Khóa luận tốt nghiệp Sư phạm sinh học: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính ức chế α -Glucosidase của nấm cộng sinh địa y Graphis sp

Các loại carbohydrate như tỉnh bột không thé được hap thu qua đường tiêuhoá ở dạng nguyên bản, do đó chúng bị phân giải thành glucose và hấp thụ nhờ hoạt động của các enzyme trong nước b

BỘ GIÁO DUC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

TRAN THỊ HOA QUYÊN

KHAO SAT ANH HUONG CUA CÁC DIEU KIEN NUÔI CÁY

DEN HOAT TINH ỨC CHẾ a-GLUCOSIDASE

CUA NAM CONG SINH DJA Y Graphis sp

THÀNH PHO HO CHÍ MINH - 2024

BỘ GIÁO DUC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

TRAN THỊ HOA QUYÊN

KHAO SAT ANH HUONG CUA CÁC DIEU KIỆN NUÔI CÁY

DEN HOAT TÍNH ỨC CHE a -GLUCOSIDASE

CUA NAM CONG SINH DJA Y Graphis sp

NGUOI HUONG DAN KHOA HOC

TS Tran Thi Minh Dinh

THÀNH PHO HO CHÍ MINH - 2024

LỜI CÁM ƠN

Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn cô giáo — TS Tran Thị Minh Định,

cô đã tâm huyết, tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu

và thực hiện dé tài Cô đã có những trao đổi và góp ý dé em có thé hoàn thành tốt

đề tài nghiên cứu nảy.

Dé hoàn thành khóa luận này, em xin gửi lời cảm ơn đến các Quy Thay côKhoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã tao cơ hộicho em được học tap, rèn luyện và tích lũy kiến thức, kỹ năng đề thực hiện khóa

luận.

Em xin cảm ơn các thầy cô Trung tâm Khoa học và Công nghệ sinh học

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên và Khoa Hóa học Trường Đại Học Sư phạm

Thành Phố Hồ Chi Minh đã hỗ trợ chúng em trong quá trình thực hiện đề tai

Xin cảm ơn các bạn của phòng nghiên cứu Vi sinh, dù rất bận rộn với học

tập và công việc đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ em.

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên và tạo điều

kiện tốt nhất dé em có thẻ nỗ lực hoàn thành tốt bài nghiên cứu.

TP Hồ Chí Minh, ngày 02 tháng 05 nam 2024

SINH VIÊN

Trần Thị Hoa Quyên

MUC LUC

BVCOT GAIA cc cccccsescessccacoessseesscrecovsssesssrecccvessssssceosensssossereccossreerereccosssresrsreocosereeec 1

MIUCIUU as ssisscsssssissssssasisscssassicaiscarssssseasisassssassesseneissousaasieasssarssassssaissoaseasseasiseiseens 2 DANHMUECCÁCCHỮ VIET TAT sscssssssssccssssscssssassscsssasssscsscassesescosscsessnsssezssees 4 DANH MỤC CÁC HIND ssscssssssssssasasssasssnssssassossasarasaiasarssansvasesscnsssssesunssissanssaaisa 5BANHMIHGGAGBANBIaseeiaiaoieiiiisieeeiioiiiioiidtizibidioiiibstidiai 6

MA ee 1

I.JElifö:6hgiiifồiflÍosnsaasnssinniiinbintiittiiittiiisittitlitiiaitiilitilittstEigigitnitiaine |

2 Me:fiÔI nghiÊnGỨN::::::::::::::::ccz:cscszc::2231222520755315255553152861595655355638583553835253553535555 2 3.iPhạm:vi.nghiÊn CỨU:¡::i:ci:ccscci5i52651261166135635565356 86555658 556 53665386 55315 956886 856636 8535688 2

A INOHIHNĐ TỊEHIDDIOWR::;:5:222:552:252255215535522353553355512511233853313535334833513553352393515552032835835 2

5 Dối tượng nghiên cỨu s2 s2 592122E112255122311731721172111211121172112 112 e 2

6 Thời gian và địa điểm nghiên cứu cccsocscoosesoseAoeeoieesesoaadei 2

1.3.2 Địa y thuộc chỉ Œ7@/ÐÌ1iS càng nh HH nh tin §

1.3.3 Hoạt tinh ức chế enzyme a-glucosidase của địa y 91.4 Thuốc ức chế enzyme o-glucosidase trong điều trị đái tháo đường 121.5 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nắm cộng sinh địa y 13

1.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài "ưỚC - -< «<< <<s=<xeeeeeeeesee 14

CHUONG 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

DUA) TH ID) VI NGRIE]BEuosntittsist2400000013008221410106019211113001180431420100109221400001335830102 17

DDN THÍ HD sassccesssrcaresscusssesssranvesscosavesasssseyesssusseessnroaverasorasnsaescearansonescresaies 17

5/12 Hồn €Bẫsnaaennininnnniinntdiniiuiitttdttiitttitttitttiiitiittsnittöftigtftlsnitaggbi 182.2 Môi trường nuôi MAM oo eecceeccseecssessseecssecssecesvessneessseesseessueesaseesseesssesssee 18

Z:3:IFHƯOHIDH0DTPDICHICUUH:¡:2:i2104001/1211052216421431120123611134315231531123126611331365131513:2 20

2.3.1 Phương pháp nuôi nam cộng sinh địa y -¿-©cse©ccseccsee 20

2.3.2 Phương pháp tao cao thô ethyl aC€†A€ - - -ccssserrreesrreerre 20

2.3.3 Phương pháp khảo sát hoạt tinh ức chế enzyme ơ-glucosidase 21

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu - ¿+72 2z ©s+2sz£zz+xecxerxrsrcxrrsrrscrree 21

