Khóa luận tốt nghiệp Sư phạm khoa học tự nhiên: Định danh và tạo bộ tiêu bản hiển vi một số loài vi tảo lục ở khu vực phía Nam

được tiễn hành nhưng chi tập trung ở một khu vực nhỏ hoặc nghiên cứu trên nhiều loài,còn thiểu những nghiên cứu tập trung định danh các loài vi tảo lục khu vực phía Nam.Hơn nữa, hau hết

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRUONG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

LAI THỊ DIEM PHÚC

PHIA NAM

KHOA LUAN TOT NGHIEP DAI HOC

NGANH SU PHAM KHOA HỌC TỰ NHIÊN

THÀNH PHO HO CHÍ MINH - 2023

LAI THỊ DIEM PHÚC

ĐỊNH DANH VA TẠO BO TIỂU BẢN HIẾN VI

MOT SO LOÀI VI TAO LUC Ở KHU VỰC

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn thay Đồ Thành Trí - người đã tận tình giúp đỡ và hướng din,

động viên em trong qua trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận nay.

Em xin chan thành cảm ơn Trường, Phòng Dao tạo, các thay có trong Khoa Sinh học

-Trưởng Đại học Sư phạm TP Hỗ Chi Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện khỏa luận

nay.

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS Trần Hoàng Dũng, ThS Nguyễn Thành Công

đã tạo điều kiện, giúp đã để em có thể thực hiện được những bước quan trong trong quả trình

nghiên cứu.

Qua đây, em cũng xin gửi lời cảm ơn đến bạn Bùi Thị Mỹ Ngọc, Võ Thị Thanh Xuan,

Nguyễn Phan Hoàng Anh, Nguyễn Thị Yén, Nguyên Ngọc Hạnh, em Trần Thị Ngọc Anh, em

Huựnh Hai My đã giúp đỡ và góp ¥ kiến cho em trong quá trình hoàn thành kháa luận Nếu không

có sự giúp đỡ của các bạn và các em, em đã không thé hoàn thành được khóa luận nay.

Cudi cùng em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình đã tạo mọi điều kiện, động viên

khích lệ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.

Tuy có nhiều có gắng, nhưng trong khóa luận này không tránh khỏi những thiểu sót Em

kính mong quý thây cô, các chuyên gia, những người quan tâm đến đẻ tài, đồng nghiệp và bạn bè

tiếp tục có những ¥ kiến đóng góp, giúp đỡ dé dé tài được hoàn thiện hơn

Một lần nữa, xin gửi đến tat cả mọi người lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất

TP Hỗ Chí Minh, ngày 28 tháng 04 năm 2023

SINH VIÊN

Lại Thị Diễm Phúc

MỤC LỤC

RU GG nh ch cư ri cv 0 r0 v07 011 71 00/7 TT cỰỢi ii

DANH MUC CÁC HÌNH esssessssscssssssssscsssscsscascsssosassssasscssssascsssssasasssasisasssssasssassasesasssssanueiseas vDANH MỤC BẰNG bisscsssssssscsssssscsssssssacsssssscsssnsscacssssssascssssscsssssssasssssssassssssssossssnssosasssasesens viiiDANH MỤC KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIET TAT ‹ccccccccccccccccooccecoccoococooooccococooooocooooooroccooooocoe ix

I TINH CAP THIET CUA DE TAI -cccccccscssesssesssesssessseessessveesssvsseesnsevavessseneveensecaveenss 1

TE MỤC DICH NGHIÊN CỨU 22-5 2S E211 E11 5111712211111 11171121511 1x x ye 2

Mi, ĐồITƯGNGNGHIENEDDUHseuuonouonioaoaoooaooanoaooanoooaoooaaoooaẳŸyay 2

ý FHAMVINGHIENGUeaaouoanoinooonnounnoi-ỷ-aoouunsananuantnnoann 2

HƯỚNG TÔNG QUẦN ceieeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeooiereetieootoiiitereoooiororosgosossse 3

1.1 TONG QUAN VE NGHIÊN CỨU VI TAO o c.cccsccccsssesssessesssesoesseseesseessesseensesneesees 3

1.1.1 Tông quan về vị tảo NC cceeceessesesseessecessesnecesecenecesscsuecesuesseessnesicessuecaessnecasessees 3

1.1.2 Tình hình nghiên cứu vi tảo ở Việt Nam HH re 5

1.1.3 Tình hình nghiên cứu vi tảo trên thé giới ¿6 5 22v 1v v21 112 1x 2 61.2 TONG QUAN VE CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH PHAN TỬ 7

1.2.1 Phương pháp chỉ thị hình thát - các t2 SH HH net 7 1.2.2 Phương pháp chi thị phân tử HH HH HH HH HH 7

1.2.3 Chi thị mã vạch DNA (DNA barcode) - - - ccnnc HH ng 4 111 n2 gg ve 8

1.2.5 Vùng đệm trong được sao mã (Internal Transcribed Spacer - ITS) 10

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU o552os5oosonsooosoonssosose 12

2.1 THỜI GIAN, DIA DIEM VA DOI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 22525552 12

2:1 A SRAM 8EHHTÔP COW sacs: cccccessssecocssacscocsesaccaceseseccezasesacesaasasseceassscesasaszcccserazecocsass 12

