Khóa luận tốt nghiệp Sư phạm sinh học: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hoạt tính sinh học của nấm cộng sinh địa y Graphis sp

Người ta nghiên cứu phát hiện nắm cộng sinh địa y có thé sinh trưởng độc lập trên các môi trường nhân tạo.. nhiều công trình nghiên cứu công bồ các chất chuyên hóa thứ cấp từ nam cộng si

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

NGUYEN BAO CHAU

Graphis sp.

KHOA LUAN TOT NGHIEP DAI HOC

NGANH SU PHAM SINH HOC

THÀNH PHO HO CHÍ MINH - 2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

NGUYEN BAO CHAU

Graphis sp.

KHOA LUẬN TOT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH SƯ PHẠM SINH HỌC

NGƯỜI HUONG DAN KHOA HỌC

TS TRAN THI MINH DINH

THANH PHO HO CHi MINH - 2024

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng đây là công trình nghiên cứu của tôi, có sự hỗ trợ từ

giảng viên hướng dẫn là TS Trần Thị Minh Định Các nội dung nghiên cứu và kết

qua trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bat cứ công

trình nghiên cứu nào trước đây Những số liệu trong các bảng biéu phục vụ cho việc

phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tôi thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi trong phần tài liệu tham khảo.

LOI CAM ON Tôi xin chân thành cam on cô TS Tran Thị Minh Dinh - người đã tan tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học

trường Đại học Khoa học tự nhiên đã ho trợ tôi thực hiện khóa luận này.

Tôi xin chân thành cam ơn Trường, Phòng Đào tạo, các thay cô trong Khoa Sinh học - Trường Đại học Su phạm TP Hồ Chi Minh đã tạo điêu kiện thuận lợi cho

tôi thực hiện khóa luận này.

Qua day, tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè

đã giúp đỡ tôi trong thời gian thực liện khóa luận nay.

Thành phô Hồ Chi Minh, ngày 26 tháng 04 năm 2024

SINH VIÊN

Nguyễn Bảo Châu

TED Đối tượng nghiên cứu ¿c2 c0 011211 2112110212221 11 12110102 11c cseu 2

TV.Nhiệm vụ nghiÊn GỮU :::::::::::iccccecG201010000112312131113500311263136356563559385923 653355555 2

Vi PHM Vii GHG COU coposiionoiiioiiiiiatiiii11i1111441116113583351388513058585358818818585558355 3

VI Thời gian va địa điểm nghiên cứu - 22c cac cssccssccesezssrzsee 3 CHƯƠNG 1 TONG QUAN 222222222 2122102222122112 1121072121211 11 1 xe 4

1.1 Địa y và hoạt tính sinh học của chúng - <6 SH SHn như 4

DODD s::::::.:::2:1220124012032122328311435103653335593554953933583382353833553855 83388455 35883487383558 83555 4 1.1.2 Địa y thuộc Chi Graphis nhà nh si, 5 1.1.3 Hoạt tinh sinh học của dia y thuộc chi GrappÌiis .-~c-< «+ 6

1.2 Tổng quan về hoạt tính sinh học -.:-52222222 2 2222225222122212221721 22s cxcee 7

1.2.1 Tổng quan về hoạt tinh kháng khuân -2¿ s22 2x2 2z gị

1.2.1.1 Tông quan vi khuẩn Staplycoccus đir€WS scccscccsccccccssce 71.2.1.2 Tổng quan về môi trường MHA -ccsscccosccee §

1.2.2 Tổng quan về hoạt tinh ức chế enzyme ơ-glucosidase - §

1.2.2.1 Tông quan về enzyme ứ-glucOSiđaS 5 522222222222 cvu § 1.2.2.2 Tông quan về các chat ức chế enzyme a-glucosidase 9 1.3 Anh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nắm cộng sinh địa y 10 1.4 Tình hình nghiên cứu trong vả ngoài nước - -s-sc xxx se sec II

CHƯƠNG 2: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU lầ

2.3 (PHWONG PWAD a sscssscasscarscssscaeeceasssszscasscesessaiess secatseasscarsessssssissasseasseasseazsevacsseiees 15

2.3.1 Phương pháp tách chiết DNA ccccsessessesseessesnesssessesssesseesennvensvennensvens l6 2;3.2.IFhơniE PHAP' PCR ii:siiii:i:cic022126162010110141003116343125)68ã30341153868438E4538985564 17 2.3.3 Phương pháp điện di, giải trình tự Series 18

2.3.4 Phuong phap nudi nam cộng sinh địa y Graphs Sp 19

2.3.5 Phương pháp tạo cao thô ethyl acetate . -ccccceeeerreiereeerre 19

2.3.6 Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học các so eeiuee 19

2.3.6.1 Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuân 19

2.3.6.2 Phương pháp khảo sát hoạt tinh ức chế enzyme o-glucosidase 20

2.3.7 Phương pháp xử lí số liệu 2- 2© 22522222223 E17 xEZSt72zEEcrrzcrrrc 20

CHƯƠNG 3 KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN oioii 21

3.1 Kết quả định danh nam cộng sinh địa y Graphis sp bằng sinh học phân tử.21

3.2 Kết quả nuôi nắm cộng sinh địa y Graphis Sp - sánh 22

3.2.1 Nam nuôi trên môi trường Mix -22-©2+22222zcC2czerrcrrecrrvee 22

3.2.2 Nam nuôi trên môi trường Sabouraud 2 ¿522222222232 xcxcss 24

3.3 Kết quả tạo cao thé ethyl acetate từ nắm cộng sinh địa y Graphis sp 263.4 Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học - 2-2-2222 SE xc2xtrzzrrzcrrrcsyycs 26