2.4 Quy trình thực hiện - - HH HH Ho ke 21

Chương 3 KET QUA VA THẢO LUẬN 22-©222zcccceeccrxeccrzscree 23

3.1 Kết quá nuôi nắm :-::- c2 SE x2E112111111111E111111e11121xirsrree 23SRB CB HÍGA(ÍBB(ERÕItsiiosscco2562220222062312023622155022536231302353233082339248922312285050188239888353384 24

3.3 Anh hưởng của nguồn carbon đến hoạt tinh ức chế a-glucosidase 25

3.4 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính ức chế œ-glucosidase - 273.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính ức chế đ-#lucosidase 28KẾT LIÊN VÀ KIÊN NGHĨ::snnsansnsenininnnniinnnitinioiaihionissnasnn 33

ñ" 33sẽ 33ITHHIE 0) TRAN DÌI.¿. 25556555:50250152055:053200220222156205220022144600)220222332302282223340865 34

0/000 in 4I

DANH MỤC CÁC CHỮ VIET TAT

p-NPG p-nitrophenyl-D-glucopyranoside

IDF International Diabetes Federation

PDN Painful diabetic neuropathy

DMSO Dimethyl sulfoxide

ABTS Sulfonic acid

NIDDM Bệnh nhân tiêu đường không phy thuộc insulin

:

MIC Nông độ ức chế tôi thiêu

DANH MỤC CÁC HÌNH

FRM US | Vicianoiiniiiiiiiiitiii141114111ã11143113ã1139153ã13858833515838838558538858538138ã5883638ã538ã553383 6 Hình II.2 lay fGliose: [i[L‹:-:::::::-::-::: ::ccccscrccerrerorasrcreriersrrosgrasrrtssrasrsasaazasasaasssss §

FH D6 P 0JT: 00 ïv Han to lý) TH TH T1 T1 0101001011101 00000 Ô0Ô0Ô0Ô 1 §

Hình 1.4 Dia y crustose [§] - - -Ă 5< Ăn HH ng 8

Hình 2.1 Kết quả nuôi nam Graphis sp Ở các thời điểm -55- 20

Hình 2.2 Quy trình thực hiện GE n ` xa 22Hình 3.2 Đồ thị thê hiện sự tương quan giữa tỷ lệ ức chế enzyme ơ-glucosidasevới logarit của nồng độ cao chiết từ sinh khôi nắm được nuôi ở môi trường 24°C

Bang 3.2 Kết qua do ODyos của thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nguồn

carbon đến hoạt tính ức ché a-glucosidase -sccs<xeeeeeeeeereseresee 26

Bang 3.3 Tỷ lệ % tre chế enzyme a-glucosidase cúa các mẫu cao chiết ethyl

acetate từ sinh khôi nầm được nuôi trên môi trường có nguôn carbon khác

Bảng 3.4 Kết quả do ODaas của thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạttinh tre ChE 11s TA 28

Bảng 3.5 Tỷ lệ % tre chế enzyme a-glucosidase của các mẫu cao chiết cthyl

acetate từ sinh khối nam được nuôi trên môi trường có độ pH khác nhau 29

Bảng 3.6 Kết qua đo ODaas của thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nguồn

carbon đến hoạt tinh ức chế œ-glucosidase -2 s¿ssecseccxsecvsee 30 Bảng 3.7 Tỷ lệ % ức chế enzyme a-glucosidase của các mẫu cao chiết ethyl

acetate từ sinh khối nam được nuôi trên môi trường có nhiệt độ khác nhau 3]

MO DAU

1 Lí do chọn đề tài

Dai thao đường la bệnh réi loan chuyén hoá đặc trưng với biểu hiện lượngđường ở trong máu luôn ở mức cao hơn so với bình thường do cơ thẻ thiếu hụt vềtiết insulin hoặc dé kháng với insulin hoặc cả hai, dan đến rối loạn quan trọng vềchuyên hoá đường, dam, mỡ, chất khoáng [1]

Khi mắc bệnh đái tháo đường, bệnh nhân tăng lượng đường tích tụ trong máu.

Nếu lượng đường trong máu luôn ở mức cao sẽ làm gia tăng các nguy cơ bệnh lí

tim mạch, đồng thời gây tôn thương ở nhiều cơ quan bộ phận khác như thần kinh,mắt, thận va nhiều bệnh lí nghiêm trọng khác [1]

Các loại carbohydrate như tỉnh bột không thé được hap thu qua đường tiêuhoá ở dạng nguyên bản, do đó chúng bị phân giải thành glucose và hấp thụ nhờ

hoạt động của các enzyme trong nước bọt và đường tiêu hoá, a-Glucosidase là một

trong những enzyme quan trọng trong quá trình phân giải này Những enzyme

e-glucosidase bao gồm: sucrase, maltase, isomaltase và gluocoamylase Chúng có

vai trò chính là thủy phân carbohydrate dé chuyển thành dạng đường đơn glucose

dé đảng hấp thu vao máu qua niêm mạc ruột [1] Từ cơ chế sinh lí này, thuốc ứcchế a-glucosidase có tác dụng ức chế chức năng của enzyme, làm chậm sự phângiải thức ăn thành glucose và ức chế sự gia tăng lượng đường trong máu sau bữa

ăn [2] Kiểm soát hàm lượng glucose trong máu là một mục tiêu quan trọng dé điềutrị của bệnh đái tháo đường Do đó, một trong những cách kiểm soát bệnh đái tháo đường là làm giảm lượng đường trong máu bang ức chế enzyme a-glucosidase [3].