SF FE ta pean NOON UN soi: 7t2s:11:0121210111221115315531051123213141322164362235340313384183744663i 122.1.3 Đối tượng nghiên cứu c6 t2 21 1122121111111 011111211111 1211111212111 12g, 12

2.1.4 Vật liệu nghiên cứu ST HH TH HH Hàn Hit 12

2.2 QUY TRÌNH THỰC HIỆN NGHIÊN CỨU 2- 2522 ©£SE22Sc£EEcczzcExrzzcvzee 142.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỬU 22 S22 S42SE2S2£EEEEEECEEEEEEE22223222222xecrecrree 14

2.3.1 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái 2- 6-5255 S222 xxcscrkv l42;:3:2.iEhương pháp muGiiehy don Abe sesisissiscssisessessessssesssssseassssssssssisinevasssssovssnssvenesesis 14

2:3:3: (Pierre pilibip ticki CHIU NIA cissssssissssesasesnsoscsnsussrexssiseesearassnsasavisssaesaisossscinessasisi 16

2.3.4 Phương pháp điện di trên gel agarose Ï?⁄Á, sành 17

2.3.5 Phương pháp PCR trinh tự 18S và I'T§ ó- «Ăn 18 2.3.6 Phương pháp giải trình tu vùng ITS vả vùng 18S vả hiệu chỉnh trình tự của các

2:3:8; Phong php lai thu bats cssisisssssissssssssssvessasssvessasssvessasasieveassavesssaasssssacaaassasaaiass 21

19 11 IIiIắñäẳada 21b) Thực hiện tiêu bản cỗ định s2 2S TS S11 E1 2321112521111 21 11221111 xe 22CHƯƠNG 3: KET QUA VÀ THẢO LUẬN coccsocsoessosoosssssrssnssnsssssesss, 24

3.1, KET QUA NUÔI CAY VI TẢO DON DÒNG 02222202222 11221221211 xe, 24

3.1.1 Kes quả Cy trải vì tảo trên đĩa NACh sescssssvssessvsssvasssssvvevsssvsessssssvevssssasseseassveenseses 24

3.1.2 Các chúng tao đã nuôi cay đơn dong thattth GÔN S25 c5<<<<<cce=eeees 25

Siit2!1,/GH-ng dN DI ¿:isasáiai6e2cc102122100211201110222210110222716)23232101371252108396101210326187 25 3.1/2:2 Chủng viitảo CHỦ ssisssscssissccnstssssccssscscocsrsvsssccssvsecnnssasnacssaiseosaraviacesssveconnntin 26 3.1.2.3, Chủng vi tảo CHÔ3 2c 0 21 010 11 11101111111 2121110111111 c1 2e 26

3.1.2.4 Chúng vi tảo CH04 2-2222 S22 2222221172221117721211177122111221 211122 se 27 3.1.2.5 Chúng vi tảo CHÚS 2-2-2 SsSSS2 S221 222 3127322112231712211222212 22x 27

ki an ta CHO6 n73›››¿ý4 28

3.1.3 Định danh bằng hình thái, so sảnh với các nghiên cứu khác 28

3:2: KET QUA TÁCH CHIET DNA escsissssesssassosscssssoacsssvooasssasscuscssssoocassssencscssicoascassenoesies 31

3.3, KET QUA PCR VUNG TRINH TỰ 18S VÀ ITS CAC MAU TẢO 32

3.3.2 Kết quả hiệu chính quy trình và PCR vùng trình tự ITS 2-25-5555 343.5 KET QUA GIẢI TRÌNH TỰ VÀ HIỆU CHÍNH TRÌNH TỰ VUNG 18S VA VUNG

La cố (00/0 ïïì T0 TT TẤT NT TỰ Tin 700 0000 0 35

3.5.1 Kết quả giải trình tự vùng 18S và vùng ITS ccccccssecessssssesosssessesvesseesesseesesnssseenvecsens 353.5.2 Kết quả hiệu chính trình tự vùng [8S và vùng lTŠ chia 363.6 KET QUA BLAST TRÌNH TU GENE TREN CƠ SO DỮ LIEU NCBI 38

3.6.1 Ket qudi blast mitt CHL cccccccesscesscessesssesecssecssecssssneesessseceecsuecsuesesssecacesacesecsses 383:6.2:.Năhgul\Man:mẫu CHOD ss scscasssosssosssssssosscosssosssssssosseonsonssssnsessscanscssasonsossscasscoaees 408I0:3)/KienigiilitBiisiiiini Ho: se canngss2:ity102221105702201130223131016161181012131133182163183232181146123187 41

3.6.4 Két quad blast n9 n e e<e TH 42

3.6.5 Kết quả blast mẫu CHUỔ 5-2 c 22223 222221112222211127212 10211211011 1 1c 44

3.7 KET QUA XÂY DỰNG CAY PHÁT SINH CHUNG LOẠI DUA TREN TRINH TỰ

ISSICUA CAC MAU VI TẠO uunggngggỹõnggghaggg thành HHI40100000140110146140186036810104338088 46

