Khóa luận tốt nghiệp Sư phạm sinh học: Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính ức chế Enzyme α - glucosidase của nấm cộng sinh địa y Nigrovothelium inspersotropicum

Cao chiết nam được nuôi 6 tuần trên môi trườngMYA thay đường sucrose băng đường D-glucose Cao chiết nắm được nuôi 8 tuần trên môi trường MYA thay đường sucrose băng đường D-glucose Cao c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRUONG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

LE NGUYEN CAO DUONG

KHOA LUAN TOT NGHIEP NGANH SƯ PHAM SINH HOC

THÀNH PHO HO CHÍ MINH - 2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRUONG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

LE NGUYEN CAO DUONG

KHOA LUAN TOT NGHIEP NGANH SƯ PHAM SINH HOC

NGUOI HUONG DAN KHOA HOC

TS Tran Thi Minh Dinh

THÀNH PHO HO CHÍ MINH - 2024

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô TS Trần Thị Minh Định - người đã tậntinh giúp đỡ hướng dẫn em trong suốt quá trình học tap, nghiên cứu và hoan thiện

khóa luận này.

Em xin chân thành cảm ơn Trường, Phòng Đảo tạo, các thầy cô trong Khoa Sinh

học - Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hỗ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi

cho em thực hiện khóa luận nảy.

Bên cạnh đó, em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô ở phòng Hóa học phân

tích — Khoa Hóa học — Trường Dai học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh, các thay

cô ở Trung tâm Khoa học va Công nghệ Sinh học Trường Đại học Khoa học tự nhiên

đã hỗ trợ và tạo điều kiện dé em được sử dụng các thiết bị trong suốt quá trình thực

hiện khóa luận tốt nghiệp

Qua đây, em cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè

đặc biệt là những bạn thực hiện nghiên cứu ở phòng Sinh hóa — Vi sinh đã nhiệt tinh

giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận này.

TP Hồ Chí Minh, ngày 17 tháng 05 năm 2024

SINH VIÊN

Lê Nguyễn Cao Dương

MỤC LỤC

LOL CAM 0 .ẽ 6.6 6-4444 i

MOG LUI c6 6120001600110655600200010000101210092002000001001000031.1050 ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIET TẮTT - 22: ©2222222SS22SS222223Z222zcEEzccrzerrred iv

BANU CA CHINN rcsssticsirescrcneanniimnsimeniemnaanumnemenanananenee vi

DANH MỤC CAC BANG Woes ccsoccsssssesssseeessseesssecsssvesersueessseessneesnsieesssecsssicennseeessees vii

lở cass cavaecsscenssssssssesasteanesasesstuestsstssesussssnsnanseaeneenusenienieentsertseais |

1 Lido chon nh I

2.iMetiệniighiÊHD(CỨUtccaosiianioniiiiiiiiiitiiti3i1131081116511544388313811883338138854383518818588588585853E 2

3 Đối tượng nghiên cứu 2: ©++22E++z£EC24E22112221127222411711122111222221-212 2

4.Nhiệm vụ nghiÊn CỨU!:::::::c::cocccccpiosiiostiistioSi0030201121181851502121461545555515651888558535535884555 3

Os Hai Vì'HEHIỆN CỮ.rsirisnisiiiisiiiaiiisiiigiTi81113111351126114416568138185581585E8853536138448385538555855) 3

6 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2-22 ©t+2xt£2xt2ZxS222EE2SEE22EEzrrrrrrrccre 3

Chương 1 TONG QUAN c1 022020001111 1221011 111100 01110101 1 1 g1 sg 4

1.1 Tổng quan về bệnh đái tháo đường 2: 2©z££SSz£cSEe2EEZ22xzcEEzecrvcrre =

1.2 Tong quan về enzyme 0 — #Ïu€OSiđi§€ 22-22222222 2223222312222 222cc 5

1.3 Tơng quan về dia y và ảnh hướng của điều kiện nuơi cay đến hoạt tính sinh học

Dị COng hai iẢ3ỮẢ 71.4 Tơng quan về nam N inspersotropicum ccssesssessssessssssssscssecssecsssesssecssnessnessnecss 8

1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoải nước - - se ssieseieeieieerree 10

Chương 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2:Ï, Wat Tie MTGE CON án inoeieiiiiiiiiiieiiinbitioitieidii151110611045816310853383008361853 12

2.2 Thiết bị và hĩa Chat cccceccscccssesssesseessessessessecssvessessesssssnennvsaveavesetsnvsssaaveaveensenes 12

DQ Thidt Bi DŨDŨỪừ.aaaă 12

B.2: 0N IBIEHBE,, 2c si coi nrioUiereorrraiitrEorticeroigrnercrritec 122:3; PUGH PNAO Me ICH CUE cscscsecssssussascsssazaassasascassoaseverseatseesansassesusnesseatasaaseatseeaises 132.3.1 Phuong pháp tạo môi trường và nuôi MAM ccccseceeesceeeceeessesesseesssecsseeesees 13

2.3.2 Phuong pháp tao cao ethyl aCetafe Hs ng gxc l4

2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tinh ức chế enzyme a — glucosidase l4

2.3.4 Phương pháp xử lí số liệu 2-22 22222E22EEE2EE2EE222E2222E22117 1722 2xcrree l6

218 OGRA EIS ODN 2 ssi26146226111101630163)50535053)13511550355353513853193503559565358533593153303142353153 ló

Chương 3 KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN -2-©2222S2ccc2zeczxecrxecrreee 18