3.4.1 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn đỗi với S arews 26 3.4.2 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế enzyme œ-glucosidase 28

/U2050.5A204i50e 101 32

DIEIENIHEHI- 22 56022506 106206525221522161253212032222252-20222022-39922332203222- 207 330212222009233823 32 TAD EDGE UW THAM KHẢỔ ae nniiniieinaeanaerrananaaain-naaranarananadg

Pr OU gi ptagitgg1t1211221103101311151103101371111311411051113311551135314311831958615835954955855533134959358383133388350 a

DANH MỤC CAC CHỮ VIET TAT

Chữ viet tat Chữ viet day đủ

ABTS | 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)

ơ - glucose inhibitors

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

(Công cụ tim kiếm các vị trí tương đồng cục bộ giữa các trình tự)

Colony Forming Unit

CFU - :

(Don vị hình thành khuan lạc}

DMSO Đimethyl sulfoxide

«DPPH 2,2-DiPhenyl-1-PicrylHydrazy]

Dai tháo đường

Half maximal inhibition concentration

(Nông độ ức chế tối da một nửa)

Internal transcribed spacer (Vùng nội phiên mã ở DNA ribosome)

Inhibition of xanthine oxidase

(Uc ché enzyme xanthine oxidase)

Minimum Inhibitory Concentration

(Nông độ ức ché tôi thiểu)

National Center for Biotechnology Information

National Cooperative Bank Limited

(Ngân hang Hợp tác Giới han Quốc gia)

Polymerase Chain Reaction

(Phản ứng chuỗi polymerase)

Tris-Borate-EDTA

TNHH Trach nhiệm hữu han

DANH MỤC CÁC BANG

Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng trong đề tài 2c 222220121 1122112212222 1 cty l3

Bang 2.2 Các hóa chất sử dụng tạo môi trường nuôi cấy - l4

Bảng 2.3 Các hóa chất sử dụng định danh nắm bang sinh học phân tử 14

Bang 3.1 Bảng trình bày sinh khối cao chiết cthyl acetate của của nắm cộng sinh địa

y Graphis sp ở các môi trường và thời gian nuôi cay khác nhau 2- 26

Bang 3.2 Tỉ lệ ức chế enzyme œ-glucosidase của cao chiết ethyl acetate từ nắm cộng SUH địa ¥ GHIDHES'SELi2iiciiiiiiiiiiiioiiiit1i4011211135164315535063358351633553336335853803398353635853536555363 28

Bảng 3.3 Ti lệ ức chế enzyme a-glucosidase của cao chiết từ sinh khối nam đượcnuôi ở môi trường Sabouraud trong 6 tuần -. 2:22 ©++2E++z£EEzttEszrrsrzree 30

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1, Cau trúc của hoạt chất acarbose, miglitOÌ - .s- s52 5s2222 222v: 10

Hình 2.1 Phương pháp định danh nam bang sinh học phân tử - 15

Hình 2.2 Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh hQC :.csecesecssesteeseeeetecseeeeeees 16 Hình 2.3 Chu trình nhiệt dự kiến sử dung trong phản ứng PCR 17

Hình 2.4 Minh họa vị trí các đoạn moi phé thông ITS1 va ITS4 [Š50] 18

Hình 2.5 Hình chụp sinh khối nắm tươi óc 22 2222112112 1102101111211 2c 19 Hình 2.6 Hình chụp sinh khối nam ngâm trong dung môi ethyl acetate 19

Hình 3.1 Hình chụp kết quả điện di sản phẩm PCR vùng ITS của nắm 21

Hình 3.2 Hình chụp kết quả giải trình tự sản phẩm PCR sử dụng môi ITSI 22

Hình 3.4 Hình chụp nắm nuôi trên môi trường Mix 6 tuần -. : 23

Hình 3.5 Hình chụp nam nuôi trên môi trường Mix 8 tuần - 55-555¿ 23 Hình 3.6 Hình chụp nắm nuôi trên môi trường Mix 10 tuần 22-5 24 Hình 3.7 Hình chụp nam nuôi trên môi trường Mix 12 tuần : : 24

Hình 3.8 Hình chụp nam nuôi trên môi trường Sabouraud 6 tuần 25

Hình 3.9 Hình chụp nắm nuôi trên môi trường Sabouraud § tuẳn 25

Hình 3.10 Hình chụp nam nuôi trên môi trường Sabouraud 10 tuần 25

Hình 3.11 Hình chụp nam nuôi trên môi trường Sabouraud 12 tuân 25

Hình 3.12 Hình chụp kết qua khảo sat hoạt tính kháng khuân của nam cộng sinh dia

¥ Graphisisp: nuGiitren môiirtng Mi aceeeieeeeeaeaiaoeaoenenoinoanaoỏnna 27 Hình 3.13 Hình chụp kết qua khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của nam cộng sinh địa

y Graphis sp nuôi trên môi trường Sabouraud - - «+ <sx+<xeeeeeeeseeeexee 27 Hình 3.14 Hình chụp đối chứng âm (DMSO) - 2-02 S5c 22 222222211221ssrrev 27