3.8 SO SANH KET QUÁ ĐỊNH DANH HÌNH THÁI VÀ ĐỊNH DANH PHAN TU 49

3.9 KET QUA LAM TIỂU BẢN - 2 2621 1 21 5211021711011 22 1101121211 11110112 ng 50

3.9.1 Kết quả điều chính quy trình làm tiêu ban để phù hợp với đổi tượng vi tao 30

3.9.1.1 Thuốc nhuộm - 5-5 St S SE TS SH H1 HT T111 111117111511 1121 1 11c 111g 50Ši0:Ì:2u/ách:Gỗ đÌnh THẤN sang nang ng 020000000120101461311601230106336131083443801389236304 513.9.1.3, Keo dán mẫu 0 0n ng g1 1c H1 111101 111012111101 n0 111101012, 51

BIE15' (Ie Gii0il0ni ER DỊP ND I‹cci01t2125110116221230152931300512118014435037102221101815210331824047095165103312225537 53

3.9.2.1 Tiêu bản Chlorococcum Sp .-ccsceccesseeeecesseeeeeseeeeeseeceeeeaseeessesessesaseeseess 54 3:7.2.2 Tiêu ban Mesastrum @racillis : 0::ssscesessiscosessseccsasssevesessssseesessissesesssecesanss 54 3.9.2.3 Tiêu ban Desmodesmus 0cccccceceeeseeeeceesecececeeessccseeeeseecesececceeeneececeees 55

10/2.3 11 seed WEIN )0CTGESHIHSISHN:.::2.2:::222422::222522322222221221224211301533332331243635138222361122321355 56

KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ, ««©©©+CECEVEEEE.411114141411EEEEEEEEEE11111211112222226ee 57

2 4ì n8) (9)/1tđddddddaáaẳdẢẢẮẲẮ 57

FEHUUHE sacccccsccezcsscscccesssscnececsssszcsscssscesnscsssssenccczssscs sevszssssstonesatsssssovesssssssvesssseesessssssssbevsssss a

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Vang 18S ở sinh vật nhân chuẩn -2-2222222222222221222222112222221222eczveer 10 Hình 1.2.Vùng ITS ở sinh vật nhân chuẩn [20] -2- 22 +ztcEzZExerrrezrxrrrrrcrvree H Pitesti: See đồ guy tính nghiên BỮN: caaosannoaaaniriorirdgiobddtiiiittlttibBEEG00100 0888100 14 Hình:2:2-Tiêu¡bânihoàn chỉnh, - :;: ::: :::::::2::i1220112120110012010130262211141232313030123313614 0323388 23

Hinh 3.1 Hình ảnh cay trải các mẫu tảo trên đĩa thạch 55-52 c5:22vvccsce 24 Hình 3.2 Hình ảnh bình nuôi tảo sau | tháng nuôi cấy tăng sinh -5-552 25

Hình 3.3 Hình ảnh chủng tảo CH01 chụp dưới kính hiển vi x100 -. : 25

Hình 3.4.Hinh ảnh chúng tảo CH02 chụp dưới kính hiển vi x100 . 26

Hinh 3.5.Hinh anh chúng tảo CH03 chụp đưới kính hiển vi x100 -. -52+- 26 Hình 3.6.Hình anh chúng tảo CH04 chụp đưới kính hiển vi x100 - 27

Hình 3.7.Hình anh chúng tao CH05 chụp đưới kính hiển vi x100 -2 2-c- 27 Hinh 3.8.Hinh ảnh chủng tảo CH06 chụp dưới kính hiển vi xLØ0 - : :-55: 28 Hinh 3.9 Hình anh so sánh hình thái chủng táo CH01 với nghiên cứu khác 28

Hinh 3.10 Hình anh so sánh hình thai chủng tảo CHÓ2 với nghiên cứu khác 29

Hình 3.11 Hình ảnh so sánh hình thai chúng tảo CHO3 với nghiên cứu khác 29

Hình 3.12 Hình anh so sánh hình thai chủng tảo CH04 với nghiên cứu khác 30

Hình 3.13 Hình anh so sánh hình thai chang tao CHOS với nghiên cứu khác 30

Hinh 3.14 Hình ảnh so sánh hình thai chung tảo CH06 với nghiên cứu khác 31

Hình 3.15 Kết quả điện di DNA tổng $6 i55 2 2 0111221102111 110011101 r0 31 Hình 3.16 Kết qua PCR vùng trình tự 18S .0 00 c.cccsccescseesseesssesseeessessvesssesevessvessetesseeneeenes 33 Hhih 3:17 RGt cad POR: vũng trình tự ITS sisscssssssesssasiseosssvsassosnasucascsasasossscasavoasevsoesosanss 34 Hình 3.18 Kết qua giải trình tự vùng 18S mdi xuôi và mỗi ngược của mẫu CHOI 36

Hình 3.19 Kết quả giải trình tự vùng ITS môi xuôi của mẫu CH04 36

Hình 3.20 Kết qua hợp nhất trình tự môi xuôi và môi ngược vùng 1§S 36 Hình 3.21 Kết qua so sánh trình tự vùng 18S của mẫu vi tao CHO! trên ngân hang

GEHDRRIÌItisssntosssii01610540101066515101656131811656111355380141498398199568588858538885855356588883838583895886595385393538589888 38

Hình 3.22 Vùng trình tự bị gián đoạn của CHO! so với mẫu trình tự trên ngân hang

(ERDNDĂ: tiinsiiioisstiiiitssiitiis6i11011151811113151011181213311333953368558183858335803359558188685585956853888598868595988853588 38

Hình 3.23 Hình ảnh so sánh hình thai của chủng tảo CHƠI và mẫu tảo Scenedesmus sp.38 Hình 3.24 Cây phat sinh chủng loại của mẫu tảo CH0I xây dựng dựa trên các trình tự trên