Địa y là dang cộng sinh giữa tao và nam, có thể sông ở nhiều nơi trên dat, đá,thân cây vả trong nhiều điều kiện môi trường khắc nghiệt, khô hạn hay giá lạnh,

từ vùng thấp đến núi cao, cho thấy chúng có tính chống chịu tốt Các công trình khảo sát thành phần hoá học của địa y trên thế giới cho thấy nó chứa một lượng lớn chất biến dưỡng sơ cấp (protein, amino acid, polyol, carotenoid,polysaccharide, vitamin) và thứ cấp (depside, depsidone, dibenzofuran, steroid,terpene, ) Trong đó, một số chất đặc thù chỉ có ở địa y Nghiên cứu về hoạt tínhsinh học của các chất từ địa y cũng cho thấy khả năng kháng khuẩn, ức chế enzyme

-glucosidase, kháng virus, kháng nam, kháng oxy hóa, kháng ung thư [4] Các công trình nghiên cứu cũng đã tìm ra được nam cộng sinh địa y Graphis sp cóhoạt tính ức chế a-glucosidase.

Một số nghiên cứu cho thấy điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH mồi trường,nguồn dinh đường carbon ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tinh sinh học của nam cộng sinh địa y Nghiên cứu này nhằm mục đích tiền hành khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính ức chế a-glucosidase của nam cộng sinh địa

y Graphis sp.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính ức chế glucosidase của nắm cộng sinh địa y Graphis sp.

a-3 Phạm vi nghiên cứu

Đề tài chỉ tiễn hành khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nguồn carbon, pH

và nhiệt độ đến hoạt tính ức chế a-glucosidase của nam cộng sinh địa y Graphis

sp.

4 Nội dung nghiên cứu

- Nuôi cay nam cong sinh dia y Graphis sp

- Tao cao ethyl acetate từ sinh khối nam

- Khảo sát hoạt tinh ức chế enzyme a-glucosidase của cao ethyl acetate

5 Doi tượng nghiên cứu

Loài nam này đã được phân lập và lưu trữ ở phòng thí nghiệm Sinh hoá — Vi

sinh với mã số UE-MY08 Loài nam này được phân lập từ mẫu dia y thu ở tinh Trả

Vinh vào tháng 3 năm 2023 Mẫu dia y được định danh bởi Tiến sĩ Võ Thị Phi

Giao, Khoa Sinh học — Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhién,

Đại học Quốc gia Thành phố Hỗ Chí Minh và được lưu giữ tại Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chi Minh với mã số UE-L014.

6 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Dé tài được tiền hành từ tháng 10/2023 - 3/2024 tại Phòng thí nghiệm Vì sinh

— Sinh hoá, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thanh phó H6 Chí Minh

CHƯƠNG 1 TONG QUAN

1.1 Tong quan vé enzyme ơ-glucosidase

Trong cơ thé sống (các tế bảo) luôn luôn xảy ra quá trình trao đôi chat

Sự trao đôi chất ngừng thì sự sống không còn tồn tại Quá trình trao đổi củamột chất là tập hợp của rất nhiều các phản ứng hóa học phức tạp Các phản ứng này có liên quan chặt chẽ với nhau và điều chính lẫn nhau Enzyme là hợp chất protein xúc tác cho các phản ứng hóa học đó Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho các phản ứng xảy

ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thé sống.Enzyme có trong hau hết các loại tế bảo của cơ thé sóng Chính do những tácnhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chất xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học

[21].

Enzyme œ-glucosidase còn có những lên gọi khác như maltase,

transglucosidase, glucoinvertase, nitrophenyl a-D-glucosidase, thuộc nhóm

hydrolase (nhóm enzyme xúc tác các phan ứng thúy phân) [21].

Enzyme a-glucosidase là một enzyme một thành phần, có hoạt tínhexohydrolysis, xúc tác phản ứng thủy phân liên kết a-1,4-glycoside ở đầu tậncling không khử của carbohydrate giải phóng các phân tử œ-D-glucose Chatnên đặc trưng của enzyme a-glucosidase là các disaccharide, oligosaccharide,

các aryl- và akyl-a-glucopyranoside khác [42], [43] Enzyme a-glucosidase là

một trong những enzyme thuộc lớp glycoside hydrolase Glycoside hydrolase

là một lớp các enzyme thường tách liên kết glycoside giữa 2 phân tử carbohydrate, một trong những liên kết mạnh nhất được tìm thấy ở các polymer tự nhiên Các enzyme này có kha năng bẻ gãy các liên kết glycosidenhanh hon 10!” lần so với phan ứng không có enzyme xúc tác [22]

Khi thức ăn được hấp thu vào cơ thé thi các carbohydrate trong thức ăn

được thủy phân thành những phân tử đường nhỏ hơn bởi những enzyme ở ruột

non Tiến trình phân hóa này đỏi hỏi tụy tạng phải tiết ra enzyme a-amylase

dùng dé phá vỡ các phân tử carbohydrat lớn thành olisaccharid Enzyme glucosidase ở màng ruột non lại tiếp tục phân hóa các olisaccharid thành cácphân tứ đường nhỏ hơn nữa rồi mới thầm thấu vào máu [21], [23].

a-Tinh bột bị thủy phân dưới xúc tác của enzyme a-amylase tạo thành các phan

tử đường maltose Sau đó các phân tử đường maltose tiếp tục bị thủy phân

bởi enzyme a-glucosidase tạo thành các phân tử đường glucose làm tăng ham

lượng đường glucose trong máu Dưới tác động cao chiết sẽ làm ức chế sự

thủy phân tinh bột thành đường malotse, đường maltose không bị thủy phan

thành các phan tử đường glucose [21].

