Khóa luận tốt nghiệp Sư phạm sinh học: Định danh và xác định quan hệ phát sinh chủng loại của một số loài vi tảo lục ở Cần Giờ dựa trên trình tự rDNA 18S

Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Dinh danh và xác định quan hệ phát sinh chúng loại của một số loài vi tảo lục ở Can Giờ dựa trên trình tự rDNA 188” được thực hiện nhằm góp phần bỗ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO —_

TRUONG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

VÕ THỊ THANH XUÂN

ĐỊNH DANH VÀ XÁC ĐỊNH

_ QUAN HỆ PHÁT SINH CHUNG LOẠI

CÚA MỘT SÓ LOÀI VI TẢO LỤC Ở CÀN GIỜ

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGANH SƯ PHAM SINH HỌC

THÀNH PHO HO CHÍ MINH - 2023

BỘ GIÁO ĐỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

LỜI CẢM ƠN

Đề hoàn thành bài khóa luận tốt nghiệp này, trước tiên em xin bày tỏ lòng biết

ơn sâu sắc đến thay Đỗ Thành Trí - người đã tận tình hướng dan, giúp đỡ và nhắc

nhớ em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận.

Bên cạnh đó, em xin gửi đến các quý thay, cô khoa Sinh học, Trường Đạt học

Sư Phạm Thanh phố Ho Chí Minh lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất vì đã tạomọi điều kiện giúp đỡ cm trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa

luận.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Tran Hoàng Dũng, ThS Nguyễn Thành Công đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện dé tài.

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn bạn bè và gia đình đã động viên, khích lệ

trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu dé em hoàn thành tốt khóa luận của

mình.

Tuy nhiên, vì kiến thức bản thân còn nhiều hạn chế, trong quá trình hoàn

thành khóa luận em không thể tránh được nhiing thiểu sót Em mong nhận được những góp ý chân thành từ các thay, cô để em có thé hoàn thành tốt khóa luận này.

Em xin chân thành cam ơn!

TP.HCM ngày OS tháng OS nắm 2023

SINH VIÊN

Võ Thị Thanh Xuân

571 À na 1

l1 1020 0109076000070 .aaaaaAa.a |

II MỤC DICH NGHIÊN CỨU 22-52 2S S5 EE2EE E211 2115211211 217211 11211211 1c xe 2

IL DOL TUGNG NGHIEN CUU tỈÍỈẮỈ.ỈẮIIẮÁẮ 2

IV NHIỆM VU NGHIÊN CỨU 2-2 t12SEESEE95211111 2112112115111 1111 212212121111 10, 2

V PHAM VI NGHIÊN CỨU 22-52 5S 21155112 EE21111 211721157 111217211 111112211221 22c 3

Rap TDNGODHAN - -s 4 1.1 TONG QUAN KHU DỰ TRỪ SINH QUYEN RUNG NGAP MAN CAN GIỜỞ 4

1.2 TONG QUAN VE VI TAO vooccceccssssssesseeseessesssesseassestenveesennenen ¬ 5

1.2.1 Giới thiệu về vi tảo LUC o.oo ecceeceeececscessecsecssecseeseessessecssecesecsessessucssesetestsseteneceseens 5

J;2:2.IPHẩRÏGẠ::::::iissticsrisssiiasiiestiasit212225251166355433555315511523555016481883318335230886E585855742655885558588 6

1.3, VAI TRỊ VÀ UNG DUNG GUA VITÁOGLỤC ii 7

1.3.1 Vai trị của vi tao lục trong hệ sinh thái và mơi trường -e 7

1.3.2 Ứng dụng của vi tảo lục làm dược pham và chế pham sinh học 7

1.3.3 Ung dụng của vi tảo lục trong nơng nghiệp -2-©222222z22zzcczzccrzzcrrzcee §

1.4 CÁC MAKER PHAN TU TRONG ĐỊNH DANH VI TẢO -¿c 55c c6 9

1.4.1 Mã vạch DNA (DNA barcoding) - - - HH HH ng re 9 1.4.2 Trinh tr 0/GảảaồảÝÝỶẢĨ 9

1.5 TINH HÌNH NGHIÊN CUU TRONG VÀ NGỒI NUGC oooceocesccesccssecseeseeseesseeeees HH

I:5.I Cac nghiên:cứu ngồi DƯỚC:.:.‹::-:::-c:-cecccciotiiietioegiisiiietiiaSii0S1502120615668103555585586 H

1.5.2 Các nghiên cứu trong NUGEC - uc nh HH nh ng HH ng re 12

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 s22S22222222232222322E2zcErzerred 13

2.1 THOI GIAN VA DIA DIEM NGHIÊN CUU o.oo ccccccecsseesseesssecsssesssesssncenscenneeeenseens 13

DAD, Thôi,gianiiEHIÊN(CŨNtsinnsstnsiniiantos0iins0ii100501021010101021036101301388113581833334633236853883319338858 13

2.1.2 Dia điểm nghiên COW o.oo eco ces ecseeseeceesessesseescssecsessenessecseseesseesesseeeceseteeeaeeneesees 13

2.1.3 Vật liệu nghiên cứu các Hee Si8885155353158511861588555451388 13

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2-22©222©2E2+2£2EEE2EEEEEEEEeecvvrecvrrrrrer 15

2.2.1 Phương pháp thu mau vi tảo c.ccccceccsscsssssessessesseevsnrssveaveeseaseaveevsnrsareaneensavaavess l6

2.2.2 Phương pháp phân lập làm thuần và giữ giống tảo -2-2555¿ 17

2.2.3 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái .-5-2525222sc2zcczssrczcrrcsrres 19

2.2.4 Phuong pháp tách chiết DNA tông số bằng bộ Kit cc.cccccccecccesssseecssecsssessneennes 19

2.2.5 Phương pháp điện: AD sicsiiscisccsssssscassssassassssscsasssoasssoaseaszseassastsacssassaesaseassenatsaassnsiees 20

2.2.6 Phương pháp khuếch đại trình tự vùng 18S bang kỹ thuật PCR 21

2.2.7 Phuong pháp giải trình tự sản phẩm PCR 222222 2222EzcEEzcvxecvvzczxvcc 22

2.2.8 Phương pháp xác định tên loài của các trình tự DNA bằng BLAST cicccooacoiac:c 23

2.2.9 Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loài - -5SẶ << << 24

Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 222-2222 222222112221122112 21122122222 xe 26

3.1 KẾT QUA THU THẬP VÀ XỬ LÝ MẪU ccoooooooie 263.2 KET QUA PHAN LAP CHUNG VI TẢO -.2- 222 ©22222222222ztrzsrrzxrrcrree 27

3.3 KET QUA ĐỊNH DANH HÌNH THÁI VI TẢO - 55sccccccsssees 29

3.3.1 Định danh hình thái mẫu vi tảo A1 A3, EI á- 5c St sec sec 30

5.3.2, Định đanhihình thái tiểu Vi Là AD x asssssssasssnsssoassassssssscsieacsveavesavvesasvasssossevsisosieee 31