ñEÂñ!RAngiGefibanK:ocooooiooioooaiioiitiiiii1010442111310331113103581183635551585355555560858835E8381853583856 39

Hình 3.25 Kết quả so sânh trình tự vùng 18S của mẫu vi tảo CHO2 trín ngđn hang

(GEHUATi tissstiiasttiititst3111111135111110353161131351313538535631885858858828585858385858353858085885589886885898588ê3888588855588 40

Hình 3.26 Cđy phât sinh chủng loại của mẫu tảo CH02 xđy dựng dựa trín trình tự 18S vă

câc trình tự trín ngđn hang Genbank - nen net 40

Hình 3.27 Hình ảnh so sânh hình thâi của chủng tao CH02 vă mẫu tảo Tetranephris

cae trinh ier tren ngan hang Genbanf: ::::s:s:::::-:::::icciiiiittiiii1itit11110231311113331516233351553 5581387 42

Hinh 3.31 Kết quả so sânh trình tự ving ITS của mau vi tảo CH04 trín ngđn hăng

Hình 3.32 Cđy phât sinh chủng loại của mẫu tảo CH04 xđy dựng dựa trín trình tự ITS câc

trình tự trín ngđn hăng Genbank + - cc St ri 43

Hình 3.33 Kết quả so sânh trình tự vùng 18S của mau vi tảo CHOS trín ngđn hang

Hình 3.34 Cđy phât sinh chủng loại của mẫu tao CHOS xđy dung dựa trín trình tự 18S văcâc trình tự trín ngđn hang Genbank nh Han 44

Hình 3.35 Kết qua so sânh trình tự vùng ITS của mẫu vi tảo CHOS trín ngđn hăng

OOM AIG: ciccssicescsascscacesssscsacsesecscscascussransasaivansuserscanasarouanaiavarssavararanssatannesisiassesssiaseusstissesaniss 45

Hình 3.36 Hình ảnh so sânh hình thai của chủng tảo CH02 vă mẫu tảo Diplosphaera .46Hình 3.37 Xử lý câc đoạn trình tự bang phan mềm seaview trước khi xđy dựng cđy phât

sinh chủng loại - HH HH ng TH HT TH TH HT Tăn HH 47

Hình 3.38 Cđy phât sinh chủng loại của năm mẫu vi tảo xđy dựng dựa trín trình tự 18S

öềš¡34§666513388566š5368856š358888êê3895666ê5358566355588553859685ê535556688š358656š1š5585ö55536888ê3ê56658835586668535 885888338 8485658 48

Hình 3.39 Tế băo loăi vi tâo Senalastrum sau khi xử lý formol 5% vă nhuộm xanh

ineihyIEnei00 PHOS ải KA) scscsscscsscssesasazvscsassnscaccsaseccscsavarssasavaracaussauaesasaasaeaasassasastesseaansias $1

Hình 3.40 Mẫu tảo trước vă sau khi dân có định bằng keo Canada Balsam 52

Hình 3.41 Mau tảo trước vă sau khi dân keo Mounting Medium - 53Hình 3.42 Tiíu ban Ch/orococum chụp dưới camera kính hiển vi x40 s4Hình 3.43 Tiíu bản Mesastrum gracilis chụp đưới camera kính hiển vi x40 54

Hình 3.44.Tiêu bản Desmodesmus chụp dưới camera kính hiên vi x40 55Hình 3.45 Tiêu bản Coelastrum sp chụp đưới camera kính hién vi x40 55Hình 3.46.Tiêu ban Scenedesmus sp chụp dưới camera kính hiển vi x40 56

DANH MỤC BANG

Bảng 1.1, Tong quan về các dòng chính của tao lục (Chlorophytes) [§] 4

Bang 2.1./Thành phần môi trường BGIL 2-5-2222 222222 222222 c2.cEEerrrrrrrrrrrrcrvee 15

Bang 2.2 Thanh phan bộ kit Plan DNA extraction cccscccscssssessesssseseesssersvensversvensvenseeanns 16

Bảng 2.3.Cặp moi sử dụng dé khuếch đại phan ứng PCR các mẫu chủng tảo 18

Bang 2.4 Thanh phần của phan ứng PCR 0 55 1 C21 2111 C51 1111211201122 c2 06 18

Bảng 2.5.Chu trình nhiệt khuếch đại vùng ITS của phan ứng PCR -2- 19Bang 2.6.Chu trình nhiệt khuếch đại vùng 18S của phản ứng PCR -. - 19

Bảng 2.7 Lượng Butanol va ethanol tuyệt đối dé pha các dung dịch Butanol có nồng độ

GHI EHHSBG 216106/0021006020620060020000000211006.222082- 022000020000002200/06 1109L2201.2 0 2.2 22

Bảng 2 §.Thời gian khử Butanol va ethanol ở các nồng độ khác nhau 23

Bảng 3.1.Kết quả giải trình tự vùng ITS môi xuôi và mỗi ngược của mẫu CH05 37

Bảng 3.2.Bang tóm tắt kết quả giải trình tự ITS sau khi hiệu chinh trình tự 37

Bảng 3.3.Bang so sánh giữa kết quả định danh hình thái và kết qua định danh phân tử kết

hợp với định danh Bình thấi, - ác các 2c 02201000012 01018165421210464421015828401055e.0854 50