Hình 3.15 D6 thị thé hiện sự tương quan giữa tỉ lệ ức chế enzyme a-glucosidase với

logarit nồng độ cao từ sinh khôi nam Graphis sp nuôi trên môi trường Sabouraud 6

Phụ lục 1 Hình chụp khảo sát hoạt tính ức chế enzyme œ-glucosidase ở 8 loại cao

EHiEIIGHIN]IRGBRREĐL -. sx:c260225156:15224622259251530312531918E1301E380739428134811123158214233603522858112338182134) a

Phu luc 2 Xử lý số liệu trên phan mềm GrapPad Prism § -2-+¿ a

Phụ lục 3 Hình chụp khao sát hoạt tinh ức chế ICso enzyme a-glucosidase của cao

chiết ethyl acetate thu từ sinh khối nam Graphis sp nuôi trên môi trường Sabouraud

MỞ ĐÀU

I Lí đo chọn đề tài

Hiện nay, các căn bệnh do nhiễm khuan, nhiễm trùng là nguyên nhân gây tửvong cho hàng triệu người trên thẻ giới [1] Các bệnh do nhiễm khuẩn thông thườngđược điều trị bằng kháng sinh Tuy nhiên, điều nảy vô tình gây ra hiện tượng kháng

kháng sinh Đề kháng với kháng sinh ở vi khuẩn ngày càng trở nên phô biến khiến

cho tỉ lệ điều trị thành công các bệnh nhiễm khuẩn giám đi đáng kẻ và trở thành mối

nguy hại cho sức khỏe va tính mạng con người [2].

Dai tháo đường (DTD) là bệnh rồi loạn chuyển hóa do các tế bào beta của tuyến

tụy sản xuất insulin không đủ cho cơ thé, hoặc co thể có đủ insulin nhưng tế bào

không thé sử dụng Căn bệnh này ngày càng gia tăng không chỉ ở các nước phát triển

mà cỏn ở các nước đang phát triền, trong đó có Việt Nam [3].

Ở những bệnh nhân mắc bệnh DTD tuýp 2, sau bữa ăn đường huyết thường có

xu hướng tăng vọt, khó kiểm soát do hoạt động của enzyme a-glucosidase Acarbose

thường được dùng trong điều trị bệnh thông qua đường uống, với cơ chế ức chế

enzyme ơ-glueosidase Tuy nhiên, điều trị bệnh bằng acarbose ít nhiều gây ra những

tác dụng phụ không mong muốn [3] Vì vậy, các nghiên cứu hiện nay tập trung nghiên

cứu những hợp chất có nguồn gốc từ tự nhiên với mong muốn tôi ưu trong điều trị bệnh DTD tuýp 2.

Địa y - một dang sông cộng sinh giữa tảo hoặc vi khuẩn lam và nam cộng sinh.

Các hợp chất được tạo ra bởi địa y gồm các chất chuyên hóa sơ cấp (protein, aminoacid, polyol, carotenoid, polysaccharide, vitamin) va thứ cấp (depside, depsidone,

dibenzofuran, steroid, terpene, ) được nhận định có nguồn tốc từ nắm cộng sinh địa

y Trong tự nhiên, nam cộng sinh địa y phat trién khá chậm và lượng sinh khối thu

nhận được không ôn định do tác động của ô nhiễm môi trường [4] Người ta nghiên cứu phát hiện nắm cộng sinh địa y có thé sinh trưởng độc lập trên các môi trường nhân tạo Đến thời điểm hiện tại nhiều công trình nghiên cứu công bồ các chất chuyên

hóa thứ cấp từ nam cộng sinh địa y có hoạt tính sinh học như ức chế enzyme

a-glucosidase, khang khuan, khang nam [5] [6] [7].

Chỉ Graphis với hơn 400 loài - chiếm số lượng lớn nhất họ địa y Graphidaceae [8] [9] Nhận thay chi nam nảy chưa có nhiều nghiên cứu thực hiện khảo sát hoạt tinh

kháng khuân đối với Staphylococcus aureus và hoạt tính ức chế enzyme

a-glucosidase Tính đến tháng 4 năm 2024 vẫn chưa có nghiên cứu nào được thực hiện

nhằm khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cay đến hoạt tinh kháng khuan và ứcchế enzyme ơ-glucosidae của nắm cộng sinh địa y Graphis sp

Vi những lý do trên dé tải “Khao sát ảnh hướng của môi trường nuôi cấy đến hoạt tính sinh học của nam cộng sinh địa y Graphis sp.” được thực hiện.

II Mục tiêu nghiên cứu

Khao sát ảnh hường của môi trường nuôi cấy đến hoạt tính kháng khuan đối với

Staphylococcus aureus và hoạt tinh ức chế enzyme o-glucosidase của nam cộng sinh

địa y Graphis sp

III Đối tượng nghiên cứu

Nắm cộng sinh địa y Graphis sp được phân lập va lưu trữ ở phòng thí nghiệm

Sinh hoá — Vi sinh với mã số UE-MY08 Loài nam này được phân lập từ mẫu địa y

thu ở tỉnh Tra Vinh vào tháng 3 năm 2023 Mẫu địa y được định danh bởi Tiến sĩ Võ

Thị Phi Giao, Khoa Sinh học — Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tựnhiên Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh và được lưu giữ tại Trường Đại họcKhoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Thanh pho Hỗ Chi Minh với mã số UE-L014

IV Nhiệm vụ nghiên cứu

- Định danh nắm cộng sinh địa y Graphis sp bằng sinh học phân tử.

