình 1.8 Hình thái lá ôi Nữ hoàng

Đặc điểm hình thái lá ôi Nữ hoàng: Phién lá nguyên, hình bau dục, gốc lá bằng,chóp tròn Dé dai của lá khoảng 9 — 10 em Phiến lá có lớp lông ở cả hai mặt Mặt

trên có màu xanh đậm hơn mặt dưới Gan lá hình lông chim, gần giữa nôi rõ ở mặt

dưới Mép lá nguyên Lá đơn mọc cách phần cuống ngắn, không có lá kèm Cành

cây có màu xanh nhạt và mềm.

a Hình chụp mặt trên lá ôi Ruby đỏ b Hình chụp mặt dưới lá ôi Ruby đỏ

c Hình chụp mặt trên cành lá ôi d Hình chụp mặt dưới cành lá ôi

Ruby đỏ Ruby đỏ

Hình 1.9 Hình thái lá ôi Ruby đỏĐặc điểm hình thái lá ôi Ruby đỏ: lá 6i Ruby đỏ lá đơn, mọc đối, không có lákèm Phiến lá nguyên, hình tim ngược có góc lá bing va chop lõm, phiến lá to, mép

lá nguyên đài khoảng 10 — 15cm Mặt trên có màu xanh đậm so với mặt đưới Phiến

lá mịn, trơn nhãn Gan lá hình lông chim, gân giữa nôi rõ ở mặt dưới.

1.3.3.3 Lá 6i Sẻ

a Hình chụp mặt trên của lá ôi Sẻ b Hình chụp mặt đưới của ôi Sẻ

c Hình chụp mặt trên cành lá ổi Sẻ — d Hình chụp mặt dưới cành lá ôi Sẻ

Hình 1.10 Hình thái lá ôi Sẻ

Đặc điểm hình thái lá ôi Sẻ: lá đơn, mọc đối, không có lá kép Lá ôi Sẻ có nhữngđặc điểm phiến lá dài khoảng 10 — 15cm, phiền lá rộng có hình elip gốc lá nhọn vàchóp lá nhịn, mép lá nguyên Phién lá mịn, trơn nhẫn, hai mặt của lá có màu xanhtương đương nhau Gan lá có hình lông chim, gân giữa nỗi rõ ở mặt dưới Cành lá

sam màu, và cứng.

1.3.3.4 Lá 6i Huyền Châu

Đặc điểm hình thái lá ôi Huyền Châu: Lá ôi Huyền Châu là lá don, mọc đối

không có lá kèm Phién lá có những đặc điểm như: đài khoảng 10 — 15cm, phiến lá rộng có hình elip, gốc lá nhọn và chóp lá nhịn, mép lá nguyên Phién có lông, hai mặt

của lá có màu xanh tương đương nhau Gân lá có hình lông chim, gân giữa nôi rõ ở

mặt dưới Cành lá có lông và mềm

1.2.4 Tác dụng của lá ôi theo Đông Y

Đông y có nhiều phương pháp chế biến và sử dụng thuốc khác nhau như: thuốc

viên, thuốc thang, thuốc cao, thuốc tán Về ôi , Đông y sử dụng cao lá ôi đưới dạng thuốc cao Ôi thường nau thành nước sắc gọi là cao nước Thuốc cao nước được chia

làm bốn loại: cao lỏng, cao mềm, cao đặc và cao khô Cao lỏng thường có mùi đặc

trưng của được liệu, được dùng trực tiếp để trị bệnh, tỉ lệ giữa nước và khối lượng

được liệu thường là 1:1 Nếu cao lỏng tiếp tục được cô đến khi còn hàm lượng nước

20 - 25% thì được gọi cao mém, cao đặc còn khoảng 10 — 15% nước khi hàm lượngnước còn đưới 5% thì được gọi cao khô Ưu điểm cao nước là tận dụng được hết tỉnhchất của thuốc, vị thơm, dễ sử dụng va dùng dé bồi bổ hoặc trị các bệnh mãn tính

Tuy nhiên nhược điểm của loại thuốc này là không thé bảo quản thời gian dai [20].