Bang 3.4.Số lượng tiêu bản mỗi loại tảo 55c ccsccerrrreerrrrrsererrrceece SB

DANH MUC Ki HIEU CAC CHU VIET TAT

TU VIET TAT GIAI NGHIA

TT

Internal transcribed spacer

MỞ DAU

I TÍNH CAP THIET CUA DE TÀI

Tao được xác định là một nhóm vi sinh vật không đồng nhất, từ tảo xanh lam cực

nhỏ (vi khuan lam) đến táo biến lớn, phức tạp, có kích thước lên đến vai mét Các loài

tảo quang hợp nhỏ đưới nước chỉ quan sát được dưới kính hiển vi được gọi là vi tảo

[1] Vi tao là nhóm sinh vật vô cùng da dang và có chứa nhiều phân tử hoạt tính sinh

học như sắc tố, acid béo không bão hòa, polysaccharide, polyphenol, Chúng có thé

quang hợp va sản xuất lipid, protein va carbohydrate với số lượng lớn trong một thời

gian ngắn Vì vậy mà vi tảo được nghiên cứu rộng rãi với tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: y tế (chống oxy hóa, chong viêm, chống ung thu, kháng khuẩn) sản xuất nhiên liệu sinh học, thức ăn cho người vả chăn nuôi [2], [3].

Một cách tương đối vi tảo được phân chia thành 11 ngành [4] Trong đó ngành vi

tao lục (Chlorophyta) có số lượng loài khá đa dang và 1a đối tượng đang được nhiều

nhà khoa học chú trọng nghiên cứu Nhiều loài vi tảo lục có những ứng dụng trong

nhiều mặt của cuộc song Vi tao lục đã được sản xuất dé khai thác thương mại, với các

ứng dụng khác nhau, từ thực phẩm sức khỏe cho người, nuôi trồng thủy sản và thức ănchin nuôi, đến chất tao màu, mỹ phẩm vi chúng có thê tao ra các chat chuyên hóa có

giá trị như chất chống oxy hóa, carotenoid, acid béo không bão hòa, vitamin, chat chống ung thư và kháng virus [5] Một tiềm năng khác của vi tảo lục là dùng hàm

lượng lipid cao của chúng như nguồn nguyên liệu dé san xuất diesel sinh học [3] Bên

cạnh đó, chúng cũng có khả năng loại bỏ một số kim loại nặng khỏi nguồn nước vì vậy

chúng được ứng dụng trong lĩnh vực xử lý nước thải.

Ước tính có khoảng 200.000 đến vài triệu loài vi tảo tồn tại so với khoảng250.000 loài thực vật bậc cao [6], có khoảng 40.000 loài tao đã được nhận diện và các

loài mới vẫn tiếp tục được phát hiện ở tốc độ nhanh, vải loài/tuần

Khu vực phía Nam của Việt Nam được biết đến với hệ thông sông ngòi rừng

ngập mặn rat phong phú Day chắc chắn là môi trường cho nhiều loại vi tảo nói chung

và vi tảo lục nói riêng sinh sống Hiện nay, một số chủng vi tảo lục đã được phân lập ở Việt Nam và định danh hình thái sơ bộ Tuy nhiên, các chúng tảo nảy đều ở dạng chưa

thuần loải (con nhiễm một số vi sinh vật, vi khuẩn) Một số nghiên cứu khác cũng đã

được tiễn hành nhưng chi tập trung ở một khu vực nhỏ hoặc nghiên cứu trên nhiều loài,còn thiểu những nghiên cứu tập trung định danh các loài vi tảo lục khu vực phía Nam.

Hơn nữa, hau hết các loai vi tảo lục đều có kích thước nhỏ, cầu tạo cơ thé đơn giản và

tốc độ phát sinh loài mới nhanh nên việc định danh bằng hình thái trở nên khó khăn va thiếu chính xác Vì vậy cần có thêm nhiều nghiên cứu sử dụng trình tự DNA dé định

danh nhóm sinh vật này chính xác ở cấp độ loài dé làm nên móng cho các nghiên cứu

ứng dụng sau nảy.

Việc thu thập, lam tiêu ban tảo bén ngoài tự nhiên gặp nhiều khó khăn, mẫu sau

khi thu gồm nhiều loài ví tảo khác nhau và nhiễm nhiều loài vi sinh vật, các mẫu tiêu

bản néu không được bảo quan tốt sẽ hao hụt và mat di các tính chat ban đầu Trong các giờ học thực hanh về đỗi tượng vi tảo, cần phải có một số lượng loài nhất định mới có

thẻ minh họa hết được các đặc điểm hình thái dé sinh viên hiểu rõ hơn về đặc điểm của

nhóm sinh vật này Bên cạnh đó việc thu thập được nhiều mẫu cũng rất khó khăn vì

nhiều loài vi táo sông lơ lửng trong nước Các tiêu bản cô định các loài vi tảo lưu trữ trong phòng thí nghiệm sẽ góp phan khắc phục những khó khăn trên [7].