1.2 Tong quan về bệnh đái tháo đường

Bệnh đái tháo đường là bệnh rối loạn chuyên hóa không đồng nhất, có đặcđiểm tăng glucose huyết do hạn chế khả năng tiết insulin, giảm tác động của

của insulin, hoặc ca hai Tang glucose mạn tính trong thời gian dai gay nên những rối loạn chuyên hóa carbohydrate, protide, lipide, gây tôn thương ởnhiều cơ quan khác nhau, đặc biệt ở tim và mach mau, thận mắt, thần kinh[19], [20].

Trong những năm 1999, 2003 và 2006, Ủy ban chuyên gia của Hội Đái tháo đường Mỹ, Hội Đái tháo đường Châu Âu phân loại như sau:

PTD type |: tế bảo j sinh kháng thê bị phá hủy va gây thiểu hụt insulin tuyệtđôi, được chia làm hai thê là do cơ chế tự miễn va không tự miễn, không phụthuộc kháng thé kháng bạch cầu ở người (Human Leucocyst Antigen: HLA)

[20].

PTD type 2: đặc trưng bởi kháng insulin, giảm tiết insulin, tăng sản xuấtglucose từ gan và bất thường chuyên hóa mỡ Béo phì đặc biệt mỡ nội tạnghoặc béo phì trung tâm là phô biến nhất trong DTD type 2 [19], [20].

Các loại đái tháo đường khác có thé do thiểu hụt chức năng tế bao B đi truyền,thiếu hụt hoạt động insulin do di truyền các bệnh tuyến tụy ngoại tiết, các

bệnh nội tiết như hội chứng đa nội tiết tự miễn, Cushing, u tế bao tiết glucagon,

u tủy thượng thận, cường giáp, u tế bào tiết somatin, u vỏ thượng thận, DTD

do thuốc hoặc hóa chất, do nhiễm trùng hoặc các type DTD do trung gian tự

miễn như hội chứng Stiff-Man, Down, Klinerfelter và Turner, [19], [20].

DTD thai nghén là DTD phát hiện lần đầu lúc mang thai va phan lớnsau khi sinh glucose máu trở về bình thường, một số ít tiến triển thành DTDtype 2 DTD thai kỳ có xu hướng gặp ở phụ nữ thừa cân, béo phi, nhiều tuôihay phụ nữ sinh đẻ nhiều lần [19], [20]

DTD thé LADA (Latent Autoimmune Diabetes in Adulthood) là DTD

tự miễn nhưng xảy ra ở người lớn [20].

Gần đây, người ta khám phá ra não có sản xuất insulin Thiếu insulin vàglucose trong máu cao là những yếu tổ chính ánh hưởng xấu đến chức năngcủa não, hậu quả là gia tang nguy cơ bệnh Alzheimer’s và chứng mat trí Tinhtrạng này được dé cập như DTD type 3 [19], [20]

Theo Liên đoàn Dai tháo đường Thể giới (IDF), năm 2015 toan thé giới có 415

triệu người (trong độ tuôi 20-79) bị bệnh DTD, tương đương cứ 11 người có 1

người bị DTD, đến năm 2040 con số này sẽ là 642 triệu, tương đương cứ 10người có 1 người bị DTD Bên cạnh đó, cùng với việc tăng sử dụng thực pham không thích hợp, ít hoặc không hoạt động thẻ lực ở trẻ em, bệnh DTD túyp 2đang có xu hướng tăng ở cả trẻ em, trở thành van đề sức khỏe cộng đồng

nghiêm trọng Bệnh DTD gây nên nhiều biến chứng nguy hiểm, là nguyên nhân

hảng đầu gây bệnh tim mạch, mù lòa, suy thận, và cắt cụt chi Nhưng một điềuđáng khả quan, có tới 70% trường hợp DTD tuýp 2 có thé dự phòng hoặc làm chậm xuất hiện bệnh bằng tuân thủ lối sông lành mạnh, đinh dưỡng hợp lý và tăng cường luyện tập thẻ lực [19] [20].

Ở Việt Nam, năm 1990 của thế ky trước, tỷ lệ bệnh DTD chỉ là 1,1% (ở thànhphố Ha nội), 2.25% (ở thành phố Hồ Chí Minh), 0,96% (thành phố Huệ)

nghiên cứu năm 2012 của Bệnh viện Nội tiết trung ương cho thấy: tỷ lệ hiện

mic DTD trên toàn quốc ở người trưởng thành là 5,42%, ty lệ đái tháo đường

chưa được chân đoán trong cộng đồng là 63.6% Tỷ lệ rối loạn dung nạpglucose toàn quốc 7,3%, rồi loạn glucose máu lúc đói toàn quốc 1,9% (năm2003) Theo kết quả điều tra STEPwise về các yếu tố nguy cơ của bệnh khônglây nhiễm do Bộ Y tế thực hiện năm 2015, ở nhóm tuổi từ 18-69, cho thấy tỷ

lệ DTD toàn quốc 1a 4,1%, tiền DTD là 3,6% [19].