3.3.3 Định danh hình thái mẫu vi tảo B1, D2 cesssesosessscesscsesnsseneesscssscseenesees 31

3.3.4 Định danh hình thái mẫu vi tảo B3 - 1S 2n 211 2 11 1g ng g2 xxec 32

3.3.5 Định danh hình thái mẫu vi tảo D1 - - ĂtSsh SE SH ch nH gyprec 33

3.3.6 Định danh hình thái mẫu vi tảo E2 S221 21111 1112122112181 xe 33

3.4 KET QUA TÁCH CHIET DNA TONG SỐ 22 SG 31t 2 3 E1 2111211251121 7122124 34 3.5 KET QUA KHUECH ĐẠI CAC VUNG TRÌNH TỰ (PCR) -52 35 3.6 KET QUA GIẢI TRÌNH TỰ VÀ HIỆU CHINH TRÌNH TỰ 2 S2 s2 52 36

3.6.1 Kết quả giải trình tựự - 2< 2<©225222+2ECS2E22EEE2EEZAE2E1122117 111 2221ecE2ecrrrcrree 363.6.2 Hiệu chỉnh và lắp ráp trình tự ¿5:22 22122112 1122110211021111310111212 21212, 37

3.7 KET QUÁ ĐỊNH DANH LOAI CUA CAC TRÌNH TU DNA BANG BLAST 38

3.7.1 Kết quả so sánh trình tự vùng 18S của mẫu vi tảo Al, A3, El với cơ sở đữ liệu

DANH MUC CAC CHU VIET TAT

KÍ HIEU

, ; CHU VIET DAY DU

CHU VIET TAT

Culture Collection of Algae and Protozo Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

National Center for Biotechnology Information Polymerase Chain Reaction

Ribonucleic acid Ribosomal ribonucleic acid Tris HCl — Borate - EDTA buffer Culture Collection of Algae at UT-Austin

DANH MỤC CAC BANG

Bảng 2.1 Thành phần môi trường BG-]N ccocccooooneeenninnenesessne 13

Bang 2.2 Hóa chất chạy điện di 2222 ©222S222SE222EEZE2221E2322242231222227222crvec 14

Bang 2.3 Hóa chat diing trong phan ứng PCR 2 S5 S0 S2 1211211721225 0226122 l4

Bảng 2.4 Các thiết bị trong nghiên cứu 2++2©zzt+v+teCE+EeEErzerrrxeerrrree 14 Bang 2.5 Thanh phan bộ kit dùng tách chiết DNA 0 ccccsccccsseesssesssesssvcenveeereeeeseeees 19

Bang 2.6 Cặp môi sử dung dé khuếch dai phan ứng PCR .22- 5555-5552 21

Bang 2.7 Thành phan phan ứng PCR c.ccccc0cc0.csoecsssessseesvessvesssesssessesseesseeseeeseeees 22

Bảng 3.1 Tọa độ và hình ảnh nơi thu IẫU 5-2291 11 1E SE ngư ngưng 1xx 26

Bảng 3.2 Tóm tắt tình trạng giải trình tự của các mẫu nghiên cứu 36

Bảng 3.3 Bang tóm tắt kết quả giải trình tự -©2+22zecSzcc22zcZxEcrxecrrerrree 37

Bang 3.4 Bảng tóm tắt mức độ tương đồng và bao phủ của trình tự DNA vùng 18S

của các mau nghiên cứu với trình tự tương ứng trên NCBI - - -5c55+52 Ad

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Trình tự vùng 18S rDNA HH Hàn KH ti, 10 Hình.2:1.:Quy trình nghiỆn CỨN:::::::::::::::2:ii22202212220122112211142112315231131363556335535859358233585 16

Hình 2.2 Vị trí giả thuyết về phạm vi thu mẫu s22 S0 c2 1211217212250 17

Hinh 2.3 Cay vi tảo trên mặt thạch dé thu khuân lạc - 2 22s 2+2E£EEzxc=zcczz 18

Hình 2.4 Cau trúc cây phát sinh chủng lai - c ccscsseesseessscsssesssesssessvesseesseesseeeseees 24

Hình 3.1 Các địa điểm thu mẫu tại Cần Giờ L ee.ee 26

Hình 3.2 Nuôi cay chuyên vi tảo -22- 2222222223222 11213211 2122222122111211 2e -xrree 28

Hình 3.3 Mẫu vi tảo có hình thái đồng nhất và không đồng nhất - 28

Hình 3.4 Hình chụp khuân lạc tảo thu được - 2-2 Ss+EESEvSEEESvEE2E 2222x<1xcx 29 Hình 3.5 Khuan lạc tảo không bị nhiễm khuẩn ở vật kính 4x và 10x 29

Hình 3.6 Hình thai vi tảo Al, A3 El và hình thái vi tảo Mychonastes sp 30

Hình 3.7 Hình thái vi tảo A2 và hình thái vi tảo Messastriam SỤ à àc.cc<ecS- 31 Hình 3.8 Hình thai vi tảo B1, D2 và hình thai vi tảo Monoraphiditam Sp 31

Hình 3.9 Hình thai vi tảo B3 và hình thái vi tao Golenkinia sp eects 32 Hình 3.10 Hình thái vi táo DỊ và hình thai vi tảo Scenedesmus SD ăc coi 33 Hình 3.11 Hình thái vi tảo E2 và hình thái vi tảo Macrochloris Sp 34

Hình 3.12 Hình chụp kết qua điện di DNA tổng số của 9 chủng vi tảo 35

Hình 3.13 Hình chụp kết quả điện di sản phầm PCR 18S của 9 chủng vi tảo 35

Hình 3.14 Biểu đồ huỳnh quang đoạn trình tự vùng 18S rDNA của chủng A1 36

Hình 3.15 Đại điện một đoạn trình tự đồng nhất (consensus sequence) vùng 18S PON ACU a chúng AÍlG::::::¡:ssssiciiiiieiitiiiisiiiiit12111112111113511333825153561631852550359535353552353835 37 Hình 3.16 Kết qua so sánh trình tự mẫu vi táo Al, A3, El vùng 18S trên GenBank 38

Hình 3.17 Cây phát sinh chủng loài mẫu vi tảo AI, A3, E] 5-:55-555: 38

Hình 3.18 Kết quả so sánh trình tự mau vi tao A2 vùng 18S trên GenBank 39

Hình 3.19 Cây phát sinh chủng loài mẫu vi tảo A2 óc cv ccvcsirrrrrssrree 39

Hình 3.20 Kết quả so sánh trình tự mẫu vi tao B1, D2 vùng 18S trên GenBank 40

Hình 3.21 Cây phat sinh chủng loài mẫu vi tảo B1, D2 2-5225525scc5cccsc 40

Hình 3.22 Kết quả so sánh trình tự mẫu vi táo B3 vùng 18S trên GenBank 41

Hình 3.23 Cây phát sinh chủng loài mẫu vi tảo B3 -.222- 222ssccscrxecrzc- 41

Hình 3.24 Kết qua so sánh trình tự mẫu vi tảo DI vùng 18S trên GenBank 42

Hình 3.25 Cây phát sinh chủng loài mẫu vi tảo DI 555 22vv2cxvcxxcrrvee 42 Hình 3.26 Kết quả so sánh trình tự mẫu vi tảo E2 vùng 18S trên GenBank 43 Hình 3.27 Cây phát sinh chủng loài mẫu vi tảo E2 - -¿- 2-55 ©cec sec rxcxrez 43