- Nuôi nam Graphis sp với số lượng lớn trên môi trường Mix và Sabouraud.

- Thu sinh khối nắm vào các thời điểm 6 tuần, 8 tuần, 10 tuần và 12 tuần

- Tạo cao thô ethyl acetate từ sinh khối nắm thu được.

- Khảo sát hoạt tính sinh học:

+ Hoạt tính kháng khuan.

+ Hoạt tinh ức chế enzyme œ-glucosidase

V Pham vi nghiên cứu

Đề tai khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cay đến hoạt tính kháng khuẩn

và hoạt tính ức chế enzyme ơ-glucosidase của loài nam cộng sinh địa y Graphis sp

VI Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: 6 tháng (10/2023 — 03/2024).

- Địa điểm: Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh hóa — Vi sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thanh phố Hỗ Chí Minh.

CHUONG 1 TONG QUAN

1.1 Dia y va hoạt tính sinh học của chúng

1.1.1 Địa y

Địa y được hình thành từ mối quan hệ cộng sinh giữa 2 thành phần gồm nam

(mycobiont) và một số các sinh vật có khả năng quang hợp (photobiont) [10] Thành

phần thứ nhất là nam, một số nhà khoa học cho rằng khoảng 17-30% trong tong số nắm có khả năng cộng sinh với tảo phát triển thành địa y Nam được ước tính khoảng

trên 1.5 triệu loài Từ đó nhận thấy, tảo cộng sinh với nắm có thé cho ra tối thiểu

250.000 loài địa y [11] Thanh phan thứ hai là các sinh vật có khả năng quang hop,hiện nay phân loại được khoảng 100 loài trên tong số địa y đã biết [12] Tảo lục dinh

dưỡng bằng cách quang hợp tạo ra carbohydrate và chất hữu cơ Hình thức dinh

dưỡng ở nam là dị dưỡng, nắm sử dụng chất hữu cơ do tảo quang hợp tạo ra Mặt

khác, nắm tông hợp các hợp chất tự nhiên và bảo vệ tảo khỏi các tác nhân gây hại

như tia UV, sâu bọ, động vật ăn thực vật, [ 10]

Địa y được phân loại thành 3 dạng cơ bản: dạng kham, dạng sợi, dạng phiên

[10] Dạng khảm (crustose) bám chặt vào bề mặt của giá thẻ Giá thể có thé là đá hoặcvách đá, thân cây khác Dạng phiến (foliose) phát triển nhiều cành nhánh giống với

cau trúc của lá cây Dang sợi (fruticose) cau trúc hình Soi, với nhiều sợi hợp lại tạo

thành hình dáng giống dang cây bụi nhỏ [11] Địa y phân bố trên 8% bề mặt đất liềncủa trái đất, chủ yếu ở các vùng Bắc Cực, Nam Cực, lãnh nguyên, các vùng núi [13]

Da dang về hình thái và mỗi quan hệ cộng sinh độc đáo giữa nắm và tảo là lý đo khiến

địa y sinh trưởng, phân bé ở rat nhiều nơi, kê cả ở những môi trường khắc nghiệt nhất

trên thé giới [10]

Tên địa y được đặt theo tên loài nắm thay vì theo tên loài tảo vì nắm là thành

phần để quan sát hơn tảo Thực nghiệm quan sát được, địa y có nhiều màu sắc như vàng nhạt, vàng tươi, đỏ, cam xanh lá cây, đen, nâu, bạc và xám Dãy màu sắc phong phú bên ngoài của địa y giúp bảo vệ chúng khỏi điều kiện chiều sáng cao hoặc nhiệt

độ thấp, tạo độ âm đẻ địa y sinh trưởng tốt Hơn 700 hợp chất hóa học hữu cơ đã được

cô lập từ địa Mỗi loai địa y sẽ tổng hợp các hợp chất chuyên hóa có thành phân hóa

học khác nhau Do đó, dựa vào việc xác định thành phan hóa học của những hợp chất chuyển hóa này giúp phân biệt các loài địa y khác nhau nhưng hình thái tương tự

nhau Môi trường bị ô nhiễm gây ảnh hướng rất lớn đến sự sinh trưởng, phát trién,

phân bố của địa y Vì vậy địa y có thé được xem là sinh vật biểu thị cho mức độ ô

nhiễm môi trường [11].