1.3 Địa y và hoạt tính sinh học của chúng

1.3.1 Địa y

Dia y là kết quả của sự cộng sinh giữa nam và tảo Tảo cung cấp chất dinhdưỡng cho nam nhờ quá trình quang hợp, ngược lại nam cung cap nước và muốikhoáng cho tảo Nhờ dạng sống cộng sinh nảy nên địa y sống được nhiều nơi trênđất, đá, thân cây, lá cây trong điều kiện môi trường từ vùng khô hạn đến vùng giálạnh Tuy nhiên, địa y cũng rất nhạy cảm với những thay đôi của môi trường, đặc

biệt là sự ô nhiễm Do vậy địa y được xem như chỉ thị của sự thay đôi môi trường

[S].

của thực vật và cũng không có cấu trúc mô, cơ quan của thực vật [5] Địa y cũngkhông phải là loài nam, vì bên cạnh các tế bào nam, địa y còn có các tế bào tảo lụchoặc vi khuẩn lam chứa chất điệp lục Tuy nhiên, do địa y luôn phải có nắm trong

thành phan của mình nên ta có thé xếp địa y vào giới nắm [5].

Theo nghiên cửu của Đại học Harvard, địa y không ảnh hưởng đến cây trồngkhi bám trên chúng Dia y gắn kết với cây nhờ vào sự hợp tác giữa nam và tảo,không gây hại cho cây Bên cạnh đó, sự bảo tồn địa y cũng là một vẫn đề quan tâm

của các nha bảo tổn sinh học Nhiều nước đã hạn chế việc khai thác địa y và xâydựng khu bảo tồn dé bảo vệ loài đặc biệt này.

Các cuộc khảo sát, nghiên cửu chuyên sâu đã chứng minh chiết xuất dungmôi thô và các hợp chất phân lập từ địa y có hiệu quả trong việc ức chế một số

enzyme như amylase, lipase, lipoxygenase, aromatase, cyclooxygenase, trypsin,

B-glucoronidase, prolyl endpeptidase, monoamine oxidase, urease, tyrosinase,

xanthine oxidase, thioredoxin reductase, glucosidase, topoisomerase, elastase tuy,

phosphodiesterase, telomerase và acetylcholinesterase Các chất chuyển hóa củađịa y như usnic acid và các dẫn xuất của nó, lobaric acid, physodic acid, ramalin,

protolichestrinic acid, salazinic acid, atranorin, evernic acid, zeorin, diffractic acid, psoromic acid, methyl }-orcinolcarboxylate, methylorsellinate và anziaic acid đã

được chứng minh 1a chat ức chế một số enzyme Tóm lại, địa y có thé sé là tácnhân trị liệu day hứa hẹn về khả năng ức chế hoạt động của một số enzyme có liênquan đến một số bệnh hoặc một sé rối loạn trong cơ thé Các loài địa y có thé đượcnuôi cấy in vitro trong môi trường tối ưu dé phân lập các chất ức chế enzyme ởquy mô lớn hơn và phát triển các nguồn trị liệu về các bệnh liên quan đến các enzyme [6] Ngoài công dụng chữa bệnh, địa y còn được sứ dụng làm thực pham,

mỹ phẩm, xà phòng, nước hoa.

Hiện có 3 loại địa y chính: Dia y foliose (dang phiền) địa y fruticose (dạng

sợi), địa y crustose (dang kham) [4].

Hình 1.2 Địa y foliose [7].

Địa y fruticose có thể có dạng day chuyên, tóc, cây bụi Nhiều loại địa yfruticose có các nhánh tròn có lõi ở giữa và một số khác có nhánh rong ở giữa Cácloại khác có nhánh phẳng mọc lộn x6n với nhau [4].

Hình 1.3 Địa y fruticose [7].

Địa y crustose chỉ có một lớp vỏ bên ngoài Chúng tạo ra một lớp vo trên các

bề mặt như đá, đất, ô tô hoặc mái nhà Địa y crustose có nhiều màu sắc như vàng,cam, đỏ, xám và xanh lục Chúng được dính vào giá thé [4]

mỗi nam, trong khi địa y dang lá tăng 2 đến 4 cm mỗi năm Địa y dé bị tôn hại bởi

6 nhiễm không khí và thường phải đi xa các thành phố dé tìm thay [4].

1.3.2 Địa y thuộc chỉ Graphis

Chi Graphis là một chi thuộc họ Graphidaceae được phân bố tập trung tại các

vùng nhiệt đới Hiện nay, họ Graphidaceae được xem là họ địa y lớn thứ hai của

ngành Ascomycota với hơn 2500 loài đã được báo cáo va dy đoán có gần 5000loài trên thế giới [9]

báo cáo trên thế giới, trong đó mỗi năm có khoảng hơn 10 loài được phát hiện vàbáo cáo mỗi năm Một số loài có thé kể đến như Graphis japonica, G scripta, G

proserpens, Πepiphloea, Πrenschiana, (11).

Phân loại sinh học địa y Graphis sp.

Chat ức chế enzyme 1a những chat làm giảm tốc độ phan ứng do enzymexúc tác Hoạt động của một enzyme có thẻ giết chết một mam bệnh hoặc điềuchính lại sự không cân bằng trong chuyên hóa Có nhiều loại thuốc ức chếenzyme, chúng cũng được sử dụng như là chất diệt cỏ và thuốc trừ sâu Khôngphải tắt cả các phân tử liên kết với enzyme đều là chất ức chế enzyme, những chất hoạt hóa liên kết với các enzyme và làm tăng hoạt tính enzyme mà chúng liên kết Sự liên kết của một chất ức chế có thé ngăn chặn một cơ chat

đi vào trung tâm hoạt động của enzyme và gây trở ngại cho các phản ứng xúc

tác của enzyme đó Chất ức chế có thẻ liên kết với enzyme thuận nghịch hoặc

không thuận nghịch [24].