Với những lý do trên, việc “Định danh và tạo bộ tiêu bản hiển vi một số loài vi

tảo lục ở khu vực phía Nam” sẽ góp phan bé sung thêm cơ sở dữ liệu va tài liệu học tập về sự đa dang, thành phan loài vi tảo lục ở khu vực phía Nam của Việt Nam, làm cơ

sở cho các nghiên cứu cao hơn về ứng dụng tiềm năng của vi tảo

II MỤC DICH NGHIÊN CỨU

- Định danh một số loài tảo lục đã được phân lập bằng trình tự ĐNA.

- Thực hiện tiêu ban cô định một số loài vi tảo luc.

II DOI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Các chủng vi tao lục (Chlorophyta) sông ở môi trường nước ngọt thu được ở khu

vực phía nam Việt Nam,

IV PHAM VI NGHIÊN CỨU

Do thời gian nghiên cứu có hạn nên dé tài tập trung vào nội dung định đanh tên

ae ` ,+ẤÉ ` cm ` £ seas ss n

loài và tiễn hành thực hiện tiêu bản có định 5 loài tảo lục, mỗi loài 5 tiêu bản

CHƯƠNG 1 TONG QUAN1.1 TONG QUAN VE NGHIÊN CUU VI TAO

1.1.1 Tong quan vé vi tao luc

Vi tảo lục là một nhóm tảo có kích thước hiển vi thuộc ngành tảo lục Dựa trênmột số khác biệt vẻ sinh hóa và tế bảo, người ta phân ra hai nhóm vi tao lục chính:

Chlorophyta và Conjugaphyta Trong đó có nhiều loài trong nhóm Chlorophyta được

sử dụng cho các ứng dung công nghệ sinh hoc Chlorophyta được chia thành bon lớp:

lớp Prasinophyceac là tao đơn bao có roi, đường kính chi 10-15 am và được bao phủ

bởi các vảy hữu cơ Hau hết các loài sống trong môi trường biển và nước lợ, một số

loài sông trong môi trường nước ngọt Lớp Chlorophyceae đại điện cho nhóm lớn nhất, với khoảng 2.500 loài trong 350 chi, Hầu hết các loải sông trong môi trường nước ngọt

đơn bảo hoặc dạng sợi Các loài tảo được biết đến nhiều nhất, chăng hạn như Chlorella,

Chlamydomonas, Dunaliella và Haematococcus Lớp Ulvophyceae và Charophyceac

chủ yếu bao gồm tao có kích thước lớn Không có dang đơn bào hoặc dạng sợi nào có tam quan trong vẻ mặt công nghệ sinh học [6] Tuy nhiên hệ thong phân loại này được

cho là không pha hợp với lịch sử tiến hóa vì nó chỉ sử dụng những phân tích dựa trênđặc điềm hình thái [8]

Những thập ki gan đây với sự ra đời của các kĩ thuật phân tử định danh loài dựatrên RNA, gene luc lap, gene ty thẻ đã cung cap thêm các dit liệu dé có thé hiểu rõ hơn

về phát sinh loài của tao lục [9] Lớp Prasinophyceae trước đây, đã được chuyên thànhhai lớp mới gọi là Chlorodendrophyceae va Pedinophyceae Hai lớp mới cùng với

Trebouxiophyceac, Ulvophyceac và Chlorophyccae thuộc về phân ngành

Chlorophytina hay 'core Chlorophyta', trong khi phân ngành Prasinophytina nằm ở một

nhánh riêng, không còn nằm trong lớp Prasinophyceae.

Bảng 1.1.Tông quan về các dòng chính của tao lục (Chlorophytes) [8].

1.1.2 Tình hình nghiên cứu vi tảo ở Việt Nam

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu vi tảo va đặc biệt vi tảo ứng dụng con mới mẻ hon

so với các nước, đặc biệt là đối với các nước phát triển như Mỹ Nhật va các Châu Âu.

Hau hết những nghiên cứu về vi tảo ở Việt Nam chủ yếu đi về các nghiên cứu cơ bản

như phân loại, đa dạng sinh học và sinh thái như Nguyễn Văn Tuyên (trường Đại học

Sư phạm Thành phố Hỗ Chí Minh, Nguyễn Thanh Tùng trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh) và một số nha nghiên cứu khác tại các trường cao đăng,

đại học và các viện nghiên cứu.

Năm 2010, nhóm nghiên cứu thuộc Viện vị sinh vật và Công nghệ sinh học của

Đại học Quốc gia Hà Nội đã nghiên cứu đặc điểm của một số loài vi tảo silic phân lập

ở rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam Định Kết qua đã phân lập được ba ching vi tảo

thuộc chi Chaetoceros và Navicula và phát hiện ca ba chúng tảo đều có ham lượng acid

béo cao và đa dạng về thành phân {10].

Năm 2013, nhóm nghiên cứu của Dinh Thi Ngọc Mai và cộng sự đã nghiên cứu

sản xuất diesel sinh học chất lượng cao từ vi tảo biển Tetraselmis sp Qua nghiên cứu,

kết luận được phương pháp chuyển vị ester tại chỗ sử dụng chất xúc tác acid là phương

pháp phủ hợp hiệu quả dé sản xuất diesel sinh học từ vi tảo biển Tetraselmis sp.