Trong nhiều năm qua, địa y được sử dụng như một phương thuốc truyền thông chữa bệnh ở các nước Châu Âu Dia y có thé được dùng chữa bệnh ho, bệnh tiêu

đường, bệnh lao phôi làm lành vết thương, bệnh da liễu Ngoài ra, địa y còn là nguồnnguyên liệu cho sản xuất thuốc nhuộm, rượu, tinh dau thơm, {14] [15]

Phân lập nắm cộng sinh địa y người ta tìm thấy các hợp chất có hoạt tính sinhhọc như usnic, acid lichesterinic và atranorin [14] Bên cạnh đó, địa y tông hợp cáchợp chất chuyên hóa thứ cấp: depside, depsidone, dibenzofuran, dẫn xuất xanthone

vả terpene Địa y cùng các hợp chất này có những hoạt tính sinh học như: kháng

virus, kháng khuẩn (hiệu quả nhất đối với vi khuẩn gram dương), ức chế enzyme, Một vai ví dụ điển hình về công dụng chữa bệnh ở một số loài nắm cộng sinh địa y

gồm Lobaria pulmonaria và P sulcata được ding trong điều trị các bệnh liên quanđến phôi và thần kinh Xanthoria parietina được dùng điều trị bệnh vàng da và

Letharia vulpina ding trong điều trị các bệnh về da dày Parmelia caperata, Parmelia

sulcata và Parmelia saxatilis có hoạt tính ức chế ung thư khá cao với giá trị ICso dao

động trong khoảng 9,55 - 22,95 ug/mL [16] [17].

1.1.2 Địa y thuộc chỉ Graphis Graphis là một chỉ địa y được tìm thấy chủ yếu ở vùng nhiệt đới bao gồm 330 loài đã biết [18] Các loài địa y thuộc chi Graphis có thé được phân loại dựa vào so sánh đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý, sinh hóa Mặt khác phân loại các loài nam cộng sinh địa y ở chi Graphis có thé sử dụng kết qua của những nghiên cứu trước

đó đề so sánh hoặc định danh bằng chính xác đến tên loài dựa vào các kỹ thuật sinh

học phân tu.

Da phan các loài địa y thuộc chi Graphis đều có mau sắc tan là trắng xám do sự hiện diện của các cum tinh thê calcium oxalate lớn phân bô bên trong và bên trên của

sinh vật quang hợp (tảo) Các hợp chất chuyên hóa như acid norstictic hoặc stictic nếu được các loại nắm cộng sinh với địa y tông hợp ở nông độ cao có thé ảnh hưởng

đến màu sắc tản địa y (vàng nhạt) [19]

1.1.3 Hoạt tính sinh học cua địa y thuộc chỉ Graphis

G ajarekarii có hoạt tính ức chế đông máu, kháng viêm va ức chế sự biến tínhprotein cũng như sự phát triển của các dòng tế bào ung thư (MCF-7, DU145 và K-

562) [20] G ajarekarii còn có kha năng kháng oxy hóa, khử ion Fe**, tan máu đông,

kháng viêm, ức chế tế bào ung thư [21] [22].

G garoana, G glauconigra, G hossei, G inamoena, G inguinata, G.

patwardhanii, G persicina, G persulcata, G pyrrhocheiloide, GΠscripta, G.

sikkimensis, G sorediosa có nhiều hoạt tính sinh học như: ức chế enzyme tyrosinase,

xanthine oxidase, kháng oxy hóa [22].

G schizograpta, G guimarna, G nakanishiana đều cho thấy hoạt tinh ức chế

enzyme xanthine oxidase lần lượt là 28,8%, 58,4%, 69,3% khi được nuôi cấy trên môi trường Bold cải tiên [4] Bên cạnh đó, G assamensis, G nakanishiana, đã cho

thay khả năng ức chế enzyme tyrosinase trong khoảng 30 - 78% [23]

Các hoạt chất được cô lập có hoạt tính sinh học cao như norstictic, stictic,

constictic, salazinic, trace stictic từ các loài nam cộng sinh địa y: G yunnanensis, G assamensis, G guimarana, Ở inquinata, G longiramea, G nakanishiana Bên cạnh

đó, G sorediosa, G assamensis, G nakanishiana thé hiện hoạt tinh ức ché enzyme tyrosinase từ 50% trở lên [24] [25].

Các cao chiết methanol từ các loài nam cộng sinh địa y: G assamensis, G guimarana, G patwardhanii, G sikkimensis cho thay kha năng loại bỏ gốc tự do từ 50% trở lên Bên cạnh do, G assamensis, G exalbata, G inamoena, G patwardhanit,

G pyrrhocheloides con có kha nang ức chế enzyme xanthine oxidase với ti lệ ức chếtrên 50% trong khi ở các loài khác ti lệ ức chế enzyme xanthine oxidase chi khoảng

30% [25].

G handelii có hoạt tính ức chế nhiều loại enzyme, bao gồm ức chế enzyme glucosidase, enzyme phiên mã ngược HIV-1, ức chế enzyme protease chính (MPP") ở

ơ-virus SARS-CoV-2 Bên cạnh đó, G handelii còn có khả nang chống viêm và gây độc tế bao đối với một số đồng tế bảo ung thư [26].

1.2 Tông quan về hoạt tính sinh học

1.2.1 Tổng quan về hoạt tính kháng khuẩn

1.2.1.1 Tổng quan vi khuẩn Staplycoccus aureus Staphylococcus aureus là một loại tụ cầu khuẩn gram dương được phân loại

trong họ Micrococcaceae (Stackebrandt và Woese, 1979; Schleifer, 1986) [27].