3.1 Kết quả nuôi nắm và tạo cao ethyl aCetaf€ - ¿s22 2222221222222 22zsrree 18

3.2 Anh hưởng của nguồn carbon đến hoạt tinh ức chế enzyme a-glucosidase 23

3.3 Ảnh hưởng của điều kiện chiều sáng đến hoạt tính ức chế enzyme

a-IEIUCDSIUNB qiatisiiiigigi211151013611510133118411843136159555185318515833184165231881855858555588593613943536118865823883 25

3.2 Giá trị ICso của cao chiết nam sáng 8 tuần và D-glucose 8 tuần 26REET UA VARIN ING I sscisssasscsescssssssvevvsssssoususssesasosaussevnssvoseasssanvsstonasistsnsoseos 32IIKSPHIN, a co cốc cốc 32

mẻ nh 32

EU ,2:.221022022542122:21212222200120112605232212222712200110212101221721212311221132011200321102i56222122 38

PHÚ LỰC 2::::-s:::‹::-:::-:-:cc-:::-ccccicctpccpiin0DS102A5171061261305380351258384615483886586535638886886555856 39

PFHU|UU ibisicciiiioiiiiiiiiiiiiiiiiisiiiaiit210120113101201052119234331394513655346383583043654918241036858558350 40

DANH MUC CAC CHU VIET TAT

Dai tháo đường

Glycoside hydrolase

Malt yeast agar

p-nitrophenyl a-D-glucopyranoside

a-glucosidase inhibitors

International Code of Botanical Nomenclature

Human Immunodeficiency Virus

Acquired Immuno Deficiency Syndrom

Dimethyl sulfoxide

Cao chiết nam được nuôi 6 tuần trên môi trường

MYA thay đường sucrose băng đường sorbitol

Cao chiết nắm được nuôi 8 tuần trên môi trường

MYA thay đường sucrose băng đường sorbitol

Cao chiết nam được nuôi 10 tuần trên môi trường MYA thay đường sucrose băng đường sorbitol

Cao chiết nắm được nuôi 12 tuần trên môi trường

MYA thay đường sucrose băng đường sorbitol

Cao chiết nắm được nuôi 8 tuần trên môi trườngMYA thay đường sucrose băng đường mannitolMan 10 tuân Cao chiết nam được nuôi 10 tuần trên môi trường

MYA thay đường sucrose băng đường mannitol

Cao chiết nam được nuôi 6 tuần trên môi trường

MYA thay đường sucrose băng đường D-glucose

Cao chiết nắm được nuôi 8 tuần trên môi trường

MYA thay đường sucrose băng đường D-glucose

Cao chiết nam được nuôi 10 tuần trên môi trường

MYA thay đường sucrose bằng đường D-glucose

Cao chiết nắm được nuôi 12 tuần trên môi trường

MYA thay đường sucrose băng đường D-glucose

Cao chiết nắm được nuôi 6 tuần trên môi trường

MYA với thời gian chiếu sáng 12 tiếng/ngày

Cao chiết nắm được nuôi 8 tuần trên môi trường

MYA với thời gian chiều sáng 12 tiéng/ngay

Cao chiết nắm được nuôi 10 tuần trên môi trường

MYA với thời gian chiếu sáng 12 tiếng/ngày

Cao chiết nam được nuôi 12 tuần trên môi trưởng

MYA với thời gian chiều sáng 12 tiếng/ngày

Cao chiết nắm được nuôi 6 tuần trên môi trường

MYA hoàn toàn trong bóng toi

Cao chiết nắm được nuôi § tuần trên môi trường

MYA hoàn toản trong bóng tôi

Cao chiết nắm được nuôi 10 tuần trên môi trường

MYA hoàn toàn trong bóng tôi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hinh 1.1 Địa y Nigrovothelium inspersotropicum [Š7T] - -sccccSseeersse 9

Hình 2.1 Quy trình thực hiện fh - 17

Hình 3.1 Khuan lạc nắm được nuôi ở các môi trường trong 6 tuân 18

Hình 3.2 Khuân lạc nắm được nuôi ở các môi trường trong 8 tuần 19

Hình 3.3 Khuan lạc nam được nuôi ở các môi trường trong 10 tuần 20

Hình 3.4 Khuan lạc nắm được nuôi ở các môi trường trong 12 tuần 21

Hình 3.5 Đồ thị tương quan giữa log10 nông độ cao sáng 8 tuần với tỉ lệ phan trăm

dic: Chế enzyme G-gÏlE0811Ì356 cc1 01 10 10 20524062400221024006440054092404350822 28

Hình 3.6 Dé thị tương quan giữa log10 nông độ cao D-glucose 8 tuần với tỉ lệ phan

trăm ức chế enzyme œ-glueosidase -22-22©2z+2Ez22ZztE2EE222Zxecrxecrreee 29 Hình 3.7 Đồ thị tương quan giữa log10 nông độ acarbose với tỉ lệ phan tram ức chế

ENZYME G:BÏIEOSIẢRSỂ ::ccosoiioiiiooioniiizsi20416135115155861525312581831958886585833885858555659585188358838855.31

DANH MỤC CAC BANG

Bảng 2.1 Các thiết bị sử đụng trong đề tài 2 0 2t cu 2222002202102 xe 12Bang 2.2 Các hóa chất được sử dung dé tạo môi trường nuôi nắm - l3

Bảng 2.3 Các hóa chất được sử dụng tao cao chiết và thir hoạt tinh ức chế enzyme GEPIUGDSIGHSG1 2102220221222.2122.222222201121011201201023322301222223112111213423132311220122139211444192149323424:325 l3