Hình 3.28 Cây phát sinh chủng loài mô tả vị trí phân bố của 9 chủng vi tảo được

xây dựng từ vùng trình tự 18S rDNA cung nh ka 45

MỞ DAU

I TÍNH CAP THIET CUA DE TÀI

Khu Dự trữ Sinh quyền Rừng ngập mặn Cần Giờ là một quan xã gồm các loại

động, thực vật rừng trên cạn và thủy sinh được hình thành trên vùng châu thô rộng

lớn của các cửa sông Đông Nai, Sài Gòn và Vàm Cỏ Đông - Vàm Có Tây Do có vịtrí địa lý đặc biệt với phía Bắc giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp với biển Đông,phía Tây giáp tinh Tiền Giang va Long An, phía Đông giáp tinh Bà Rịa - Vũng Taunên hằng năm rừng ngập mặn Cần Giờ nhận một lượng lớn phù sa từ các dòngsông, các đợt thủy triều Điều đó đã góp phan làm cho hệ động, thực vật và vi sinhvật nơi đây khá phong phú Theo thống kê của Ban quản lý rừng ngập mặn Cần

Giờ, khu Dự trữ Sinh quyền Rừng ngập mặn có khoảng 642 loài động vật gồm côn

trùng, cá, lưỡng cư, bỏ sát, chim, thú và 318 loải thực vật bậc cao như cây ngập

mặn, cây du nhập [1] Bên cạnh đó, các loài sinh vật phù du ở nơi đây cũng rất đa

dang với hon 60 loai thực vật nôi (phytoplankton) thuộc ngành tao lam, tao silic và

tảo giáp [2].

Hệ thông nước tạo ra môi trường sống tự nhiên thuận lợi cho các loài thủysinh trong đó có vi tảo thích nghỉ va phát triển, tạo ra sự đa dạng vẻ thành phần loải

Các loài vi tảo có thê xử lí nước thải đô thị, công nghiệp, nông nghiệp, chăn nuôi và

làm chất bỗ sung dinh dưỡng trong nuôi trồng thủy sản [3] Một lợi ích khác của vitảo nằm ở việc sản xuất nhiên liệu tái tạo như diesel sinh học thông qua việc hap thuCO; thai ra trong quá trình đốt cháy các nhiên liệu sinh học

Đặc biệt, ở một số đại điện vi tảo lục còn có khả năng hấp thụ kim loại nặng

và loại bỏ chất hừu cơ có trong nước thải [4] Nhiều loài tảo lục có thé tạo ra các

chất chuyền hóa có giá trị cho các mục dich sử dụng khác nhau như chất chống oxy

hóa, carotenoid, acid béo không bão hòa, vitamin, thuốc chong ung thư và kháng virus Bên cạnh đó, chúng khá nhạy cảm với các thay đôi của điều kiện môi trường nên nhiều loài tảo lục còn được dùng làm sinh vật chỉ thị mức dinh dưỡng của

thủy vực [Š].

Trước sự đa dạng sinh học cũng như tiém năng có giá trị khai thác nơi đây, khu Dự trữ Sinh quyên Rừng ngập mặn Cần Giờ không chi trở thành nơi nghiên cứu của các nhà khoa học mà còn là địa điểm du lịch sinh thái mang lại nguồn kinh

tế cao cho đất nước Tuy nhiên, việc tập trung quy hoạch đất, day mạnh phát triển

các công trình phục vụ du lịch chưa hợp lý cùng với lượng nước thải độc hại từ các

khu công nghiệp Đồng Nai, Sài Gòn đô về ngày càng nhiều đã và đang đe dọa đến

hệ sinh thái Rừng ngập mặn Cần Giờ đặc biệt là các loài có tiềm năng ứng dụng

cao nhưng lại rất nhạy cảm với những thay đổi nhỏ của môi trường như vi tảo lục.

Mặc dù vi tảo lục mang đến nhiều giá trị cao và đứng trước nhiều nguy cơ de đọa nhưng hiện vẫn chưa có nhiều nghiên cứu vé định danh vi tảo lục nói chung và

vi tảo lục tại Can Giờ nói riêng Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Dinh danh

và xác định quan hệ phát sinh chúng loại của một số loài vi tảo lục ở Can Giờ dựa trên trình tự rDNA 188” được thực hiện nhằm góp phần bỗ sung thêm bộ cơ

sở dữ liệu về sự đa dạng thành phan loài, dam bao kha năng tai tao và độ chính xác

làm thông tin cơ sở cho nhiều ngành sinh học khác, làm cơ sở khoa học cho các

nghiên cứu tiếp theo về định hướng phát triển, tiềm năng ứng dụng và bảo tồn cácloài vi tảo lục cũng như góp phần vào định hướng chung là bảo tồn và phát triển bên

vững khu Dự trữ Sinh quyền Rừng ngập mặn Cần Giờ.

II MỤC DICH NGHIÊN CỨU

Phân lập và định danh được một số chung vi tảo lục thu được ở khu Dự trừ

Sinh quyền Rừng ngập mặn Cần Giờ dựa vào trình tự 18S rDNA

II DOI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Các chủng vi tảo lục (Chlorophyta) sông ở môi trường nước ngọt thu được ở

khu Dự trữ Sinh quyền Rừng ngập mặn Cần Giờ

IV NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU

- Thu mẫu vi tảo lục tại khu Dự trữ Sinh quyền Rừng ngập mặn Cần Giờ

- Phân lập vi tảo tạo tế bào đơn dòng.

- Định danh hình thai các chủng vi tảo lục.

- Tách chiết DNA, điện di, PCR và giải trình tự vùng rDNA 18S của các

chúng vi tảo lục.

- Định danh phân tử dựa trên trình tự rDNA 18S.