Chất ức chế không thuận nghịch thường phản ứng với enzyme và thayđổi nó về mặt hóa học Những chat ức chế đó làm thay đôi du lượng các acidamin quan trong can thiết cho hoạt động của enzyme Ngược lại, chất ức chếthuận nghịch liên kết không đồng hóa trị và theo những kiểu khác nhau tùythuộc vào liên kết chất ức ché-enzyme, phức enzyme-co chất hoặc cả hai

Chat ức chế thuận nghịch liên kết với enzyme bằng các tương tác khôngđồng hóa trị chăng hạn như liên kết hydrogen, tương tác ki nước và liên kếtion Nhiều liên kết yếu giữa các chất ức chế vả trung tâm hoạt tính mạnh mẽ

và đặc biệt Ngược lại, đỗi với các cơ chất và chất ức chế không thuận nghịch,

các chất ức chế thuận nghịch thường không trai qua phán ứng hóa học khiliên kết với enzyme và có thé dé đảng loại bỏ bằng cách pha loãng hoặc thâm

có ái lực với trung tâm hoạt động của một loại enzyme nền xảy ra sự cạnh

tranh giữa cơ chất và chất ức chế cạnh tranh vào trung tâm hoạt động của

enzyme Dây là loại ức chế có thể được khắc phục băng nông độ đủ cao của

cơ chất bởi vì những chất ức chế cạnh tranh thường có cau trúc tương tự nhưcầu trúc của cơ chất thật,

- Ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition): chất ức chế chỉkết hợp với phức enzyme-cơ chất mà không kết hợp với enzyme tự do Đây

là một dang ức ché mà các liên kết của chat ức chế với enzyme làm giámhoạt tính của nó nhưng không ảnh hưởng đến liên kết của enzyme-co chất.Kết quả là mức độ của sự ức chế chi phụ thuộc vào nông độ của chat ức chế

- Uc chế không cạnh tranh (noncompetitive inhibition): chất ức chế kếthợp với enzyme ở vị trí khác với vị trí kết hợp của cơ chất tạo thành phứcenzyme-co chat-chat ức chế không bị chuyên hóa tiếp Như vậy, enzyme cóthê đồng thời kết hợp cả chất ức chế và cơ chất Cơ chất và chất ức chế khôngcạnh tranh với nhau để kết hợp với enzyme và cũng không thể loại trừ tácdụng kim ham bang cách tăng nồng độ cơ chất

- Ue chế hỗn tap (mixed inhibition): là chất ức chế không những liên kết

với enzyme tự do mả còn liên kết với cả phức hợp enzyme-cơ chất tạo thành

phức hợp enzyme-chat ức ché-co chất nên không tạo được sản pham Hiện

tượng ức chế chi phụ thuộc vào nồng độ chất ức chế Tốc độ ức chế cực đại

đo được khi không có chất ức chế là cao hơn khi có mặt chất ức chế [24]

Chất ức chế œ-glucosidase hiện có bao gồm acarbose, voglibose và

miglitol Acarbose là một pseudotetrasaccharide chứa nitơ Voglibose là một dẫn

xuất valiolamine va miglitol là một dẫn xuất deoxynojirimycin Ca acarbose và

voglibose đều có nguồn gốc vi sinh vật, trong khi miglitol có nguồn gốc tong

hợp Acarbose và voglibose hoạt động chủ yếu ở ruột vì ca hai đều không được

hap thu đáng kẻ (acarbose < 2%; voglibose, khoảng 3% đến 5%) [25]

Hoạt tính ức chế enzyme a-glucosidase có thê giúp điều trị bệnh tiêu đường bang cách sử dụng các hợp chất có nguồn gốc là chất chuyển hoá địa y; bao gồm các

ứng dụng điều trị của methylorsellinate (2.4-dihydroxy-6-methylbenzoate).

methyl-B-orinolcarboxylate (2,4-dihydroxy-3,6-dimethylbenzoate) và zeorin

(6 ,22-hopanediol) [12].

Có một số chất chuyên hoá từ địa y có thé được sử dụng làm chất ức chế

a-glucosidase mạnh và có trong các phương pháp điều trị bệnh tiêu đường, béo phi

Đó là methylorsellinate hoặc 2,4-dihydroxy-6-methylbenzoate được phân lập từ Parmotrema greyana và Roccella montagnei thuộc Pseudocyphellaria crocata (L.)

Vain methvl-B-orinolcarboxvlate hoặc 2,4-dihydroxy-3,6-dimethylbenzoate được phan lập từ Cladonia sp thuộc Stereocaulan alpinum Laur và zeorin hoặc 6,22-

hopanediol phan lập từ Cladonia sp [12].

1.4 Thuốc ức chế enzyme a-glucosidase trong điều trị đái tháo đường

Mục đích khi điều trị bằng thuốc ức chế alpha-glucosidase ở bệnh nhân tiêu đường

là giảm lượng đường huyết sau bữa ăn va giảm mức độ chênh lệch giữa mức glucose tối đa và tối thiểu sau bữa ăn Việc giảm đường huyết sau bữa ăn sẽ có lợi

ở những bệnh nhân mắc bệnh tiêu đường không phụ thuộc insulin (NIDDM) vadẫn đến giảm Hemoglobin (HbA) Việc giảm dao động giữa mức glucose sau bữa

ăn sẻ có tác dụng ở bệnh nhân tiều đưởng phụ thuộc insulin

(IDDM) và giảm các đợt hạ đường huyết, giúp quá trình điều trị bệnh tốt hon [25].Thuốc ức chế alpha-glucosidase làm giảm nông độ insulin trong huyết tương ởnhững bệnh nhân có nông độ insulin bình thường hoặc cao nhờ làm giảm đườnghuyết khi tiết insulin

Tác dụng phụ chủ yếu của acarbose va các chất ức chế alpha-glucosidase khác 1a ảnh hưởng tới đường tiêu hóa và đó là kết quả của tác dụng dược lý của thuốc.