Trong công bố cúa Trần Yên Thao et al, (2017), Tác giả đã xác định được 50chúng vi tảo sinh lipid từ nhiều nguồn nước khác nhau, từ các mẫu nước ngọt đến nước

lợ và nước biên ở Việt Nam Có 20 trong số 50 chung có lipid cao va sinh khối cao

Một số chủng có hàm lượng lipid lên đến 50% khói lượng khô Phân tích trình tự gen 18S rRNA của 50 chủng cho thay sự đa dang lớn trong tập hợp vi tao này Nó bao gồm

ít nhất 38 loài và đại diện của 25 chỉ tảo lục: Chlamydomonas , Poterioochromonas ,

Scenedesmus , Desmodesmus, Chlorella, Bracteacoccus, | Monoraphidium,

Selenastrum, Acutodesmus, Mychonastes, Ankistrodesmus, Kirchneriella, Raphidocelis,

Dictyosphaerium, Coelastrella,Schizochlamydella, Oocystidium, Nannochiloris,

Auxenochlorella, Chlorosarcinopsis, Stichococcus, Picochlorum, Prasinoderma,

Chlorececcum, Marvania [11].

1.1.3 Tình hình nghiên cứu vi tảo trên thé giới

Sinh học vi tao là một ngành rất trẻ so với các ngành khoa học khác Sinh học vi

tảo khi mới ra đời chủ yếu nghiên cứu phân loại dựa trên hình thái và đa dạng sinh học.

sinh thai, sau đó là nghiên cứu cau trúc trong lĩnh vực sinh học tế bao va di truyền học.

Trong vòng hơn hai thập kỷ qua, việc ứng dụng vi tảo trên thé giới ngày càng được chú

trọng và khai thác ứng dụng trong các lĩnh vực như nông nghiệp, thực phẩm, y học,

thâm mỹ và nuôi trong thủy sản, đặc biệt là vi táo biển Bên cạnh đó những nghiên cứu

dé cải tiên phương pháp phân lập vả định danh chính xác vi tảo ở cấp độ loài vả dưới

loài vẫn tiếp tục được thực hiện

Năm 2004, Amos Richmond đã tông hợp rat nhiều nghiên cứu và xuất ban sô tay nuôi cay vi tao, Tài liệu nay đã được ứng dụng rất nhiều trong việc nuôi cấy vi tảo cho

việc định danh, nghiên cứu ứng dụng của vi tảo cũng như nuôi tảo ở quy mô công nghiệp.

Năm 2007, Alessandra De Martino và cộng sự đã sử dụng ving gen

ITS1-5,8S-ITS2 ở 10 chủng Phacodactylum tricornutum khác nhau được thu thap tại nhiều cửa

sông lớn có rừng ngập mặn Kết quả nghiên cứu này cho thấy trong 10 chủng thì có 3

chủng khác nhau ở Š vị trí đa hình nucleotide don và khác biệt về mật hình thai Từ kết

qua nay cho thay vùng ITS1-5,8S-ITS2 có kha năng cao phân biệt các loài vi tảo ở các

môi trường rừng ngập mặn khác nhau [12].

Năm 2015, Ramganesh Selvarajan và cộng sự đã sang lọc và đánh giá một số

chung tảo lục (Chlorophyceae) được phân lập từ nước ngọt và hé nước ngọt đẻ sản xuất

nhiên liệu sinh học Qua nghiên cứu phát hiện chủng mới, Chlorella vulgaris LC8 có

tiềm năng như một nguyên liệu đẻ sản xuất dau diesel sinh học chất lượng tuyệt vời

Năm 2016, Samed L I A Hadi và cộng sự đã đánh gia tính khả thi của việc sử

dụng gene tiêu đơn vị lớn của enzyme RuBisCO ( rbeL), dé xác định một nhóm rat đa

dang, mặc du ít được biết đến của vi tảo lục từ vùng nước nội địa tân nhiệt đới ở Brasil

[13].

Năm 2020, Marvin W Fawley và Karen P Fawley đã trình bảy một quy trình có

hệ thong dé xác định vi tao nhân chuẩn bằng cách sử dụng bằng chứng hình thái học vả phân tích trình tự DNA Công bố đã cung cấp các tiêu chí có thé sử dụng đẻ xác định ở

cấp độ chi hoặc loài, tùy thuộc vào sự sẵn có của dit liệu trình tự trong cơ sở dit liệu và

kho lưu trừ được quản lý [14].

1.2 TONG QUAN VE CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH PHAN TỪ

Có nhiều phương pháp định đanh loài khác nhau va hau hết các phương pháp này

đều dựa trên nguyên tắc các loài có chung nguồn gốc, có những tính chất giống nhau

các loài gân nhau thì tính chất giống nhau cảng cao Hai phương pháp thường hay được

dùng dé xác định các loài động, thực vật là phương pháp chi thị hình thái va phương

pháp chỉ thị sinh hóa Bên cạnh đó, những thập ki gan đây với sự pháp trién của các ki

thuật phân tử, phương pháp sinh học phân tử giải trình tự đoạn gene đặc trưng của các

loài động thực vật được sử dụng rộng rãi và cho kết quả định danh chính xác hơn

1.2.1 Phương pháp chỉ thị hình thái

Chỉ thị hình thái là phương pháp đánh giá thông qua các đặc điểm hình thái bên

ngoài như hình dạng, kích thước mau sắc, bê mặt các bộ phận khác nhau của thực vật

và nhiều đặc điểm dé nhận biết khác về mặt hình ảnh Ưu điểm của phương pháp này là

dé dang quan sát đặc điểm hình thai bằng mắt thường và không đòi hỏi các thiết bị đất

tiền cũng như các quy trình phức tạp Nhưng nhược điểm của phương pháp này yêu cầu

chuyên môn cao về nhận diện đặc điểm hình thái bên ngoài và mức độ bao phủ gene bị

hạn chế Bên cạnh đó vi tảo lục là đôi tượng có cấu tạo tế bảo đơn giản và it đặc điểmhình thái Do đó nếu dựa vào chỉ thị hình thái này dé định danh và chọn lọc sẽ matnhiều thời gian vả độ tin cậy thấp