V PHAM VI NGHIÊN CỨU

Đề tài chi tiễn hành phân lập, nuôi tang sinh, định danh hình thai, định danh phân tử vùng rDNA 18S các chủng vi tảo lục thu được tại khu Dự trừ Sinh quyền

Rừng ngập mặn Cần Giờ vào tháng 9/2022

Chương 1 TONG QUAN

1.1 TONG QUAN KHU DỰ TRU SINH QUYEN RUNG NGAP MAN CAN GIO

Cần Giờ là một huyện ngoại thành nằm ở hướng Đông Nam của Thanh phố

Hỗ Chí Minh, có tọa độ: 10°22° — 10°40° vĩ độ Bắc và 106°46' — 107°01' kinh độ

Đông Cần Giờ có vị trí chiến lược tiếp giáp Thành phố Hồ Chí Minh và 4 tỉnh

(Đồng Nai, Bà Rịa-Vũng Tàu, Tiền Giang và Long An) Khu Dự trừ Sinh quyềnRừng ngập mặn Cần Giờ nằm trọn trong địa giới hành chính huyện Cần Giờ, còn có

tên gọi khác là rừng Sác Địa hình được hình thành do phù sa bồi đắp từ cửa sông của 6 con sông là Ngã Bay, Cái Mép, Gò Gia, Thị Vai, Soài Rạp và Đồng Tranh Tông diện tích khu Dự trữ Sinh quyên Rừng ngập mặn Cần Giờ là 75.740 ha, trong

đó: vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha và vùng chuyền tiếp 29.880 ha [6]

Giai đoạn chiến tranh Đông Dương lần thứ 2 (1965 — 1969) rừng ngập mặn ở

Can Giờ gan như bị phá hủy hoàn toàn bởi thuốc diệt cỏ và các chất độc hóa họckhác như dioxin Trong số các huyện ven biên của Đồng bằng sông Cửu Long, CầnGiờ và Cà Mau là bị ảnh hưởng mạnh nhất với phần trăm thiệt hại ước tính khoảng

57% Một thập ki sau chiến tranh, cảnh quan Cần Giờ vẫn bị suy thoái nghiêm

trọng, khoảng 10.000 ha đất bị can cỗi 4.500 ha bị xâm chiếm bởi loài cọ và đương

xi, chỉ có 5.600 ha có thé canh tác [6] Bên cạnh đó, việc người dan chặt cây lấy củi

và xây nhà đã làm cho cảnh quan Cần Giờ dân suy thoái trầm trọng hơn.

Năm 1978, Cần Giờ chính thức được quan lý bởi Thành phố Hồ Chi Minh và đôi tên thành Duyên hai - Cần Giờ Kê từ đó, chi cục Lâm nghiệp Thanh phố Hỗ Chí Minh đã xây dựng chương trình trong 20.000 ha Dude và Cần Giờ được xem

như rừng kinh tế chuyên sản xuất gỗ Năm 1991, Rừng ngập mặn Cần Giờ đượccông nhận là rừng phòng hộ ven biển sau những nỗ lực trồng rừng mang lại sự cảithiện đáng kế về sinh thái và môi trường nơi đây

Hon 20 năm hình thành và phát triển, khu Dự trữ Sinh quyền Rừng ngập mặn

Can Giờ từ lâu đã được xem như là “lá phổi xanh" của Thành phố với chức năng

lọc sạch không khí và nước thải từ các khu đô thị, công nghiệp Ngày 21/01/2000,

UNESCO công nhận đây là khu Dự trữ Sinh quyền Thẻ giới và là khu dự trữ sinh

quyên đầu tiên ở Việt Nam với hệ thông động, thực vật đa dạng, độc đáo, điện hình

[6].

Theo kết quả tang hợp của Viện Sinh thái học Miễn nam, khu hệ thực vật rừng

ngập mặn Cần Giờ ghi nhận 296 loài thực vật ngập mặn và đây cũng là nơi sinh

sống của nhiều động, thực vật quý hiểm thuộc danh mục sách đỏ Việt Nam Hệ thực

vật tại rừng ngập mặn Cần Giờ có 31§ loài thực vật bậc cao, trong đó có 37 loài cây

ngập mặn:, 56 loài thuộc nhóm cây tham gia rừng ngập mặn và 225 loài thuộc nhóm cây du nhập Hệ động vật: côn trùng: 89 loài, cá: 282 loài, lưỡng cư: 36 loài bò sát:

36 loài, chim: 164 loài, thú: 35 loài, phiêu sinh vật: 66 loài động vat noi, 66 loài thực vật nôi [1].

1.2 TONG QUAN VE VITẢO

Vi tao là các sinh vat đơn bào, nhân thực, có kích thước cực nhỏ từ vai

micromet (um) đến vai tram micromet, nhỏ hơn 10* lần so với tảo vi mô (~ lm) nên

chi quan sát được dưới kính biển vi quang học [7] Không giống như thực vật bậc

cao, vi tảo không có rễ, thân va lá, chúng thường được tìm thay trong các hệ thông

nước ngọt vả biển Vi tảo có thé có thé tồn tại riêng lẻ, hoặc thành chuỗi hoặc

nhóm.

Vi tảo có khả nang quang hợp chúng có thé sử dụng năng lượng Mat trời dé

chuyển hóa CO; vô cơ thành một loạt các hợp chất hoạt động sinh học có giá trị,bao gồm axit béo, sắc tố, vitamin, protein và enzyme Bên cạnh đó, một số vi tảo

còn có khả năng tạo ra sinh khối làm tiền chất cho nhiên liệu sinh học, chất dinh

dưỡng, phân bón sinh học và các hóa chất tốt bao gồm hydrocarbon [8]

1.2.1 Giới thiệu về vi tảo luc

Theo Chapman (2013), khoảng 90% tảo lục được tìm thấy trong môi trườngsống nước ngọt với ước tính khoảng 6.000 - 8.000 loài [9] Phần lớn tảo lục sống

trong nước ngọt, một số sống ở vùng nước mặn như Tetraselmis sp và số ít khác

sống trên vách đá, đất 4m Tảo lục có nhiều hình thái khác nhau, có loại dạng sợi

có loại dang cầu có loại dang lưỡi liềm, dang ống Vách tế bào của chúng thường

cau tạo từ cellulose, pectin Sắc lap (chromoplast) có nhiều dạng như hình phiến,

hình lưới, hình trụ, hình cốc, hình sao [10] Trong sắc lạp chứa nhiều pyrenoid có

chức năng tông hợp chat dự trữ là tinh bột Vi tảo lục là sinh vật nhân chuẩn chứa

plastids có màng kép bao quanh cả hai chất diệp lục a và b và các sắc tô phụ bao

gồm beta carotene và xanthophyll Ti lệ các sắc tổ gan bằng thực vật bậc cao, trong

đó diệp lục a và b chiếm ưu thé hơn các sắc tổ khác nên hau hết chúng luôn có màu

lục [11].

Tảo lục có nhiều hình thức sinh sản: sinh sản sinh dưỡng, sinh sản vô tính và

sinh sản hữu tính Bên cạnh đó, vi tảo lục còn có khả năng quang hợp và tông hợp

các chất hữu cơ thiết yếu như carotenoid, lipid, chất chong oxy hóa dé duy trì sự

sông trên Trái Dat [12].

1.2.2 Phân loại

Năm 1969 R.H Whitaker đưa ra hệ thống phân loại 5 giới trong đó toàn bộ

tảo được xếp trong giới nguyên sinh Năm 2002, sau khi P.H.Raven và G.B.Johnson

chia lĩnh giới sinh vật nhân thực ra thành 6 giới các ngảnh tảo đã có sự phân hóa,

trong đó tảo lục được xếp vào giới Plantae (Thực vật), cụ the:

- Giới Archezoa: gồm các nguyên sinh chưa có ty thé: Pelomyxa, Giardia

- Giới Protozoa: gồm 14 ngành nguyên sinh: trong đó có Hypermastigotes, Euglenoides, Slime molds (Nam nhay), Dinoflagellates, Ciliates, Apicomplexans,

Rhizopods, Choanoflagellates, Radiolarians, Heliozoans va Foraminiferans.