Bảng 2.4 Thể tích cao nam pha loãng ở nồng độ 200 ug/mL -.5-5555: 14

Bảng 3.1 Khối lượng sinh khối khô và cao chiết nam thu được 22

Bang 3.2 Khả năng ức chế enzyme a-glucosidase của cao chiết nắm N,

inspersotropicum nuôi cây trên môi trường MYA khác nhau về nguồn carbon 23

Bảng 3.3 Tỉ lệ (%) ức chế enzyme a-glucosidase của cao chiết nắm N.

inspersotropicum nuôi cây trên môi trường MYA khác nhau về thời gian chiều sáng

S3038538558123iS583156g38339953136388523758516838E8815833858181883856918513883853038ã81568183855615gg02975618883058575815988 25

Bảng 3.4 Ti lệ (%) ức chế enzyme a-glucosidase của cao chiết từ sinh khối nắm

được nuôi ở điều kiện có ánh sáng trong 8 tuần 222 222 2zz2xzz2xsecxzec 27

Bảng 3.5, Tỉ lệ (%) ức chế enzyme a-glucosidase của cao chiết D-glucose 8 tuần 28Bang 3.6 Ti lệ (%) ức chế enzyme a-glucosidase của acarbose 30

Bảng 3.7 Kết qua phân tích tương quan phi tuyến tính giữa tỷ lệ ức chế enzyme

a-glucosidase với nồng độ cao chiết nam 8 tuân và thởi gian chiếu sáng 12 h/ngay 38

Bảng 3.8 Kết qua phân tích tương quan phi tuyến tính giữa tỷ lệ ức chế enzyme

ơ-glucosidase với nông độ cao chiết nam 8 tuần trên môi trường chứ đường D-glucose

Bang 3.1 Kết qua phân tích tương quan phi tuyến tính giữa tỷ lệ ức chế enzyme glucosidase với nông độ acarÐose - cóc." 020186486308 6046 40

ơ-MỞ DAU

1 Lí do chọn đề tài

Bệnh đái tháo đường (DTD) là một căn bệnh man tinh, xảy ra khi tụy không san

xuất đủ insulin hay cơ thé sử đụng không hiệu quả insulin do tụy sản xuất làm cho

nông độ glucose trong máu tăng cao [1] DTD được phân thành ba loại phô biến la

DTD tuýp 1, DTD tuýp 2 và DTD thai kì [2] Trong đó, DTD tuýp 2 được xem như

một cuộc khủng hoáng đối với sức khỏe toàn cầu do có tỉ lệ người mắc cao nhất và

ngày cảng có nhiều thanh thiếu niên mắc phải [3] Các biến chứng gặp phải khi mắc

bệnh DTD bao gồm bệnh tim mạch, bệnh thận, rồi loạn chức năng va suy yếu các cơquan khác nhau, đặc biệt là mắt, thần kinh, tim và mạch máu [4], [5]

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), DTD tuýp 2 có tỉ lệ người mắc cao nhất

chiếm 90% đến 95% tông số người mắc bệnh DTP trên toàn thé giới Độ tuôi mắc

PTD tuýp 2 phô biến nhất là những người trên 45 tuôi, nhưng hiện nay, ngày càng có

nhiều trẻ em và thanh thiểu niên mắc bệnh nay [6], nguyên nhân gây bệnh có thé 1a

do yêu tô di truyền, béo phì, chế độ an uống không hợp lí hoặc it vận động thé chất

[7] Các nguyên nhân đặc trưng như béo phì, giảm sự hoạt động của insulin hay nhữngbat thường ở tế bao j tuyến tụy trong tiết insulin lam gia tăng lượng glucose trong

máu gây DTD tuýp 2 [8] Vì vậy, nguyên tắc điều trị chung cho các bệnh nhân mắc

PTD tuýp 2 bên cạnh chế độ ăn uống hợp lí kết hợp với tập luyện thé dục thé thao

thường xuyên [9] là duy trì lượng đường trong máu lúc trước và sau khi ăn gần như

ở mức sinh lý bình thường [10].

Enzyme a-glucosidase là một enzyme quan trọng tham gia vào bước cuỗi cùng

trong quá trình tiêu hóa carbohydrate ơ-Glucosidase thủy phân polysaccharides vàoligosaccharides thành glucose; do đó dé kiểm soát lượng đường huyết sau khi ăn

cần phải ức chế enzyme a-glucosidase nhằm làm chậm quá trình thủy phan

carbohydrate giải phóng glucose, giảm hấp thu glucose trong máu [11] Hiện nay, một

số loại thuốc được sử dụng rộng rãi trong điều trị DTD tuýp 2 có tác dụng ức chế

enzyme ơ-glucosidase như acarbose, voglibose, miglitol [12], [13] Việc sử dụng các

loại thuốc này tuy có hiệu quả cao trong điều tri DTD nhưng vẫn luôn tiềm ân một số

tác dụng phụ có thê xảy ra như viêm gan, suy thận hay các bệnh liên quan đến hệ tiêuhóa [13], [14] Do đó, việc tìm kiểm các hợp chat ức chế enzyme a-glucosidase, các

loại thuốc thay thế có nguồn gốc từ thảo được, địa y nhằm thay thế các loại thuốc điều tri DTD thông thường đang rat được quan tâm và nghiên cứu [15].