Lượng carbohydrate thoát vào đại trang phụ thuộc vao ham lượng carbohydrate

trong chế độ ăn, liều lượng alpha-glucosidase Thuốc ức chế glucosidase được sửdụng, tốc độ tăng liều thuốc và thời gian điều trị Lưu ý, điều trị bằng thuốc nênbat đầu với liều rất thấp va tăng dan từ từ [S].

Việc sử dụng thực tế các chất ức chế alpha-glucosidase trong điều trị bệnh tiểuđường dựa trên kiến thức về cơ chế tác dụng, hiệu quả của chúng trong việc cảithiện kiêm soát đường huyết và các tác dụng phụ của chúng.

Bởi vì tác dụng mạnh mẽ nhất của các thuốc nảy là tăng glucose huyết tương saubữa ăn, nên chúng được coi là phương pháp điều trị đầu tiên cho những người mắcbệnh tiều đường tỉ lệ những người có tinh trang tăng đường huyết sau bữa ăn caohơn đáng kế so với tăng đường huyết lúc đói [26].

1.5 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nắm cộng sinh địa y

Sự có mặt của sắt, glucose, magie trong môi trường tăng trưởng là điều cầnthiết dé phân lập thành công các loại nam cộng sinh địa y [13].

Việc xử lí vật liệu trước khi phan lập nam có thé ảnh hưởng đáng kẻ đến kếtquả Ví dụ, việc xu lí sau thu hoạch không phù hợp có thé tạo ra các loại nắm khácban đầu hoặc các phương pháp khứ trùng bề mặt không đảm bảo có thé tạo điềukiện cho nam bám lỏng lẻo trên bề mặt [ 13].

Có ít nghiên cứu cho đến thời điểm hiện tại so sánh thành phần môi trường

ảnh hưởng đến sự phát triên của nam cộng sinh địa y trong nuôi cấy [13]

Nắm cộng sinh địa y bị ảnh hưởng bởi môi trường có các hợp chất vô cơ vảhữu cơ và giàu các chất định đường khác nhau, chăng hạn như đường, hợp chat

kim loại axit amin và vitamin [13].

Sự có mặt của ethylendiamintetraacetic acid (EDTA) va potassium hydroxide

trong môi trường làm giảm đáng ké kha năng phan lập thành công nắm cộng sinhđịa y Mặt khác, các hợp chất kẽm và manganese cũng rất quan trọng đối với sự

phát triển của chúng [13].

1.6 Tinh hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Trên The giới có nhiều nghiên cứu điều trị bệnh tiêu đường từ nguồn gốc thảo được

như: nghiên cứu của Hminh sieh et al cho thay cao chiết nước từ cây Flemingia

macrophylla cô kha nang ức chế enzyme a-glucosidase and aldose reductase vớigiá trị ICSO lần lượt là 153,92 + 0,20 pe/mL and 79,36 + 3,20 pg/mL [27] : câythuốc Leptadenia hastata (Pers.) decne ở Châu Phi có khả năng ức chế hoạt động

của enzyme a-glucosidase lần lượt là 69,81% and 37,02% đối với dịch trích tir

methanol và nước [28]; cao chiết ethanol từ lá Orthosiphon stamineus có khả năng

ức chế enzyme a-amylase và a-glucosidase với giá trị IC50 lần lượt là 36,70 mg/ml

va 4.63 mg/ml [29], Cao chiết từ than của cây Acacia nilotica có kha năng ức chế

a-glucosidase and aldose reductase với giá trị IC50 lần lượt là 8 pg/mL và 7,5

tug/mL [30]; cao chiết methanol từ lá của cây Psidium guajava cho thấy có kha

năng ức chế enzyme a-amylase va a- glucosidase với khả năng ức chế là 96,3% vả89.4% [31]; lá cay Picralima nitida (Stapf) được trích bằng aceton có kha năng ức

chế enzyme a- amylase va a-glucosidase với giá trị IC50 lan lugt 1a 6,5 mg/mL va

3,0 mg/mL, la cây Morinda lucida Benth (Nigeria), dich trích nước có khả năng

ức chế enzyme a- amylase vả a-glucosidase với giá trị ICSO tương ứng là 2,3

mg/mL và 2.0 mg/mL [32]; dịch trích ethanol từ trái Terminallia capptapa L cô

khả năng ức chế hoạt động của enzyme a-glucosidase với giá trị IC50 là 3,02 ppm

[33]: dich trích của lá cây thuốc lá có khả năng ức chế enzyme a-amylase và

@-glucosidase với giá trị IC50 lần lượt là 5,70 mg/mL và 4,50 mg/mL [34]; cao chiết

từ vỏ của trái chôm chôm có kha năng ức chế hoạt động của hai enzyme a-amylase

va a-glucosidase với ức chế là 97,3% và 96,66% [32]; Cao chiết từ lá mang cau ta

có khả năng ức chế enzyme a-amylase và a- glucosidase [34] Ngoài ra, còn tìmthay hai hợp chất có kha năng chống được viêm loét ở quả mang cau ta là 5 - 6,7-

dimetoxy-2-methyl-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-1-Methyl), 1,3-diol va (IR, 3S) -6,7- dimetoxy-2-methyl-1,2,3,4-tetrahydroisog uinoline-1 ,3- diol [36]; cây mướp dang được sử dụng không chi như một loại rau ma còn được