- Giới Chromista: gồm 10 ngành nguyên sinh, trong đó có Tao nau

(Phaeophyta) và Tảo silic (Diatoms).

- Giới Fungi (Nam): gồm nấm va I ngành nguyên sinh sống hoại sinh là

Chytridiomycota.

- Giới Plantae (Thực vat): bao gom thuc vat va 5 nganh nguyén sinh (nhiều

Tảo lục như Volvex, Ulva, Spirogyra) và Tao đò (Rhodophyta).

- Giới Animalia (Động vật).

Trong ngành tảo lục (Chlorophyta), các vi tảo lục thường thuộc về 2 bộ là

Volvocales và Chlorococales với các chi chủ yếu sau: Chlorella, Closterium,

Staurastrum, Dunaliella, © Chlamydomonas, Haematlococcus, — Tetraselmis, Dyctyosphaerium, Scenedesmus, Pediastrum,, [10].

1.3 VAI TRÒ VA UNG DUNG CUA VI TAO LUC

1.3.1 Vai trò của vi tao lục trong hệ sinh thái và môi trường

Nước thải công nghiệp tir khai thác mỏ nông nghiệp, sản xuất pin thường bị

ô nhiễm kim loại nặng rất cao và là mối đe dọa nghiêm trọng đến môi trường và sức

khỏe con người Hiện nay, vi tảo được xem là giải pháp tiềm năng cho các van dé

về sinh thái và môi trường vì chúng có thể loại bỏ các chất ô nhiễm thông qua quá trình hap thụ sinh học [4] Đồng thời, do có tốc độ tăng trưởng cao và yêu cau nuôi giữ đơn giản, các chủng vi tảo lục luôn được xem là sinh vật tiềm năng trong các nghiên cứu xử lý sinh học đẻ giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

Vi tảo lục có khả nang loại bỏ nhiều loại chat ô nhiễm như nitrogen,

phosphorus, thuốc trừ sâu, thuốc nhuộm, kim loại nặng và thuốc có nguồn gốc từ

các ngành công nghiệp khác nhau, bao gồm nước thải sinh hoạt, nước thải nông

nghiệp và dược phẩm [13] Kĩ thuật loại bỏ kim loại nặng bằng vi tảo lục mang nhiều lợi thé hon so với các kĩ thuật truyền thong vì đơn gián, chi phí thấp, thân thiện với môi trường va có thê được thực hiện trong một loạt các điều kiện thử

nghiệm, Chlorella vulgaris, Scenedesmus sp va Nannochloropsis sp là các vi tảo

lục điền hình thường xuyên được lựa chọn cho một số quy trình xử lí sinh học [4] Bên cạnh đó, vi tảo lục có tầm quan trọng hàng dau đối với các hệ sinh thái đưới nước trên toàn cầu, vì chúng là nguồn thức ăn chính cho nhiều loài sinh vat.

1.3.2 Ung dung của vi tảo luc làm dược phẩm và chế phẩm sinh học

Từ lâu, vi tảo lục là đối tượng nhận được nhiều sự quan tâm từ các ngành công nghiệp thực pham, duoc pham va nhiên liệu sinh hoc do đặc tính da dang từ các thành phần nội bào của chúng như polymer, vitamin, peptide, carotenoid, sterol và

các loại xanthophyll khác nhau như astaxanthin, lutein, zeaxanthin { I4].

Vi tao có thé tông hợp nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao như chat

chống oxy hỏa, chống độc tó Các chủng vi tảo lục có kha năng tích lũy -carotene,

astaxanthin có hoạt tính kháng viêm và chống ung thư Các sản phẩm kháng khuẩn

đầu tiên được nghiên cứu trên chlorellin, một hợp chất được chiết xuất từ vi tảo lục

Chlorella có tác dụng ức chế đáng kê sự phát triển của vi khuẩn Gram đương va

Gram âm [15] Một số hợp chất khác như Eicosapentaenoic acid (EPA),

Docosahexaenoic acid (DHA) ở Tetraselmis sp có hoạt tinh kháng viêm, ngăn ngừa

các tinh trạng về viêm da hoặc các bệnh liên quan đến tim mạch và hệ thần kinh

[16].

Bên cạnh đó, các thành phan astaxanthin, J-carotene va lutein trong tao có thé dùng chiết xuất mỹ phẩm, có tác dụng chống tăng sắc tô hoặc tôn thương do tia UV gây ra Polysaccharide từ các loài vi tảo lục khác nhau có thé được ding sản xuất

mỹ phẩm nhằm mục đích chống oxy hóa, tạo gel hoặc làm đặc (17].Tương tự,carotenoid từ vi tảo lục con được dùng điều trị các bệnh về stress oxy hóa va các

biến chứng liên quan như tiêu đường, lão hóa, ung thư, béo phì và đột quy [14].

Ngoài ra, ham lượng lipid va carbohydrate có trong vi tảo lục còn có khả năng

chuyên đổi thành nhiên liệu sinh học như dầu diesel sinh học, cồn sinh học và

biomethane.

1.3.3 Ứng dung của vi tao luc trong nông nghiệp

Thực vật cần nitrogene dé phát triển, việc thiếu hụt chất dinh đưỡng này có

thê được khắc phục bằng cách bón phân hóa học Tuy nhiên, việc sử dụng quá nhiều

và lâu dai phân bón hóa học hoặc phân bón tông hợp sẽ dẫn đến 6 nhiễm và mat cân

bằng hệ sinh thái Chính vì thế, trong những năm gan day, phân bón sinh học nồi

lên như một thành phần quan trọng dé có định đạm sinh học.

Phân bón sinh học là những vi sinh vat sông giúp cải thiện các khía cạnh hóa

học va sinh hoc của đất, phục hôi độ phì nhiêu của đất và hỗ trợ sự phát trién củacây trồng [18] Sinh khối tảo là một lựa chon khả thi để cung cấp các chất dinhdưỡng hỗ trợ nông nghiệp ở các vùng đất nghèo dinh dưỡng Chlorella vulgaris vàSpirulina platensis là hai loài vi tao lục được ứng dụng làm phân bón sinh học để

nâng cao năng suất lúa Ngoài ra phân bón sinh học từ vi tảo còn góp phan tăng trọng lượng của chéi và rễ, mật độ rễ, chiều dai và đường kính, chiều cao cây, số lá trên cây, trọng lượng cây, diện tích lá trên cây và năng suất hạt [3] Theo Chittora

và cộng sự (2020), phân bón kết hợp giữa vi tao lục và vi khuẩn lam cũng cho thấy

những kết quả đáng khích lệ, có tác dụng tăng cường hoạt động của vi sinh vật và

carbon hữu cơ trong đất [19]