Theo y học phương Đông, ôi là một trong những dược liệu có nhiều công dụng

cho việc chữa trị O dân gian, người ta sử dụng lá non và búp ôi dé trị đau bụng, đi

ngoài ở dan gian bang cách nau nước sắc hoặc thuộc pha Lá ôi được chế biến như lá

chè dùng 15 - 20 g lá non hay búp dé nau nước sắc và uống giúp phòng trị các bênh

đau bụng, tiêu chảy [21].

Quả ôi khi chưa chính có vị chát, thường được dùng dé trị tiêu chảy tuy nhiên

6i kho chín là một nguồn thức phẩm có chức năng nhuận tràng [21]

Bên cạnh đó, cây ôi còn có khả năng kháng khuân tốt, đặc biệt là vỏ rễ và thânđược dùng đê chữa rửa, đắp vết thương, lở loét [21]

1.4 CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN DEN DE TÀI

1.4.1 Trong nước

Dai Thị Xuân Trang và cộng sự (2012) da chứng minh cao chiết lá ôi có tác

dụng hạ đường huyết trên chuột nhất trắng Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng cho thay

kha năng ức chế hoạt động của enzyme a — glucosidase của các cao chiết lá di theo

thứ tự giảm dan như sau: cao methanol, cao nước và cao butanol Nghiên cứu cũng

chỉ ra khả năng ức chế hoạt động enzyme a - amylase của cao lá Oi, tăng dần theo

chiều tăng nồng độ Qua kết quá nay là minh chứng khoa học cho thấy cao chiết từ lá

Oi có kha năng điều trị bệnh tiêu đường theo cơ chế ức chế hoạt động của enzyme

thủy phân tinh bột là a — amylase và a — glucosidae [22].

Đỗ Văn Mãi va cộng sự (2017) nghiên cứu về những cây thuốc có hoạt tínhchống oxi hoá, trong đó cao chiết lá Ôi thê hiện hoạt tính chống oxi hoá cao nhất so

với các mau cây cùng khảo sát khác với giá trị IC50 là 52,49 ug/mL Kết quả nghiên

cứu cũng cho thấy các loại cao chiết lá Oi có nhiều chất kháng oxi hoá nhưpolyphenol, flavonoid, carotenoid [23 ].

Trương Quynh Như va cộng sự (2018), chứng minh ảnh hưởng của chiết xuất

lá ôi và diệp hạ châu lên đáp ứng miễn dịch của tế bào bạch cầu cá Tra kết quả cho

thay chiết xuất từ lá ôi có tác động tích cực lên các chỉ tiêu miễn dịch được khảo satnhư: hoạt tính lysozyme và tong kháng thé của các nghiêm thức có bô sung chất chiếtxuất tăng đáng ké so với nghiệm thức đối chứng [24]

1.4.2 Ngoài nước

Theo Chang Ho Jeong và cộng sự (2012), đã nghiên cứu hoạt tính chống oxi

hoá từ nước sắc của ba loại lá ôi Ruby, Apple color và Safeda đã cho thay khả năngbắt gốc tự do của chất chiết xuất trong của nước sắc lá ôi Ruby với 93,51% là caonhật, tiếp đến là Safeda (91,15%) và Apple color là 57,63% ở nồng độ 62 ug/mL

Tương tự với các hoạt tính khác như loại bỏ các góc ABTS khả năng khử sắt, thử

nghiệm FRAP, đều cho kết quả hoạt tính của lá ôi giống Ruby luôn cao nhất và

Apple color là giống có hoạt tính thấp nhất trong ba loại Qua nghiên cứu cho thấy lá

ỗi được coi như một nguồn chất chống oxi hoá hiệu quả những thường xuyên bị lãng

phí do quá trình cắt tia khi trồng trọt [25] Qua nghiên cứu cho thấy lá di được coi

như một nguồn chất chống oxi hóa hiệu quả những thường xuyên bị lãng phí do quá

trình cắt tía khi trồng trọt [25].