Địa y được tạo thành từ mỗi quan hệ cộng sinh giữa nắm (mycobiont) - thường

là nam túi hoặc nam đảm - với một hoặc nhiều loại tảo (photobiont) - thường là tảo lam hoặc tảo lục đơn bào, dé tạo thành cơ thé thống nhất với các đặc tinh sinh lý và sinh thái riêng [16] Các hợp chất chuyên hóa thứ cấp của địa y chủ yếu được tạo ra

từ nắm cộng sinh (mycobiont) của chúng [17], [18] Trên thế giới có hơn 13,500 loại

nắm cộng sinh địa y [16] vậy nên tiềm năng khai thác các hợp chất chuyên hóa thứ cấp phụ vụ cho y học là rất lớn Nắm cộng sinh địa y với các hợp chất chuyển hóa thứ cap của chúng được xem là một nguồn thay thé có tiềm năng trong điều trị DTD tuýp 2 [19] Trong các điều kiện môi trường nuôi cấy khác nhau các nam cộng sinh

có thé tạo ra những hợp chất chuyển hóa thứ cấp khác nhau [20] Mycobiont với đa

dạng thành phần loài, tạo nên sự đa đạng các sản phâm chuyên hóa thứ cấp có thê

ứng dụng trong y học, nhưng hiện vẫn còn hạn chế về các nghiên cứu đặc biệt là cácnghiên cứu về hoạt tính sinh học của nam chỉ Migrovofheliưm:; bên cạnh đó kha năng

mycobiont tạo được sản phẩm thứ cấp nhiều hay ít, hoạt tính mạnh hay yếu còn phụ

thuộc lớn vào điều kiện môi trường nuôi cay chúng Vi vậy, cần thiết phải cỏ các

nghiên cứu nhằm khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hoạt tính sinh học

của mycobiont chỉ Nigrovothelium.

Nhận thấy được tinh cấp thiết, dé tài “Khao sát ảnh hướng của điều kiện nuôicấy đến hoạt tính ức chế enzyme ơ-glucosidase của Nam cộng sinh địa y

Nigrovothelium inspersotropicum được thực hiện.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát ảnh hưởng của điều kiên nuôi cây đến hoạt tính ức chế enzyme

a-glucosidase của nắm cộng sinh dia y N inspersotropicum

3 Đối tượng nghiên cứu

Nắm cộng sinh địa y N inspersotropicum đã được phan lập từ trước và đượclưu trữ tại phỏng Sinh hóa — Vi sinh với mã số UE — MY06, Loài nam này được phânlập từ mẫu địa y được thu từ Thị xã Kiến Tường Tinh Long An (10.766858,

105.940441) vào tháng 5 năm 2022 Mẫu nắm cộng sinh này thuộc bộ sưu tập nắm

cộng sinh địa y của TS Tran Thị Minh Định tại Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư

Phạm Thành phố Hồ Chí Minh.

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

~ Nuôi cay nam N inspersotropicum

~ Tao cao ethyl acetate từ sinh khối nắm

— Khảo sát hoạt tinh ức chế enzyme a-glucosidase của cao ethyl acetate

5 Phạm vi nghiên cứu

Dé tai tien hành khảo sát hoạt tính ức chế enzyme a-glucosidase nắm cộng sinh

địa y N inspersotropicum nuôi cay trên môi trường MYA cơ bản trong điều kiện

sáng/tối và môi trường MYA đã thay đỗi thành phần đường (sorbitol, mannitol và

D-glucose).

6 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được tiền hành từ tháng 10/2023 - 3/2024 tai Phong thí nghiệm Vi sinh —Sinh hoá, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hỗ Chi Minh

Chương 1 TONG QUAN

1.1 Tổng quan về bệnh đái thao đường

Bệnh ĐTĐ là một căn bệnh mạn tính, xảy ra khi tụy không sản xuất đủ insulin hay cơ thé sử dụng không hiệu qua insulin do tụy sản xuất làm cho nông độ glucose

trong mau (glucose huyết) tăng cao [1] Lượng đường huyết tăng cao kéo dai sẽ gây

nên những roi loạn chuyên hóa carbohydrate, protein, lipid, gây ton thương ở nhiều

cơ quan khác nhau, đặc biệt ở tim, mach máu, thận, mắt và thần kinh [5] Bệnh DTD

là một trong những nguyên nhân gây tử vong hang đầu trên toàn thé giới, do vậy bệnh

nhân cần được chan đoán, phát hiện và điều trị theo đúng nguyên tắc dé đảm bảo sức

khoẻ và chất lượng cuộc song [21].

PTD được phân thành ba loại phô biến là DTD tuýp 1, DTD tuýp 2 và DTD thai ki [6]; trong đó, DTD tuýp 2 được xem như một cuộc khủng hoảng đối với sức khỏe toàn cầu do có tỉ lệ người mắc cao nhất và ngày càng có nhiều thanh thiêu niên

mắc phải [3] DTD tuýp 1, được gây ra bởi sự phá hủy tế bao đảo tuy, thường dẫn

đến thiểu insulin tuyệt đỗi DTD tuýp 2 do giảm chức năng của tế bảo j tụy tiền triển

trên nén tang dé khang insulin, DTD thai kỳ được chan đoán vào giai đoạn thứ haihoặc thứ ba của thai kỳ ma trước thời kỳ mang thai không có dấu hiệu rõ rang củabệnh DTD [22].

Theo Tô chức Y tế Thế giới (WHO), DTD tuýp 2 có ti lệ người mắc cao nhấtchiếm 90% đến 95% tổng số người mắc bệnh PTD trên toàn thế giới Độ tudi mắc

DTD tuýp 2 phô biến nhất là những người trên 45 tuôi, nhưng hiện nay độ tudi mắc căng bệnh này ngảy càng trẻ hóa, nguyên nhân có thé đo yêu tố di truyền, béo phì,

chế độ ăn uống không hợp lí hoặc ít vận động thể chất [7] Nhiều nghiên cứu chỉ ra

rằng, cơ chế của sự kháng insulin bao gồm các thụ thê insulin bị rối loạn chức năng,các con đường truyền tín hiệu của thụ thể không ôn định và những bắt thường trongvận chuyền glucose hoặc chuyên hóa glucose Phần lớn các bệnh nhân DTD tuýp 2

bị thừa cân hoặc béo phi [23] Ở người bệnh DTD tuýp 2, khi glucose huyết tăng, tụy

sẽ tăng sản xuất tiết insulin để kiểm soát nồng độ glucose huyết Nhưng sau đó, nếu tinh trạng dư thửa chất đinh dưỡng vẫn tiếp diễn glucose huyết vẫn tiếp tục tăng cao

cùng với sự tăng cao của các acid béo tự do, sẽ tác động tiêu cực đến chức năng tếbao B tuyến tụy Hậu qua làm tế bào j3 giảm tiết insulin [24] [25].