1.4 CÁC MAKER PHÂN TỬ TRONG ĐỊNH DANH VI TẢO

1.4.1 Mã vạch DNA (DNA barcoding)

Việc định danh vi tao lục là một công việc khó khăn va doi hỏi sự kiêm tra cân

thận trên kính hiển vi Không những thé, sự đa dạng kiểu hình ở một số loài có thé cản trở việc kết luận đựa trên chan đoán hình thái Mã vạch DNA là một phương pháp được sử dụng dé xác định loài xác định các mẫu vật dựa trên sự tương đồng

về trình tự DNA so với cơ sở đữ liệu trình tự của các loài được xác định trước Theo

Herbert (2003), việc sử dụng mã vạch DNA dé khám phá sự phức tạp của các cấp

độ phân loại và định danh các loài khó quan sát hình thái, cầu trúc được đánh giá là

rat hữu ích [20] Ngoài ra, mã vạch DNA có thê làm cho việc xác định mẫu vật ở

cấp độ loài nhanh hơn, đáng tin cậy hơn và những người không chuyên có thê tiếpcận được [21] Mã vạch DNA có thé cung cấp phương tiện để xác định vi tảo lục

một cách nhất quán và nhanh chóng, bat kê giai đoạn sông nào [22] Mã vạch DNA

có thé được lấy từ nhân, ty thé và lục lap Các mã vạch DNA được sử dụng phôbiến nhất là 18S rDNA, 5.8S 28S rDNA va ITS

1.4.2 Trình tự rDNA 18S

Gene rDNA là hệ thống đa gene mã hóa phần RNA của ribosome Các gene

DNA ribosome (rDNA) mang trình tự vừa có tính đặc hiệu vừa có tính đa dạng

thích hợp dé phân biệt các loài gần gũi Sinh vật nhân chuẩn có ribosome 80S bao

gồm một tiêu đơn vị lớn (60S) và một tiêu đơn vị nhỏ (40S) Tiểu don vị 60S bao

gồm rRNA 5S, rRNA 5,88, rRNA 28S và khoảng 49 protein Tiêu đơn vi 40S bao

gồm một rRNA 18S và khoảng 33 protein [23] 18S rRNA là trung tâm chính của

quá trình tông hợp protein trong tiểu đơn vị nhỏ 40S của ribosome (SSU) Đây là

một trong những gene được sử dụng thường xuyên nhất trong các nghiên cứu phát

sinh loài và là dau hiệu quan trọng cho phản ứng PCR trong sàng lọc đa dang sinh

học môi trường [24].

Dữ liệu 18S là một công cụ ước tính chi tiết về sự đa dạng, đặc biệt la dé sosánh các loài trong một chi Hầu hết trong các nghiên cứu định danh vi tảo, trình tự

rDNA 18S luôn là lựa chon đầu tiên vi tập dữ liệu tảo cho gene này rất lớn [25].

Việc xác định và phân loại các sinh vật dựa trên các vùng được bảo tôn và biến đổi

của rDNA 16S hoặc 18S là một quy trình phô biến trong các nghiên cứu phân loại học [26] Vi rDNA 18S là đoạn gene vừa được bảo tồn tốt giữa các loài trong quá

trình tiến hóa vừa chứa các vùng biến đổi Các vùng được bảo tồn thể hiện mối

quan hệ họ hàng giữa các loài, trong khi các vùng biến đôi phản ánh sự khác biệt về

trình tự.

Nhằm mục đích xây dựng danh mục toàn cầu về sự đa dang vi sinh vật trên

Trái đắt, dự án Hệ vi sinh vật trên Trái đất (EMP) đã khuyến nghi sử dụng các đoạn

mỗi khuếch đại một đoạn ngắn (khoảng 150 bp) chứa vùng V9 của rDNA 18S cho

các phân tích liên quan đến eukaryote [27] Phân tích trình tự rDNA 18S cũng đã

được sử dung dé phân loại tao lục và tảo 7rebouxiophycean [28]

1.5 TINH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.5.1 Các nghiên cứu ngoài nước

Năm 2013, Flechtner và cộng sự đã dựa trên các phân tích phát sinh loài của

đữ liệu trình tự rDNA 18S, 24 dòng tảo lục riêng biệt đã được xác định, 17 dòng trong họ Chlorophyceae và 7 dòng ở họ Trebouxiophyceae [30] Đữ liệu trình tự từ

3’ cudi của gene rDNA 18S được sử dụng làm dau hiệu phát sinh loài trong nghiêncứu nảy vì đữ liệu trình tự ribosome là điểm xuất phát phô biến trong các nghiên

cứu phát sinh loải.

Năm 2016 Zulkarnain vả cộng sự đã phân lập vi tảo từ hồ Maninjau West

Sumatra (Indonesia) Sau đó các chung vi tảo được định danh hình thái va phân tử

bằng PCR sử dung đoạn mỗi 16S rDNA cho vi tao nhân sơ và 18S rDNA cho vi tảo nhân chuân Kết quả của nghiên cứu nay đã thu được 3 dòng vi tảo gồm: | dòng vi

tảo nhân thực là Scenedesmus (mã phân lập AUMA-020) với tỷ lệ phần tram tươngđông là 95%, 2 dòng vi tảo nhân sơ là Vi khuẩn lam (mã phân lập AUMA-023) với

tỷ lệ phan trăm tương đông là 80% và Limnothrix (mã phân lập AUMA-019) có tỷ

lệ phan trăm tương đồng là 98% dựa trên Ngân hang gene [31].

Trinh tự rDNA 18S còn được dùng phân tích thành phần phát sinh loài của một số loài Chforophyceae tại Vịnh Ba Tư, một quan thẻ phô biến, ít được xác định.

Kết quả nghiên cứu cũng cho thây định danh sinh vật dựa trên 18S rDNA là một

phương pháp phù hợp dé xác định các mẫu vật biển và cung cấp sự đa dạng sinh học tiềm ân trong một loạt các nhóm phân loại [32] Cùng năm đó, Zhang và cộng

sự đã khai thác các loài vi tảo bản địa có tiềm năng sản xuất đầu diesel sinh học,

101 mẫu tảo đã được phân lập từ một phân vùng nước ở tinh Hải Nam Tám mẫu

cay được chọn dựa trên sinh khối cao, hàm lượng lipid cao va dé nuôi cấy, sau đó

được xác định dựa trên hình thai học và định danh dựa trên cơ sở phan tích trình tự rDNA 18S [33].

1.5.2 Các nghiên cứu trong nước

Năm 2015, Trần Thị Xuân Mai và cộng sự đã phân lập và định danh vi tao djdưỡng Thraustochytrid từ các mẫu lá ban thu tại rừng ngập mặn của tinh Cà Mau

Trong nghiên cứu nảy tác gia đã xác định trình tự DNA của vi tao dựa trên một

đoạn DNA khoảng 530 bp được khuếch đại từ vùng gene18S rRNA Kết quả nghiên

cứu đã bổ sung một dong vi tảo vào chỉ Aurantiochytrium và được đặt tên là

Aurantiochytrium sp BCM05 [34].

Trần Yên Thảo (2016) đã phân lập được 27 chủng vi tảo dầu từ các nguồn

nước ngọt, nước lợ vả nước mặn tự nhiên Đồng thời tác giả đã sử dụng trình tựgene 18S rRNA đẻ định danh các chủng vi tảo Kết quả cho thấy các chủng trong bộgene thu thập được trong các nguồn nước tự nhiên rất khác nhau Trong 27 chủng vi

tao tác giả phân lập được thuộc 23 loài với 10 chi khác nhau [3Š].