Nam 2022, Muhammad Anees Ur Rehman va cộng sự đã tim ra các tiêm nang

được lý của bột lá Oi theo tác gia bột lá Oi có khả năng trị ho như một loài dược liệu,

còn có thé chẳng dị ứng và được sử đụng như loài thuốc dân gian ở vùng đông bắc

Án độ dé trị các bệnh đường ruột do giun gây ra Bên cạnh đó tác dụng chống oxi hoá

nhờ khả năng bắt gốc tự đo mạnh , và chong ung thư do tác dụng chống đột biến gene

ở lá ôi.chống tiêu chảy, bảo vệ gan cũng được chứng minh trong thí nghiệm và nghiêncứu cũng chỉ ra rằng dịch chiết lá ôi có khả năng kháng khuẩn cao đối với các chủng

vi khuẩn Gram dương Đặc biệt dịch chiết lá Ôi có thé chống đái tháo đường hạ

đường huyết, chong mỡ trong máu và bảo vệ da dày - là những căn bệnh của hiện đại

[26].

Chương 2: ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Nước sắc lá ôi thuộc các giống: Nữ hoàng, Ruby đỏ, Sẻ, Huyền Châu Trong

đó, Nữ hoàng va Ruby đỏ được thu tai địa chi D12/342 ap 4 Da Phước huyện Binh

Chánh Minh (vị trí địa lí được minh hoạ theo hình 2.2) Lá ôi Sẻ tại địa chỉ D13/371

ấp 4 xã Đa Phước, huyện Bình Chánh tại thành phố Hồ Chí Minh Minh (vị trí địa

lí được minh hoạ theo hình 2.3) và lá ôi Huyền Châu tại 4324/10/20 Nguyễn Cửu

Phú phường Tân Tạo A quận Bình Tân Hồ Chí Minh (vị trí địa lí được minh hoa theo hình 2.1) Lá sau khi thu được rủa sạch, say khô và bảo quản Thu nhận nước

Hình 2.1 Vị trí toa độ của địa chí thu nhận lá ôi Huyền Châu

2.2 THIẾT BỊ VÀ HOÁ CHÁT

2.2.1 Thiết bị

Thiết bị được sử dụng trong đề tài được trình bày theo bảng 2.1.

Bảng 2.1 Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài

STT Tên thiệt bị Hãng sản xuât

Ï Bếp điện - Sanaky

2 | Tủ lanh “Toshiba

=— 3 | Máy li tâm lạnh Hettich Zentrifugen

4 Máy li tam 8 ông - Hettich Zentrifugen

5 Quang phô ke UV Amersham Biosciences

6 Cân điện tử Ohaus

7 Tu say -_ Memmert

|

9 Pipetman 1000uHL SCI Logex

10 Pipetman 200uL Bio - Rad

2.2.2 Hoá chất

* Các hoá chất được sử dụng trong thí nghiệm năng lực khử gồm:

+ Ascorbic acid (Sigma — Aldrich) có nông độ 15,6 ug/mL; cách pha: cân 0.0016 g ascorbic acid và bổ sung 10 mL nước cất được dung dịch gốc có nồng độ

156 pg/mL Từ dung dịch này pha loãng 10 lần dé được dung dịch mới có nồng độ can sử dụng Lưu ý: bảo quản ở điều kiện tránh ánh sáng và sử dụng trong ngày.

+ Đệm phosphate có pH = 6,6; cách pha: cân 0,585 g NaH;PO; va 0.8058 g

Na:HPO; trong 60 mL nước cat Lưu ý: hoá chất cần được sử dụng trong ngày

+ K:[Fe(CN)] có nòng độ 1%; cách pha: cân 0,606 g Ka[Fe(CN)o] và bỗ sungthêm 60 mL nước cất Lưu ý: hoá chất cân được sử dụng trong ngày

+ TCA có nông độ 10%; cách pha: cân 6,6668 g TCA và bố sung thêm 60 mL

nước cất Lưu ý: bảo quản trong điều kiện không có ánh sáng

+ FeCls có nồng độ 0.1%; cách pha: cân 0,033 g FeCl: và bô sung them 20 mL

nước cất Lưu ý: hoá chất cần được sử dụng trong ngày

* Các hoá chất được sử dung trong thử nghiệm bắt gốc tự do DPPH:

+ DPPH (Sigma — Aldrich) có nồng độ 0,08 mM; cách pha: cân 3,3 mg DPPH

và pha trong methanol tuyệt dối tạo thành 100 mL dung dịch có nông độ 0.08 mM.