Người mắc bệnh DTD, nếu không được chăm sóc va điều trị đúng cách sẽ gặp

phải các bệnh và bien chứng nguy hiểm, lâu dài có thé dan đến tử vong Đối với các

biến chứng mạn tính, người bệnh cần được kiém tra sức khoẻ thường xuyên Bệnh lý

võng mạc do DTD cũng cần được khám mit toàn diện và đo thị lực định kỳ hang năm, dé có thé kiếm soát được tiền triển bệnh va giảm nguy cơ mù loa vẻ sau Nhìn chung, các biến chứng do bệnh DTD dé lại sẽ ảnh hưởng đến sức khoẻ và chat lượng

cuộc sông của người bệnh, nêu không được điều trị tích cực sẽ gây ra hậu quả nặng

né [26], [27].

1.2 Tổng quan về enzyme a — glucosidase

Enzyme a-glucosidase (EC 3.2.1.20) la enzyme ngoại bào (exoenzyme), bao

gồm một nhóm các enzyme như maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase,

maltase-glucoamylase, a-glucopyranosidase, ơ-D-glucosidase, a-glucoside hydrolase,

a-1,4-glucosidase, a-diglucoside, glucohydrolase [28], [29] xúc tác cho qua trình thủy phan

liên kết a-1,4-glycoside giải phóng a-glucose khỏi đầu không khử của co chat [30]

Cơ chat đặc trưng của enzyme a — glucosidase này là oligosaccharide, disaccharide,

các aryl- và akyl-a-glucopyranoside [31] Enzyme ơ-plucosidase là một trong những

enzyme thuộc lớp glycoside hydrolase (GH) - một lớp các enzyme thường tách các

liên kết glycoside giữa hai phân tử carbohydrate [32]

Enzyme a-glucosidase được chia thành hai nhóm GH-13 và GH-31; enzyme

thuộc nhóm 13 được phat hiện nhiều ở vi khuẩn; còn enzyme thuộc nhóm

GH-31 thường gặp ở những sinh vật bậc cao [30] Enzyme a-glucosidase có nguồn gốc

rất phong phú từ nhiều loải sinh vật (vi khuẩn, nam mốc, động vật và thực vật) nêntính đặc hiệu cơ chat của họ enzyme cũng đa dang hơn Các enzyme a-glucosidase

được phân chia thành ba loại chính dựa trên tính đa dạng đặc hiệu của cơ chat Loai

một là các enzyme a-glucosidase ưu tiên thủy phan các liên kết glycoside chang han

như p-nitrophenyl a-D-glucopyranoside (pNPG) Enzyme loại II va HI thi ngược lại,

hoạt động mạnh hơn trên các holoside và có hoạt tính thấp đôi với các glycoside [33].

Carbohydrate là một trong ba chất đinh dưỡng đa lượng quan trong va can thiếttrong chế độ ăn của mỗi người bên cạnh protein và lipid [34] Thực phẩm giàu tỉnhbột lả nguồn cung cấp carbohydrate chủ yếu cho co thé Ở người, enzyme a-

glucosidase được tim thay trên tế bào ruột ở hỗng tràng của ruột non, khi carbohydrate

từ thức ăn được đưa vảo cơ thê ruột non sẽ tiết ra enzyme a-glucosidase dé thủy phâncarbohydrate thành những phân tử glucose nhỏ hơn rồi thâm thấu vào máu [35] Do

vay, bằng việc ức chế hoạt động của enzyme a-glucosidase có thé làm giảm quá trình

thủy phân carbohydrate va làm chậm sự thầm thấu glucose vào máu từ đó ngăn chặn

tình trạng tăng đường huyết sau bừa ăn [19] Đây là một trong những phương phápđiều trị DTD tuýp 2 hiệu quả nhất

Thuốc ức chế enzyme a-glucosidase (a-glucosidase inhibitors - AGIs) là thuốc

ức chế sự hấp thu carbohydrate từ ruột non, từ đó tác dụng lam giảm lượng đường

huyết sau bữa ăn nên có thê được sử dụng trong điều trị bệnh nhân mắc ĐTĐ loại 2[36] Hầu hết các AGIs có thé gắn vảo vị trí liên kết carbohydrate của a-glucosidase

vi chúng có cau trúc giống với disaccharide hoặc oligosaccharide Phức hợp nay có

ai lực mạnh hon so với phức hợp carbohydrate-glucosidase, tạo ức chế cạnh tranh,dẫn đến hoạt động của a-glucosidase trong niêm mạc của ruột non bị ức chế [28] Khi

sử dụng thuốc ức chế enzyme a-glucosidase sẽ làm chậm quá trình tiêu hóa và hap

thu carbohydrate, việc tiêu hóa va hap thu chậm carbohydrate làm cho chỉ số đường

huyết thấp hơn — điều này được Luisa Bonsembante và các cộng sự chỉ ra trong một

nghiên cứu năm 2021 [37].