Phạm Thị Bình Nguyên (2021) đã thực hiện phân lập và nhận diện ví tảo biển

thuộc chi Schizochytrium trong 240 mẫu lá Ban (Sonneratia caseolaris L.) và lá

Dude (Rhizophora apiculata B.) Bên cạnh việc nhận diện sơ bộ bằng hình thai, nghiên cứu nay còn sử dụng kỹ thuật sinh học phân từ PCR dé nhận điện những

dòng vi tảo bằng cặp môi được thiết kế cho trình tự gene mã hóa 18S rDNA củamột số loài thuộc chi Sclizochytriưm Kết quả nghiên cứu bước đầu nhận diện được

3 chung thuộc chi Schizochytrium và 1 chung thuộc chỉ Aurantiochytrium [36].

Trong năm 2021, Lưu Thị Tâm và cộng sự đã nghiên cứu đặc điểm sinh học

và nuôi đủ sinh khối tảo cho tách chiết các hợp chất có giá trị từ vi tảo lục

Nannochloris atomus, một đề tài rất mới ở Việt Nam Trong nghiên cứu này, dựa

trên đặc điềm hình thái và trình tự gene]8S rRNA, tên khoa học chính xác củachủng Nannochloris sp NT12 đã được định tên và thuộc về loài N atomus có độ

tương đồng đạt 99,7% so với loài N atomus CCAP251.7 (AB080303.1) có trên

ngân hàng gene [37].

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 THỜI GIAN VA DIA DIEM NGHIÊN CỨU

2.1.1 Thời gian nghiên cứu

Đề tải được tiền hành từ tháng 9/2022 - 4/2023, bao gồm thời gian: nghiên cứu

tài liệu thu mẫu, phân lập và định danh vi tảo trong Phòng thí nghiệm Sinh học

Trung tâm - Khoa Sinh học - Trường Dai học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh,xây dựng cơ sở dit liệu và viết đề tài

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm Sinh học Trung tâm - Khoa Sinh học - Trường Dại học Sư

phạm Thanh pho Hỗ Chí Minh

Viện nghiên cứu và ứng dụng chuyển giao công nghệ HUFI Địa chi: 18 An

Duong Vuong, phường 16, quận 8, Thành phố Hồ Chi Minh.

2.1.3 Vat liệu nghiên cứu

Bảng 2.2 Hóa chất chạy điện di

STT Tên hóa chất Hãng sản xuất CODE No

| Agarose M Bio Basic Inc 110830BB013

3 Ethidium Bromide Merck K GaA 1118850001

4 Loading buffer 6 X Merck K GaA 360 - 205

Bảng 2.4 Các thiết bị trong nghiên cứu

| a | Nồi hap vô trùng - ALP Nhật Bản

ˆ

| a | Bộ Pipette 10 ul, 20 pl, 200 ul, 1000 gì Bic

May PCR _ Mastercycler Personal oe

Lụ Bes Bê điện đi năm ngang vả nguôn điện di Amersham

Pharmacia Biotech.

Bộ máy chụp ảnh gel (UVP DigiDoc-It Imaging

m Systems) Singapore

2.2 PHUONG PHAP NGHIEN CUU

Phân lập nuôi tang sinh

Định danh hình thái

Tach DNA tông số

Kiểm tra DNA tông số bang điện di trên gel

agarose

Tìm các trình tự tương đồng trên Genebank

(NCBI)

Định danh phân tử dựa trên trình tự 18S rDNA

Hình 2.1 Quy trình nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp thu mẫu vỉ tảo

Vị trí của mỗi phạm vi lay mẫu có liên quan đến một điểm tham chiếu lâu bên, chăng hạn như thiết bị đo dòng chảy hoặc trụ cầu được sử dụng dé xác định vĩnh viễn vị trí của phạm vi lấy mẫu Phạm vi lấy mẫu được đặt ở nơi điều kiện môi

trường sông trong dòng chảy, ven sông đại điện cho khu vực địa phương và phù hợpvới các mục tiêu của đơn vị nghiên cứu Dé đáp ứng các mục tiêu nay, phạm vi lấy

mẫu có thể được đặt ở thượng nguồn, hạ lưu hoặc các địa điểm có vị trí liền kể nhau

sao cho đữ liệu hóa học và thủy văn của nước được thu thập tại địa điểm phản ánh chính xác các điều kiện trong phạm vi hoặc phạm vi lay mau [38].

Một địa điểm có định cơ bản với nhiều phạm vi tiếp cận mẫu được thẻ hiệntrong hình 2.2 Trong ví dụ nay, phạm vi lay mau "A" được đặt ở phía trên của vị trí

cô định cơ bản; phạm vi lay mẫu "B" được đặt tại vị trí có định cơ bản và phạm vilấy mẫu "C" được đặt ở hạ nguồn từ vị trí cổ định cơ bản [38]

Ngoài ra, nhà sinh vật học của đơn vị nghiên cứu có thê quyết định xác định vị

trí của ca ba lần lấy mẫu ở thượng nguồn hoặc hạ nguồn từ vị trí cố định cơ banmiễn là không có những thay đôi đáng kể về hóa học nước, thủy văn hoặc điều kiện

môi trường sông giữa các lan lay mẫu Nếu có thé, nhiều điểm lay mẫu được cách nhau tối thiêu là 150m [38].

Các mẫu nước được thu thập bằng cách đặt hoàn toàn các ống Falcon loại

50 mL (đã đánh số tọa độ) đưới mặt nước khoảng 0,2m Sau khi kiểm tra độ pH,mẫu nước được mang vẻ phòng thí nghiệm và đem lọc qua màng lọc có kích thước

50 am đề loại bỏ động vật phù du.

Hình 2.2 Vị trí giả thuyết về phạm vi thu mẫu [38]

2.2.2 Phương pháp phân lập, làm thuần và giữ giống tảo

Mau nước thu được sau khi đưa về phòng thí nghiệm được tiền hành phân lậpngay Phương pháp phân lập phỏ biến nhất hiện nay và có khả năng thực hiện trêntrang thiết bị hiện có là phương pháp hút tế bào đơn bang micropipette theo hướng

dẫn của Andersen và Kawachi [39].

Quy trình:

Bước 1: Chuan bị lame kính và các giọt nước cat vô trùng.

Bước 2: Dùng micropipette hút một tế bào từ mẫu, micropipette được cam

bằng một tay và tay kia cam một cái kẹp đê hỗ trợ đầu hút.

Bước 3: Lắng tế bảo không bị hư hại vào một giọt vô trùng, nhặt lại tế bào và

chuyên nó vảo giọt vô trùng thứ hai.