Lưu ý: dung dịch được bảo quản trong điều kiện không có ánh sáng.

+ Ascorbic acid (Sigma — Aldrich) được pha loãng 6 các nông độ 5, 10, 15, 20,

25 ug/mL dé dựng đường tương quan và xác định giá trị ICsa làm chứng dương cho

qui trình Theo đó, gia trị ICs» được xác định là 13,9 ng/m (kết quả đường chuân được

trình bày ở phụ lục) Cách pha ascorbic acid được trình bày như hoá chất trong thử

nghiệm năng lực khử.

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp thu và xử lí mẫu

Lá ôi sau khi được thu nhận, được xử lí theo qui trình minh họa dưới đây (Hình 2.4)

= P

Rủ h "mịnửa sạch, nơi khô

phơi khô I> ráo

mẫu thoáng

mát

2.3.2 Phương pháp thu nhận nước sắc

Qui trình thu nhận nước sắc lá ôi trong dé tai duoc thuc hién va duoc minh hoa bang

Hình 2.5 Sơ đồ qui trình thu nhận nước sắc nồng độ 100%

Qui trình thu nhận nước sắc được thực hiện theo Hồ Huỳnh Thuy Dương (2006) [27].

2.3.3 Phương pháp khảo sat kha năng kháng oxi hoá in vitro

2.3.3.1, Phương pháp xác định năng lực khứ

Quy trình xác định năng lực khử được thực hiện theo Makoto Oyaizu minh họa

theo sơ đô hình 2.6 [10].

Các nông độ nước sắc được kháo sát là: 100%; 10%; 1%; 0,5%; 0,1%; 0,05%;

0,01%; mỗi nông độ được lặp lại 3 lần; chứng âm của thí nghiệm: nước cat 2 lần;

chứng dương là acid ascorbic có nồng độ 15,6 pg/mL

Bo 2,5 mL

1 mL mẫu thử ở dung dịch đệm Bé sung 2,5 mL

các nồng độ khảo hoanh dung dịchphosphate

á sát pH = 6,6 K,Fe(CN), 1%

Li tâm ở 3 000 Bồ sung 2,5 mL ở nhiệt độ

vòng/phút trong dung dich TCA 50°C trong 20

Hình 2.6 Sơ đồ quy trình phương pháp xác định năng lực khử

2.3.3.2 Phương pháp thứ hoạt tinh bay gốc tự do DPPH

Trong dé tài, thử nghiệm bay gốc tự do DPPH được thực hiện theo quy trình do Blois xây dựng vảo năm 1958 và được bô sung chính sửa bởi Brand — William vào năm 1995 được minh họa dưới dạng sơ đô (Hình 2.7) [28].

Hình 2.7 Sơ đồ quy trình phương pháp bẫy gốc tự do DPPH

Các nông độ được khảo sát ở nước sắc lá ôi là: 0,001%; 0,005%; 0,01%; 0,05%;

0,196; 0.5%; 1% Đây là các nông độ được suy luận ra dựa trên kết quả khảo sát năng

lực khử Trong mỗi nghiệm thức các nông độ được lặp lại 3 lan Chứng âm của thí

nghiệm: nước cất 2 lan Chứng dương của thí nghiệm: acid ascorbic nòng độ 13,9

ODc: Giá trị mật độ quang của nước cất

ODm: Giá trị mật độ quang của nước sắc lá ôi tại từng nông độ của từng giống

Từ tỉ lệ phần trăm DPPH, phương trình tương quan tuyến tính được sử dụng dé

xác định giá trị ICso là phương trình logarithmic: y = a + b.In(x)

Với y: tỉ lệ phan trăm bay gốc tự do DPPH; x: nông độ nước sắc được pha loãng:

a và b là hệ số được xác định bang phần mềm thông kê SPSS 16.0.