2-methoxybenzene-sử đụng trong y học cô truyền để phỏng chỗng DTD và nhiều nghiên cứu thửnghiệm trên động vật và trên người cho kết quả có tác dụng kiêm soát glucose máu.Dịch chiết từ qua, hạt hoặc lá cây mướp đẳng đều làm giảm glucose máu lúc đói, cải thiện dung nap glucose máu trên chuột khỏc mạnh, chuột DTD, người khỏe mạnh và bệnh nhân DTD type 2 [37], [38], [39], [40]; nghiên cứu của

Deguchi Y va ctv đánh giá khả năng kiểm soát glucose mau sau ăn trên đối tượngngười khỏe mạnh hoặc tiền DTD cho thấy những người tham gia uống trà lá ôi saukhi ăn một bữa ăn cho thấy mức đường máu sau ăn 30, 60, 120 phút giảm hơn sovới những người tham gia chỉ uống nước sau khi ăn một bữa ăn [41]

Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme alpha glucosidase của loai địa y Parmotrema tinctorum của tác giả Đồng Phan Sỹ Nguyên đã xácđịnh cấu trúc hóa học của một số hợp chất được phân lập từ các phân đoạn cao

ethyl acetate ở địa y Parmotrema tinctorum [14].

Sử dung các phương pháp chiết xuất va sắc ký đã cô lập được từ cao ethylacetate của cây địa y Parmotrema tinctorum năm hợp chat Bằng các phương phápphô nghiệm và so sánh với tai liệu tham khảo hợp chat 1 là methyl orselinate, hợp chat 2 được xác định là hợp chất mới, hợp chất 3 là Tinctorin B, hợp chất 4 đượcxác định la C42-spiroterpenoid mới, 5 gan giống với hợp chất 4, ngoại trừ việc

thay thé methyl keton bằng methyl este

Thử hoạt tinh ức chế enzyme a-glucosidase trên cao chiết va một số hợp chất được phân lập từ cao ethyl acetate của loài địa y Parmotrema tinctorum.

Về hoạt tính sinh học, hai hợp chất (2), (3) thẻ hiện hoạt tính ức chế enzyme /-glucosidase hiệu qua và mạnh hon chất déi chứng dương acarbose (168,0 1M) với giá trị IC50 lần lượt 1a 74,5 và 98,2 uM.

Năm 2020, Tatipamula và cộng sự báo cáo một nghiên cứu cao chiết ethyl

acetate của địa y Graphis ajarekarii cho thấy khả năng làm tan cục máu đông, kháng viêm ở mức độ vừa phải [15].

Nghiên cứu của V B Tatimapula vào năm 2018 cho thấy cao ethyl acetate

từ địa y Graphis ajarekarii có hoạt tính kháng oxy hoá và bệnh tiêu đường Giá trị

IC 50 của — Diphenyl — | - picrylhydrazyl (DPPH).

Nghiên cứu được chiết xuất thô của địa y Grathis tetraleularis thê hiện hoạt tinh kháng khuân, với giá trị nông độ ức chế tối thiểu (MIC) trong khoảng 100 —

200 ng/mL Nghiên cứu hóa học về nước sinh hoạt đã dẫn đến việc phân lậpacremonidin E (1) và gratisin A (2) va B (3) Acremonidin E (1) thẻ hiện hoạt tínhkháng lao với giá trị MIC là 50 pg/mL và thê hiện độc tính tế bào đối với các dòng

tế bào BC, KB và NCI-HI§7 với giá trị ICso là 12,79-27,12 pg/mL, trong khi đó

gravisins Á (2) và B (3) không có hoạt tính trong các thử nghiệm nảy [ L7].

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thiết bị và hóa chất

2.1.1 Thiết bịCác thiết bị sử dụng trong dé tài được trình bay trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng trong đề tài

'Tên thiết bị Hãng (nước sản xuất)

Nôi hap vô trùng ALP (Nhật)

2.1.2 Hóa chất Các hóa chất sử dụng trong đề tài được trình bày trong bảng 2.2

Bang 2.2 Các hóa chất được sử dụng dé làm thí nghiệm

| 4 | Dimethyl sulfoxide VWR International

Sodium biphosphate Merck

| 6 | Disodium phosphate BioBasic

Chem & Pharm,Dai

1=.

2.2 Môi trường nuôi nắm

Đề tài sử dụng môi trường nuôi nắm là môi trường sabouraud được pha theocông thức với 1000 ml nước cất dùng 10 g peptone, 40 g D-glucose va 15 g agar

Đối với môi trường sabouraud thay đổi nguồn carbon, 40 g D-glucose sẽ được

thay lần lượt bằng 40 g manitol hoặc 40 g sorbitol hoặc 40 g sucrosel; đỗi với môitrường sabouroad thay đổi điều kiện pH, môi trường sabouraud được điều chỉnh

pH ở pHs, pHó, pH7, đối với môi trường sabouroad thay đôi điều kiện nhiệt độ,nắm cộng sinh địa y Graphis sp được nuôi trong các điêu kiện nhiệt độ 18°C, 24°C

và 30°C.