S.aureus là vi khuẩn ưa nhiệt, một số chủng tụ câu khuẩn có thé phát triển ở nhiệt độ

thấp tới 6,7°C Nhìn chung, S.aureus sinh trưởng trong nhiệt độ dao động trongkhoảng 7 đến 47,8 °C và nhiệt độ tôi ưu cho sự phát triển ở S aureus là 35 °C

Người ta đã chứng minh rằng S aureus có khả năng sản xuất ít nhất 34 loại protein

ngoại bào khác nhau và không có chủng vi khuẩn nào có kha năng sản xuất tat cả các

loại protein này [28]

S aureus có nhiều yếu tô độc lực khác nhau có thẻ dẫn đến nhiễm trùng nặng

Catalase được sản xuất bởi S aureus, là một enzyme cho phép vi khuẩn này tôn tại

trong tế bào bằng cách phá vỡ hydrogenperoxide Protein trên mang tế bào củaS.aureus bao gồm coagulase (chất xúc tác tạo ra fibrin từ fibrinogen) và các yếu tố

kết tụ (gây đông máu) Độc tổ của các chúng S aureus và các chất ngoại bào có thé

gây tan máu (tiêu diệt hồng cau), leukocidin (gây hoại tử da), độc tổ ruột B và C lan

truyền phản ứng viêm toàn thân [29].

Ching Š aureus có khả năng kháng kháng sinh penicillin ngay sau khi kháng

sinh ra đời vào đầu những năm 1940 (Lowy 2003: Peacock và Paterson 2015; Walsh 2016) S aureus thủy phân vòng B-lactam và phá hủy hoạt tính kháng khuẩn của

thuốc [30]

Qua thir nghiệm nhận thay nắm cộng sinh địa y Parmelia sulcata có chứa thành

phan acid salazinic có kha năng khang S aureus [31] Cao chiết hexane của nắm

Evernia prunastri có kha năng kháng S aureus lần lượt với các với nồng độ ức chế tôi thiểu - MIC là 21 pg/mL [32] Cao chiết ehtyl acetate từ 2 loài nam cộng sinh địa

y là Graphis ajarekarii và Paramotrema tinctorum có kha nang kháng vi khuân gram

âm như: Escherichia coli và Salmonella typhi và vi khuẩn gram dương như:

Micrococcus luteus va Bacillus subtilis [33].

Nhận thay địa y thuộc chi Graphis có kha nang kháng một số vi khuẩn gram

dương nhưng ít nghiên cứu thực hiện khảo sát hoạt tính kháng khuẩn đối với S.

aureus Vì vậy đề tài tiền hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn S aureus từ cao chiết

ethyl acetate của nam cộng sinh địa y Graphis sp

1.2.1.2 Tổng quan về môi trưởng MHA Môi trường Muller Hinton Agar (MHA) được phát trién bởi J Howard Mueller

va Jane Hinton tai dai hoc Havard vào năm 1941 MHA là môi trường giàu dinh

dưỡng và thường dùng dé thực hiện kiêm tra sự nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn Môi trường MHA gồm các thành phan sau: chiết xuất từ thịt bd, casein

hydrolysate (cung cấp nhiều acid amin và các chất khoáng can thiết cho sự sinh

trưởng), tinh bột và thạch với pH của môi trường ôn định trong khoảng 7,4 - 7,6 [34].

Hiện nay môi trường MHA được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu, vì vậy MHA

được sản xuất với dạng bột pha sẵn các thành phân với nhau Tuy nhiên tùy thuộc vào công ty sản xuất mà thành phan và định lượng các chat có thé sẽ có sự thay đôi

nhưng vẫn đảm bảo đặc tính nguyên thủy của môi trường.

1.2.2 Tổng quan về hoạt tính ức chế enzyme a-glucosidase

1.2.2.1 Tổng quan về enzyme a-glucosidase

Enzyme a-glucosidase (EC 3.2.1.20, maltase) là một enzyme thuộc nhóm

glycosidase Enzyme này được tìm thấy nhiều trong ruột non và gềm một nhóm các enzyme như maltase, glucoinvertase, glocosidosurase, maltase-glucoamylase, a-

glucopyranosidase, glucosidoinvertase, @-D-glucosidase, a-glucosidase hydrolase,

œ-1 ,4-glucosidase [35] [36] Enzym a-glucosidase tồn tai trong hau hết các sinh vật O

người, enzym a-glucosidase được tim thấy trên vi nhung mao đường ruột, tham gia

trong bước cuối cùng của quá trình chuyên hóa carbohydrate [37]

Enzym a-glucosidase là một trong những enzyme thuộc lớp glycoside hydrolase

(GH) có khả năng tách các liên kết glycoside giữa 2 phân tử carbohydrate Khả năng

phân cắt các liên kết glycoside của enzyme a-glucosidase nhanh hơn 10-17 lần so với phản ứng không có enzyme xúc tác [37].