Acarbose làm chậm quá trình tiêu hóa carbohydrate bằng cách ức chế cạnh tranh

với enzyme ơ-glueosidase ở ruột non, dẫn đến làm giảm đường huyết sau ăn [12], rất

hiệu quả trong điều trị DTD nhưng vẫn luôn tiềm an một số tác dụng phụ có thê xảy

ra như viêm gan, suy thận hay các bệnh liên quan đến hệ tiêu hóa [13], [14] Do đó,

việc tìm kiếm các hợp chất ức chế enzyme œ-glucosidase, các loại thuốc thay thé có

nguồn gốc từ thảo dược, địa y nhằm thé các loại thuốc điều tri DTD thông thường đang rất được quan tâm và nghiên cứu [15].

1.3 Tổng quan về địa y và ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính sinhhọc của nam công sinh địa y

Địa y được tạo thành từ mỗi quan hệ cộng sinh giữa nắm (mycobiont) - thường

là nam túi hoặc nắm đảm - với một hoặc nhiều loại tảo (photobiont) - thường là vi

khuân lam hoặc tảo lục đơn bảo, dé tao thanh co thé thông nhất với các đặc tính sinh

lý và sinh thái riêng [16] Những sợi nam kết xung quanh các tế bào tảo nhằm đảm

bao cung cấp nước, CO2, mudi vô cơ dé tảo quang hợp và giúp tảo không bị khô

Song song đó, tảo cũng quang hợp cung cấp chất hữu cơ cho nắm và chính nó sử

dụng [38] Môi trường sóng của địa y rất đa dang, chúng có thé sống trên dat đá, vách

núi, thân cây cảnh cây, đồng cỏ các khu vực ven biên, rừng mưa nhiệt đới hay ôn đới, thậm chí cả những môi trường khắc nghiệt như Bắc Cực hay sa mạc [39] Tốc

độ tăng trưởng của địa y rất cham [40].

Tên của địa y được đặc theo tên của nắm cộng sinh tạo nên chúng, điều nàyđược quy định trong Bộ luật về Danh pháp thực vật quốc tế (ICBN) [41] Địa y được

phân loại thành 3 dạng cơ ban: dang kham, dạng sợi và địa y phiến Dạng kham

(crustose) bám chặt vào be mặt của giá thể Giá thé có thé là đá hoặc vách đá, thâncây khác Địa y phiến (foliose) thường có đạng như lá tản của chúng có thê phân ra

thành nhiều thùy Dạng sợi (fruticose) cấu trúc hình sợi, với nhiều sợi hợp lại tạo

thành hình dáng giống dạng cây bụi nhỏ [42]

Địa y sinh sản vô tính với hai hình thức sinh sản Đầu tiên là sinh sản sinh đưỡngbằng mam phan — các hạt nhỏ, tròn, màu xanh xám, gồm một đến hai tế bảo tảo vàmột ít sợi nấm Hình thức sinh san thứ hai là sinh sản sinh dưỡng bằng phân mảnh —địa y già chết, phân hủy thành một số mảnh nhỏ có thé phát triển thành địa y mới

Ngoài ra, tảo và nắm có các hình thức sinh sản riêng: tảo sinh sản theo kiều phân đôi

và bằng động bào tử; nam sinh sản bằng bào tử túi và hình thành thé quả (nam hình

thành quả thé chứa bảo tử túi bên trong) Bao tử nắm sẽ nảy mâm thành sợi nam va

khi gặp tảo thích hợp hình thành địa y mới [43].

Các hợp chất chuyên hóa thứ cấp của địa y chủ yếu đến từ mycobiont [17], [18], nhưng mycobiont lại có tốc độ sinh trưởng va phát trién chậm vì vậy dé thu được sinh

khối mong muốn can phải cải tiến điều kiện và môi trường nuôi cấy [44] Da số

mycobiont thuộc ngành nam túi (Ascomycota), một số khác thuộc ngành nam đảm(Basidiomycota) [45] Trên thế giới có hơn 13,500 loại nắm cộng sinh địa y [46] vậy

nên tiem năng khai thác các hợp chất chuyên hóa thứ cấp của chúng nhằm phục vụ

cho y học lả rất lớn

Đã có hơn 1,050 hợp chất chuyền hóa thứ cap từ địa y được xác định và hau hết

các hợp chat thứ cấp này đều đặc trưng cho nam cộng sinh (mycobiont) của địa y[47] Các hợp chất chuyên hóa thứ cấp từ địa y và mycobiont được xem như mộtnguồn dược liệu phong phú nhờ vào khả năng kháng khuẩn, kháng oxy hóa, chongviêm, giảm đau, chống nắng [48] [49] Ngoài ra, một số loài địa y đã được phát

hiện có khả năng ức chế sự phát triển của HIV gây bệnh AIDS [50] Công đụng của

địa y còn được biết đến như làm sinh vật chỉ thị ô nhiễm không khi nguôn thức ăn

chính vào mùa đông cho tuân lộc, sóc bay, chuột lưng đỏ và nhiều loại động vật không

xương sống Nhiều loài chim sử dụng địa y làm vật liệu làm tổ Một số loại địa y từ

lâu đã được người dân Bắc Au và Bắc Mỹ sử dụng lam thực pham; làm thuốc dé điều

trị một số bệnh như DTD, ho, chữa vét thương và các bệnh đa liễu [51], [52]

Năm 2021, Gregor Pichler và các cộng sự đã công bố bài báo trong đó đánh giá

ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của nam cộng sinh địa y A.

parietina Cụ thé, nằm X parietina được nuôi trong môi trường Lilly-Barnett (LBM)thay thế 1% D-glucose bằng 3% D-glucose và 3% D-mannitol, cho thấy sự tăng sinh

khối nam tươi lần lượt là 22% và 26% sau 8 tuần nuôi cay [53].