Bước 5: Kiểm tra giọt vô trùng có chứa tế bao đích bằng kính hiên vi và tế bảo

được chuyền vào bình cô lập cuối cùng

Mỗi một tế bào vi tảo sau khi tiền hành hút bang micropipette được chuyền

vào ông eppendorf 0,5 mL có chứa 50 wL môi trường BG-II Khi các ống

eppendorf xuất hiện màu xanh cho thay vi tảo có dấu hiệu tăng sinh, tiền hành quan

sát dưới kính hiển vi Leica ATC 2000 ở độ phóng đại 40x dé kiêm tra hình thái.

Trong trường hợp mẫu có hình thái đồng nhất sẽ được tiếp tục cấy chuyền lần lượt

sang ông eppendorf 1.5 mL và erlen 100 mL Nếu mẫu vi tảo có hình thái không

đồng nhất sẽ tiếp tục cấy ria trên thạch agar 1,5% dé thu khuẩn lạc vi tao, mỗi

khuân lạc có nguôn gôc từ một tê bào cô lập.

Sau 7-15 ngày nuôi cay thấy xuất hiện các khuan lạc tảo màu xanh có hình

dạng khác nhau trên bẻ mặt thạch Dùng que cay lấy mau từ các khuan lạc vả quan

sát trên kính hiển vi để kiểm tra độ thuần chủng Đĩa thạch được nuôi bằng nguồn sáng đèn huỳnh quang ở 50 nmol.m2.s!, chu kỳ sáng 12 sáng/12 tôi và ở nhiệt độ

trong các môi trường tự dưỡng khác nhau gồm: môi trường BBM, môi trường WC, môi trường C và môi trường BG-11 Kết quả nghiên cứu của Purkayastha đã chứng mình BG-11 là môi trường tốt nhất cho vi tảo lục tăng trưởng và sản xuất sinh khối

[40].

2.2.3 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái

Các chủng vi tảo được cấy ria trên đĩa môi trường đặc BGII, quan sát màu

sắc, đặc diém của khuân lạc Nuôi cấy các chủng trong môi trường lỏng, quan sat tếbào bằng kính hiển vi quang học Leica ATC 2000 ở độ phóng đại 40x và 100x và

định danh sơ bộ dựa trên các bộ sưu tập hoặc tài liệu đã được công bỏ.

2.2.4 Phương pháp tách chiết DNA tong số bằng bộ kit

Bộ kit được sản xuất bởi công ty Giải pháp Y sinh ABT nhăm mục đích táchchiết DNA mẫu mô thực vật, thành phan bộ kit được thé hiện ở Bang 2.1

Bang 2.5 Thành phần bộ kit dùng tách chiết DNA

Thành phan | Thể tích/Số lượng Nhiệt độ bảo quản

PLSI Buffer 25 mL Nhiệt độ phòng

Bước 2: Cho 0,5 gram mẫu vi tao vào tube 1,5 mL Nghiền mẫu bằng chàycho đến khi nát mẫu Bên cạnh đó, có thê sốc nhiệt tir 3 - 5 lần dé đạt hiệu suất thuDNA cao nhất

Bước 3: Thêm 400 pL PLS1 buffer vào tube 1,5 mL chứa mau ở trên Cho tiếp

10 L RNase A vào, vortex đều và ủ 65°C trong 60 phút va vortex thường xuyên

trong suốt quá trình ủ

Bước 4: Tiếp tục cho 130 pL PLS2 buffer vao, trộn đều va ủ 2-8°C trong 20

phút (tủ mát hoặc đá lạnh).

Bước 5: Li tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 5 phút Sau li tâm, hút 300 wL dich

noi chuyên sang tube 1,5 mL mới Thêm vào 450 uL PBB buffer (tương đương 1,5 lần thé tích địch nỗi) và vortex đều.

Bước 6: Chuyển hỗn hợp sang cột silica đặt sẵn trong tube 2 mL (téi đa 600

HE) Li tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 1 phút Sau li tâm, giữ lại cột và loại bỏ phanchất lỏng bên dưới Lặp lại thao tác này cho đến khi hết phần hỗn hợp đó

Bước 7: Đặt lai cột vào tube 2 mL cũ Thêm 500 ul PWB buffer và li tâm ở

tốc độ 13.000 rpm trong | phút, giữ lại cột vả loại bỏ phan chất lỏng bên dưới Lap

lại bước này 1 lần nữa.

Bước 8: Đặt lại cột vào tube 2 mL cũ Li tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong | phút

dé làm khô cột Sau đó chuyên cột sang tube 1,5 mL mới Thêm 50 pL EB buffer và

ủ một phút ở nhiệt độ phòng Li tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 1 phút, thu phan

địch chứa DNA bên dưới.

Bước 9: Sử dụng ngay sản phẩm DNA tách chiết đó hoặc bảo quản ở -20°C.

2.2.5 Phương pháp điện đi

Kết quả tách chiết DNA tổng số được kiểm tra độ tỉnh sạch bằng phương pháp

điện di trên gel agarose 0.8%.

Quy trình:

Bước 1: Chuan bị gel agarose 0,4g/50mL TBE 1X và đun sôi.

Bước 2: Dé nguội 50-60°C, bộ sung 4wL Ethidium Bromide đạt nồng độ cuối

là Iug/mL, đỗ vào khuôn gel đã chuẩn bị sẵn.

Bước 3: Khi gel đã đông cứng thi chuyển khay chứa ban gel vào bẻ điện di và

cho đệm chạy TBE 0.5X vào buông điện đi sao cho đệm ngập bản gel khoảng 0.5 đến lem, giếng lược bản gel quay ve phía cực âm.

Bước 4: Tra mẫu: Sản pham DNA tông số hay sản phẩm PCR được trộn với LụL loading buffer và tra vào các giếng trên gel.

Bước 5: Chạy điện di từ 30-60 phút ở điện thế 120V

Bước 6: Ban gel được quan sát trên ban ánh sáng UV và chụp hình dé lưu trữ 2.2.6 Phương pháp khuếch đại trình tự vùng 18S bằng kỹ thuật PCR

Phương pháp khuếch đại phản ứng PCR từ DNA tông số với các cặp môi xuôi

và môi ngược có trình tự sau:

Bang 2.6 Cặp mdi sử dung để khuếch đại phản ứng PCR

Tên Cặp mồi Vì Tham

moi ùn

marker ý v khao

18S —-RB2 5° -GATCCTTCTGCAGGTTCACCTACG-3°

Quy trinh:

Bước 1: Chuan bị tat cả các thành phan PCR, gồm: cặp môi cần sử dung va

các dụng cụ thực hiện như eppendorf PCR, micropipet,

Bước 2: Dựa vào phân điện đi DNA tông số thiết lập thẻ tích DNA khuôn, mỗixuôi, môi ngược và nước cất Đảm bảo tong thẻ tích vẫn là 25 wL

Bước 3: Tron đều hỗn hợp đã chuẩn bị và thực hiện li tâmBước 4: Thiết lập máy PCR theo chu trình nhiệt tương ứng với từng cặp môi,bắt dau quá trình chạy PCR

Bước 5: Sau PCR, sản phâm sé đem đi điện di sử dụng thêm | Ladder nhằm

kiểm tra kích thước sản phẩm có đúng với chiều dai dự kiến khoảng 1200 base pair

(bp) hay không.