Carbohydrate là chất dinh dưỡng đa lượng chính trong chế độ ăn của con ngườichúng ta Khi đưa thức ăn vào cơ thẻ, các phân tử carbohydrate sẽ được thủy phânthành những phân tử đường đơn bởi các enzyme trong ruột non Sau bữa ăn nguồn

carbohydrate này đi vào cơ thê và bị thủy phân thành những phân tử đường đơn và thâm thấu bởi hệ các enzyme trong ruột non như enzyme a-amylase ở tuy và enzyme a-glucosidase Do vay, bang việc ức chế hoạt động của enzyme a-glucosidase có thê

làm giảm quá trình thủy phân carbohydrate và làm chậm sự thâm thấu glucose vàomáu, giảm đường huyết [37]

Các chất ức chế enzyme a-glucosidase — AGIs (a-glucosidase inhibitors) làm

chậm quá trình tiêu hóa và hap thu carbohydrate Kết quả là lượng đường trong máu sau bữa ăn được duy trì ở mức thấp hơn Băng cách này, lượng glucose tăng đột ngột sau bữa ăn có thê được kiêm soát Do đó ức chế enzyme a-glucosidase được coi là

mục tiêu điều trị quan trọng để điều trị các bệnh liên quan đến carbohydrate như bệnh

DTD tuýp 2 [35].

Theo các nghiên cứu trước đây, các loại thuốc AGIs điển hình như miglitol va acarbose, có thé tăng cường tiết GLP-1 (Glucagon like peptide-1) làm giảm cảm giác thèm ăn [37] Hiện nay có nhiều AGI nôi tiếng được sản xuất bởi các hợp chất hữu

cơ đề điều trị bệnh tiều đường như acarbose, miglitol, nojirimycin, voglibose [38] Acarbose thuộc nhóm thuốc điều trị DTD đường uống không hướng insulin [39] Acarbose làm chậm quá trình tiêu hóa carbohydrate bằng cách ức chế cạnh tranh với

enzyme ơ-glucosidase ở ruột non, dẫn đến làm giảm đường huyết sau ăn [37] Do

phương thức tác dụng độc đáo của nó, acarbose không chỉ đóng vai trò thiết yếu và

trực tiếp trong hap thu carbohydrate từ thức ăn vào máu mà còn có vai trò gián tiếp

trong việc tối ưu hóa quá trình chuyên hóa glucose trong cơ thé, góp phan điều tiết lượng hormone insulin [39].

OH

Hình 1.1 Cấu trúc của hoạt chất acarbose, miglitol

Tuy nhiên, điều trị ĐTD tuýp 2 từ AGI có một số tác dụng phụ như: đau bụng

chướng bụng, day hơi, tiêu chảy và chuột rút Vì vậy, việc sàng lọc những hợp chat

tự nhiên với mong muốn hạn chế tác dụng phụ từ các loại thuốc tông hợp ngày càng

được quan tâm [38] Và trong số những sản phẩm từ tự nhiên, địa y đang là một đối

tượng day tiềm năng đáng dé quan tâm nghiên cứu về hoạt tính ức chế enzyme

ứ-glucosidase.

1.3 Anh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nắm cộng sinh dia y

Môi trường nuôi cay có ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của nắm cộng sinh

địa y được khảo sát trên ở ba loài là G schizograpta, G guimarna, G nakanishiana

được nuôi cây trên các môi trường: Malt-yeast, Bischoff va Bold, Lilly-Barnett,

Murashige và Skoog, Bold va Bold cải tiến (thay đổi nguồn carbon và nguồn nitrogen) Dung môi methanol được sử dụng tạo cao nhằm tiến hành khảo sắt các hoạt tính như: ức chế enzyme tyrosinase, ức chế enzyme xanthine oxidase, loại bỏ

gốc tự do [4]

G schizograpta thé hiện hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase cao nhất khi nuôi trên môi trường Bold cải tiến với tỉ lệ ức chế là 17,3% và thấp nhất khi nuôi trên môi

trường Murashige và Skoog với ti lệ ức chế là 2,3% Hoạt tính ức chế enzyme

xanthine oxidase cao nhất khi nuôi trên môi trường Bold cải tiền với tỉ lệ ức chế là 28.8% và thấp nhất khi nuôi trên môi trường Malt-yeast, Bischoff và Bold với ti lệ

ức chế là 4.8 % Khả năng loại bỏ gốc tự do cao nhất khi nuôi trên môi trường Bold

cải tiền với tỉ lệ ức chế là 13.1% và thấp nhất khi nuôi trên môi trường Murashige và

Skoog với tỉ lệ ức chế là 0,3 % [4]

G guimarna thé hiện hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase cao nhất khi nuôi trên

môi trường Bold cải tiến với tỉ lệ ức chế là 62,5% và thấp nhất khi nuôi trên môi

trưởng Murashige và Skoog với tỉ lệ ức chế là 7,8% Hoạt tính ức chế enzyme

xanthine oxidase cao nhất khi nuôi trên môi trường Bold cải tiến với tỉ lệ ức chế là

5§,4% và thấp nhất khi nuôi trên môi trường Bischoff và Bold với tỉ lệ ức chế là 5,8

% Kha nang loại bỏ gốc tự do cao nhất khi nuôi trên môi trường Bold cải tiễn với ti

lệ ức chế là 77,2% và thấp nhất khi nuôi trên môi trường trường Malt-yeast với tỉ lệ

ức chế là 2,4% [4]

G nakanishiana thé hiện hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase cao nhất khi nuôi

trên môi trường Bold cải tiền với tỉ lệ ức chế là 44,2% và thấp nhất khi nuôi trên môi

trường Murashige và Skoog với tỉ lệ ức chế là 6,3% Hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase cao nhất khi nuôi trên môi trường Bold cải tiền với tỉ lệ ức chế là 69,3% và thấp nhất khi nuôi trên môi trường Murashige và Skoog với tỉ lệ ức chế là