2.3.4 Phương pháp xử lí số liệu

Trong đề tài, các thông số như giá trị phần tram được xử lí bằng phần mềm

Microsoft Excel 365 Các thông số khác như: trung bình, độ lệch chuẩn, sự khác biệt, xác xuất p-value, phương trình tương quan được xử lí bằng phần mềm thống kê SPSS

16.0.

Chương 3: KET QUÁ NGHIÊN CỨU3.1 KET QUA NGHIÊN CỨU

3.1.1 Kết quả năng lực khử Fe?"

3.1.1.1 Năng lực khứ Fe2+ của nước sắc lá 6i Nữ hoàng

Nước sắc lá ôi Nữ hoàng được khảo sát năng lực khử ở các nông độ khác nhau.

Chứng âm là nước cất; mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Kết quả năng lực

Theo chiều tăng nông độ từ 0,01% đến 0,5%, giá trị OD của nước sắc lá ôi Nữ

hoàng tăng dan từ 0,156 lên 2,056 so với chứng âm (0,099) Theo đó, giá trị OD ở tat

cả nông độ déu có sự khác biệt về mat thông kê với a = 0,05 Ở nông độ 1%, giá trị

OD vượt ngưỡng đo được của máy quang phỏ ở phòng thí nghiệm Di truyền — Tiềnhoá (>3) Theo nguyên tắc của phương pháp năng lực khử Fe?*(da được trình bày ở

chương 1), giá trị OD càng cao, năng lực khử Fe** của nước sắc càng cao va ngược

lại Nang lực khử Fe** càng cao thì hoạt tính chống oxi hoá của nước sắc càng mạnh

theo thử nghiệm in vitro.

3.1.1.2 Năng lực khử Fe®* của nước sắc lá ôi Ruby đó

Giá trị OD của nước sắc lá Gi Ruby đỏ tăng từ 0,115 đến 2.014 (các giá trị có

sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thông kê, a = 0.05) ứng với các nông độ từ 0,01% đến

0.5% so với chứng âm (0,050) ( xem bang 3.2) Giá tri OD càng cao thì nang lực khử

Fe?* thành Fe** càng mạnh, hoạt tính chống oxi hoá càng tăng Ở nồng độ 1%, nhưnước sắc lá Ôi Nữ hoàng, giá trị OD không ghi nhận được >3 Tương tự như thí

nghiệm trên, nước sắc lá ôi Ruby được pha loãng từ nồng độ 100% xuống các nồng

độ khảo sát; mỗi nghiệm thức đều lặp lại 3 lân

Bảng 3.2 Giá trị OD của nước sắc lá ôi Ruby đỏ theo nồng độ

3.1.1.3 Năng lực khử Fe°" của nước sắc lá oi Sẻ

Tương tự các nghiệm thức được thực hiện trong thí nghiệm này gồm: chứng

âm, nước sắc lá ôi Sẻ (0,01% - 1%) được bố trí như bảng 3.3 Kết quả về năng lực

khử Fe** được ghi nhận theo bảng dưới đây.

Bảng 3.3 Giá tri OD của nước sắc lá ôi Sẻ theo nồng độ

Ghi chú: a, b, c, d là sự khác biệt có ý nghĩa về mat thông kê với a = 0.05

Nhận xét:

Theo chiều tăng nồng độ từ 0,01% đến 0,5%, giá trị OD của nước sắc lá ôi Sẻ

tang dan từ 0,135 lên 2,313 Theo đó, giá trị OD ở tất cả nòng độ đều có sự khác biệt

về mat thống kê với a = 0,05 Ở nồng độ 1%, giá trị OD >3 Giá tri OD phan ánh

năng lực khử Fe’ thành Fe** của nước sắc ôi Sẻ