Nam 2013, Kim cùng các cộng sự đã công bo bài bao về “Anh hưởng của ánh

sáng đến quá trình sinh trưởng và tông hợp các hợp chất thứ cấp của nắm Fusarium

graminearum Nam F graminearum được nuôi trong điều kiện chiếu ánh sáng trắng liên tục và trong bóng tối hoàn toàn Kết quả thí nghiệm cho thấy rằng ánh sáng có

ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng vả sinh tông hợp các hợp chat thứ cấp ở nam

E graminearum [S4].

1.4 Tổng quan về nắm N inspersotropicum

Địa y chi Nigrovothelium là địa y dạng khảm (crustose) [55], gồm 3 loài N.

bullatum, N inspersotropicum và N tropicum [56] Chi địa y Nigrovothelium được

Liicking và các cộng sự đặt tên vào nam 2016.

Địa y N inspersotropicum là một trong 3 loài địa y chỉ Nigrovothelium được

Aptroot & Diederich phân loại vào năm 2017 Vigrovothelium inspersotropicum phan

bo chủ yêu ở Nam Mỹ, Nam A và Úc [57] Tan địa y dày dưới 0,1 mm, màu xanh lá cây ánh vàng đến hơi nâu vàng, bên trên có các quả thé (ascomata) có dạng hình câu,

mau đen, đường kính khoảng 0,45 — 0,6 mm [58].

Hình 1.1 Địa y Nigrovothelium inspersotropicum |59|

Phan loai sinh hoc

1.5 Tinh hình nghiên cứu trong va ngoài nước

Nắm cộng sinh địa y với các hợp chất chuyên hóa thứ cấp của chúng được xem

là một nguồn thay thé có tiềm năng trong điều trị DTD tuýp 2 [19] Một số hợp chat

chuyền hóa thứ cấp được chiết xuất từ nam cộng sinh địa y có hoạt tinh ức chế enzyme

a-glucosidase như methylorsellinate, 2.4-dihydroxy-6-methylbenzoate,

methyl-/Ø-orinolcarboxylate, 2,4-dihydroxy-3, 6-dimethylbenzoate, zeorin, sekikaic acid,

salazinic acid và usnic acid, flavonoid [60], [35].

Năm 2014, Karunaratne và các cộng sự đã công bố nghiên cứu về một số hợpchất được tách chiết từ địa y Cladonia sp lan lượt là zeorin, methyl đ-

orcinolcarboxylate và methylorsellinate với hoạt tinh ức chế enzyme a-glucosidase cao hơn nhiều lần so với acarbose; trong đó hợp chat zeorin thẻ hiện kha nang ức chế enzyme mạnh với gia trị [Cs là 100,0 + 0,3 ng/mL so với acarbose có giá trị ICso là

700,0 + 10,4 pg/mL Từ nghiên cứ trên, nhóm tác giả khang định các hợp chat này

dự kiến trong tương lai sẽ là nguồn nguyên liệu có tiềm năng ứng dụng trong điều trị

bệnh DTD tuýp 2 [61].

Năm 2016, Huỳnh Thư cùng các cộng sự đã đánh giá khả năng ức chế enzymea-glucosidase từ cao chiết của 11 loài địa y tai vườn Quốc gia Bidoup - Núi Bà tinh

Lam Đồng Kết quả nghiên cứu cho thay 4 loài Usnea pectinata, U flammea, U.

fulvoreagens, U baileyi (gia trị ICso lần lượt là 75,23 pg/mL, 104.84 pg/mL, 140,66

ug/mL và 150,21 ug/mL) đều có khả nang ức chế enzyme a-glucosidase mạnh hơn

nhiều so với acarbose 0,2 U/mL (giá trị ICsa là 3597,12 g/mL) Từ kết qua nghiên

cứu, nhóm tác giả đưa ra kết luận chiết xuất methanol của 4 loại địa y trên sẽ là sự

thay thé tuyệt vời cho thuốc ức chế a-glucosidase thông thường [62]

Năm 2021, Muzaffer Mukemre và cộng sự đã công bó bài báo “Hoạt tinh sinh

học và thành phần hóa học của địa y chi Xanthoria từ Thổ Nhĩ Kỳ" Trong nghiên

cứu, nhóm tác giả tập trung vảo ba đối tượng địa y là X candelaria, X elegans và X

parietina Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế enzyme a-glucosidase cho thấy X: parietina thé hiện khả năng ức chế enzyme cao, có tiềm năng trở thành một nguồn cung cấp hợp chat thứ cap mới ứng dụng trong điêu trị DTD tuýp 2 [52].

Năm 2022, Maulidiyah và các cộng sự đã công bố nghiên cứu của minh về hợpchat usnic acid (C¡sH¡«O›) phân lập từ địa y Usnea sp., sau khi thử hoạt tính ức chếenzyme a-glucosidase cho thay acid usnic có hoạt tích ức chế enzyme a-glucosidase

với giá trị ICso là 106,78 ug/mL Nghiên cứu cũng kết luận usnic acid phan lập từ

Usnea sp có tiềm năng lớn trở thành nguồn hợp chất thiên nhiên ứng dụng làm thuốc

tri DTD tuýp 2 trong tương lai [63].

Năm 2023, Alfredo Torres-Benitez cùng các cộng sự đã thực hiện nghiên cứu

khả năng ức chế enzyme a-glucosidase của ba loại địa y phân bố ở vùng ôn đới vavùng cực lần lượt là Placopsis contortuplicata, Ochrolechia frigida và Umbilicariaantarctica Kết qua của nghiên cứu cho thấy loài O frigida có hoạt tính tốt nhất (giá

trị ICsø là 16 + 0,015 ug/mL) so với giá tri ICs» của acarbose (206,614 + 0,008 pg/mL).