10,7 % Kha năng loại bỏ gốc tự đo cao nhất khi nuôi trên môi trường Bold cải tiếnvới tỉ lệ ức chế là 66,2 % và thấp nhất khi nuôi trên môi trường trường Murashige vàSkoog với ti lệ ức chế là 15,4 % [4]

Nhìn chung, ở nghiên cứu cho thay môi trường Bold cải tiền là môi trường lý

tưởng hơn so với các môi trường còn lại cho 3 loài nắm cộng sinh địa y là G schizograpta, G guimarna và GŒ nakanishiana thẻ hiện các hoạt tính như: ức chế enzyme tyrosinase, ức chế enzyme xanthine oxidase, loại bỏ gốc tự đo [4].

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Nam 2009, nghiên cứu chiết xuất từ địa y G tetralcularis cho thay hoạt tính

kháng khuẩn Mycobacterium tuberculosis — trực khuẩn chủ yếu gây bệnh lao, với giá

trị nông độ ức ché tối thiêu (MIC) là 100-200 ug/mL [40]

Năm 2018, nghiên cứu xác định được thành phần chat chỗng oxy hóa (DPPH, ABTS và gốc tự do), chống độc tế bào thử nghiệm ở chuột bạch tạng đực, hạ đường

huyết qua thử nghiệm dung nạp glucose đường uống ở chuột và thuốc trị đái tháo

đường Streptozotocin (STZ) gây ra bệnh tiêu đường ở chuột được tìm thay ở loài nam

cộng sinh địa y Ở ajarekarii [41].

Nam 2018, một nghiên cứu chi ra rang cao chiết methanol từ nắm cộng sinh

địa y Usnea schadenbergiana có khả năng ức chế enzyme a — glucosidase giá trị ICs

là 75.23 pg/mL cao nhất trong II loài địa y được phân lập tai Việt Nam [14].

Năm 2020, nghiên cứu đã tiến hành phân lập thành công 5 depsidone mới từ

loài địa y Parmotrema tsavoense Các hợp chất thé hiện khả năng ức chế enzyme

a-glucosidase với giá trị ICso nằm trong khoảng tir 10,7 đến 17.6 uM gấp nhiều lần so với đối chứng dương acarbose (ICs» = 449 HM) [42].

Nam 2022, nghiên cứu thấy chiết xuất polyphenol của O subpallescens, P

saxatilis, V viridula và G scripta cho thay khả năng ức chế rất mạnh đối với Pseudomonas aeruginosa (94,52%, 96.08%, 90.7%) va Escherichia coli (90.55%) [43] Loài địa y Parmotrema tsavoense qua nghiên cứu đã phân lập được chat mới có tên gọi là Parmosidone K thẻ hiện khả năng ức chế enzyme œ-glucosidase với giá trị ICs cao là 3,12 uM [44].

Việt Nam có số lượng và thành phần địa y vô cùng đa dạng và phong phú Tuy nhiên địa y chưa thật sự được quan tâm về hoạt tính sinh hoc, cũng như những đóng

góp to lớn ma địa y mang lại [45].

CHƯƠNG 2: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Nắm cộng sinh địa y Graphis sp được định danh bởi Tiến sĩ Võ Thị Phi Giao

Hiện nay loài nam này được lưu trữ ở phòng thí nghiệm Sinh hoá — Vi sinh với mã

số UE-MY08 và tại Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Dai học Quốc gia Thành phố

Hỗ Chi Minh với mã số UE-L014.

2.2 Thiết bị và hoá chất

2.2.1 Thiết bịCác thiết bị sử dụng trong dé tài được thé biện ở Bảng 2.1:

Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng trong đề tài

Tên thiệt bị Hãng (nước) sản xuât

Noi hap vô trùng ALP (Nhat)

Tu say Memmert (Đức)

: Tu cây vô trùng Việt Nam

+ [| w Can phân tích điện tử Sartorius (Đức)

~ Máy cô quay chân không — Heidolph (Mỹ)

Máy đo OD Thermo Genesys 20 (Mỹ)

—— Pipetman 5000 ul VITLAB (Đức)

Pipetman 1000 ul Isolab (Đức)

Pipetman 200 ul My (Bio — Rad)

a a)

Ban doc gel Major (Mỹ)

17 May doc dia BMG LABTECH - CLARIOstar (Đức)

2.2.2 Hóa chất Hóa chat sử dụng tạo cao là ethyl acetate 99,5% (AR, Trung Quốc).

Các hóa chất được sử dụng tạo môi trưởng nuôi cấy và định danh nắm bằng sinh

học phân tử được thẻ hiện ở Bảng 2.2, Bảng 2.3.

Bảng 2.2 Các hóa chất sử dụng tạo môi trường nuôi cấy

Gap 1,5 lan so với théTach chiét DNA tich dich néi

dung dich d¢m EB

Rnase A

_PCR dH20

(tng thé tích 25 pL, còn ON1137 (mỗi xuôi)

lại 2 tL DNA) ONI138 (môi ngược)

Tag mix

Agarose

TBE 1X Dién di loading dye 5 lan so với thê tích sản

pham PCR