Hai loài còn lạt có hoạt tính thấp hơn, với giá trị ICso lần lượt là 139,56 + 0,056 và

151,94 + 0,022 ngmL [64].

Chương 2 VẶT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Vật liệu nghiên cứu

Nắm cộng sinh địa y X inspersotropicum đã được phân lập từ trước và được

lưu trữ tại phòng Sinh hóa — Vi sinh với mã số UE — MY06 Loài nam này được phânlập từ mẫu địa y được thu từ Thị xã Kiến Tường Tinh Long An (10.766858,

105.940441) vào tháng 5 năm 2022 Mau nắm cộng sinh này thuộc bộ sưu tập nắm cộng sinh địa y của TS Tran Thị Minh Định tại Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư Pham Thành phố Hồ Chí Minh.

2.2 Thiết bị và hóa chất

2.2.1 Thiết bị

Các thiết bị sử dung trong đề tài được trình bay trong Bang 2.1

Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng trong đề tài

Nồi hấp vô trùng ALP (Nhật)

4= mm

Micropipete 1000 ul

Micropipete 200 ul Scilogex (Mỹ)

se

Can phan tích điện tử Sartorius (Đức)

Máy đọc đĩa BMG Labtech Clariostar (Đức)

2.2.2 Héa chat

Các hoa chat sử dụng trong đề tai gồm các hoá chat tạo môi trường nuôi nam

(Bảng 2.2), các hoá chất sử dụng trong tạo cao chiết và thử hoạt tính ức chế enzyme œ~glucosidase (Bang 2.3).

Yeast extract: 4g | Yeast extract: 4g | Yeast extract:4g | Yeast extract: 4 g

Sucrose: 100 ø D-glucose: 100 g Sorbitol: 100 g Mannitol: 100 g

Agar: 20 g Agar: 20 g Agar: 20 g Agar: 20 g

Nước cất: 11 Nước cất: | | Nước cất: I | Nước cất: 1 ]

Bảng 2.3 Các hóa chất được sử dụng tạo cao chiết và thử hoạt tính ức chế

enzyme ơ-glucosidase

Ethyl acetate 99,53% AR, Trung Quốc

a-Glucosidase Sigma Aldrich, M¥

p-nitrophenyl-D-glucopyranoside Sigma Aldrich, M¥

¬ Dimethyl sulfoxide Prolabo VWR , Phap

2.3.1 Phương pháp tạo môi trường và nuôi nắm

Đề tải chỉ sử dụng 1 loại môi trường nuôi nắm là môi trường MYA được pha

theo công thức với 1000 mL nước cat sẽ dùng 10 g malt extract, 4 g yeast extract, 100

g sucrose va 20 g agar Đối với môi trường MYA thay đôi nguồn carbon, 100 g sucrose

sẽ được thay lan lượt bằng 100 g D-glucose hoặc 100 g sorbitol hoặc 100 g mannitol

Môi trường được pha và cho vào các bình tam giác hoặc bình schott, hap trong nỗi

hap tiệt trùng ở 121°C trong 20 phút Môi trường sau khi hap tiệt trùng sẽ được dénguyên trong bình tam giác đến khi đông lại và nguội han là có thé sử đụng dé nuôicay nam

Sau khi đã chuẩn bị môi trường, nam từ dia giống ban đầu được cắt nhỏ vàchuyên qua môi trường mới; nam được nuôi trong thời gian 6; 8; 10 và 12 tuần với

nhiệt độ 22°C Nam được nuôi va khảo sat hoạt tính ở các nghiệm thire:(1) nuôi trên MYA hoàn toàn trong bóng tối, (2) nuôi trên môi trường MYA chiều sáng trung bình

12 tiéng/ngay, (3) nuôi trên môi trường MYA thay đôi nguồn carbon từ sucrose thành

D-glucose, (4) nuôi trên môi trường MYA thay đổi nguồn carbon từ sucrose thành

sorbitol, (5) nuôi trên môi trường MYA thay đổi nguồn carbon từ sucrose thành mannitol.

2.3.2 Phương pháp tao cao ethy! acetate

Nam sau khi được nuôi trong khoảng thời gian 6; 8; 10; 12 tuần sẽ thu sinh khối

tươi Sau đó sinh khói nam được sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ từ 60°C đến khi khô

hoàn toàn Sinh khối nam khô được xay nhuyễn và ngâm trong dung môi ethyl acetate với tỉ lệ 1:2 Nam được ngâm và lọc lay dung môi liên tục mỗi ngày cho đến khi dung

môi trong suốt Cao nam được thu lại bằng cách cô quay, sau đó đề bay hơi dung môi

tự nhiên,

2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzyme a - glucosidase

Đề khảo sát hoạt tinh ức chế enzyme a — glucosidase 20 mẫu cao nam được

pha loãng ở nồng độ 200 „g/mL với DMSO và đệm phosphate

Bang 2.4 Thể tích cao chiết nam pha loãng ở nồng độ 200 pg/mL

Sor 8 tuần

thực hiện dựa trên quy trình của nhóm nghiên cứu Dương Thúc Huy cùng các cộng

sự [65] Dau tiên, chuẩn bị pha enzyme ơ — glucosidase và cơ chất pNPG Enzyme

a-glucosidase (0,2 U/mL) và cơ chất (5 mM p-nitrophenyl-c-D-glucopyranoside) được

hòa tan trong dung dich đệm sodium phosphate 100 mM có pH là 6,9 và được bảo