1.2.2 Phương pháp chỉ thị phân tử

Chỉ thị phân tử thường được hiểu là chí thị DNA, các chỉ thị này chỉ nằm gan hay

liên kết với gene và không có hoặc ít ảnh hưởng đến kiểu hình Chỉ thị DNA là những

thay đôi trong phân từ DNA và được chia thành nhiều loại dựa trên sự khác nhau về

phương pháp va kỹ thuật xác định sự đa hình, Khác với các chỉ thị hình thái va sinh

hóa, các chỉ thị DNA được sử dụng rộng rãi do sỐ lượng chi thị không han chế.

Mỗi loại chi thị DNA được phát triển bằng một kĩ thuật tương ứng Kĩ thuật chỉ

thi DNA lý tưởng cần phải có các tiêu chí sau: cho đa hình cao và phân bố đều trong

genome; cho sự phân biệt rõ sự khác nhau về đi truyền, tạo nhiều chỉ thị độc lập và

chính xác; đơn giản, nhanh và ít ton kém; cần ít mẫu và DNA; liên kết với kiểu hình

nhất định; có thê lặp lại trong các nghiên cứu, mức độ sai sót thấp nhất, ghi số liệu dễ

và chính xác, có nhiều allen (hàm lượng thông tin cao), không cần biết trước thông tin

về genome và cơ thê [15].

Một số ki thuật chi thị phân tứ phô biến: Da hình độ dai đoạn cắt hạn chế (RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism), lay dau cắt hạn chế (REF - Restriction

-Endonuclease Fingerprinting), đa hình độ dai nhân ban chọn lọc (AFLP - Amplified

Fragment Length Polymorphism), DNA da hình được nhân bản ngẫu nhiên (RAPD

RandomLy Amplified Polymorphic DNA), PCR với mỗi ngẫu nhiên (APPCR

-Arbitrarily primed PCR), Vị trí chuỗi tiểu vệ tinh đánh dấu (STMS - Sequence-TaggedMicrosatellite Site), Vùng đệm trong được sao mã (ITS - Internal Transcribed

Spacer) mdi kĩ thuật đều có những đặc điểm và ưu điểm riêng, cần thiết xem xét một

cách cần thận trong việc lựa chon kĩ thuật phủ hợp cho mục đích nghiên cứu [15]

1.2.3 Chi thị mã vạch DNA (DNA barcode)

Mã vạch DNA (DNA barcode) là một khái niệm được đưa ra bởi Paul Heber vào

năm 2003 Mã vạch DNA [a trình tự nucleotide của một chuỗi DNA ngắn, có cùng

nguồn gốc tô tiên (orthologous), trong đó có vùng ít bị thay đôi (rất ôn định — bảo thủ)

và có vùng dé thay đồi trong quá trình tiễn hóa Dựa vào mức độ thay đổi trong trình tự

DNA này dé đánh giá sự sai khác di truyền giữ các sinh vật Như vậy, mã vạch DNA làmột phương pháp định danh mới sử dụng một đoạn DNA chuẩn ngắn nằm trong hệ

genome của sinh vật đang nghiên cứu, nhằm xác định sinh vật đó thuộc về loài nào (16] Đến nay các nhà khoa học đã công bố tìm ra 11,919 triệu trình tự mã vạch DNA ở 340.000 loài sinh vật, 244.000 loài động vật, 72.000 loài thực vật, 24.000 loài nắm vả

các dạng sinh vật khác (theo tô chức Hệ thong đữ liệu mã vạch sự sống - BOLD thông

kê đến 26/9/2022).

Đến nay, nhiều kết quá nghiên cứu đã chỉ ra, có nhiều đoạn DNA đặc trưng được

sử dụng làm DNA mã vạch, các đoạn DNA mã vạch có thé là những đoạn DNA nằm ở

trong nhân (nuclear DNA - nDNA), như: 18S, 5,6S, 26S, 5S spacer và vùng ITS; nằm ở

ty thé (Mitochondrial DNA - mtDNA), như: Cytb và vùng kiểm soát (control region);

nam ở lục lap (Chloroplast DNA - cpDNA), như: matK, rebL, atpB, ndnF, 16S Các gen thuộc cpDNA có tính bảo tồn cao và có thé được chia thành 3 nhóm như sau:

Nhóm | là các gen mã hóa những yếu tố thuộc hệ thông quang hợp như phytosystem

(psaA, psaB, psbA, psbB ), cytochrome b6f (petA, petB ), ATP synthase (atpA,

atpB ) Rubisco (rbcL) va NAD(P)H dehydrogenease (ndhA, ndhB ) ; Nhóm 2 là các

gen mã hóa cho các rRNA (rrnl6, rrnŠ ), tA (tH, trấK ), RNA polymerase (rpoA,

rpoB ), các gen tiéu phan ribosome (rps2, rps3 ); và nhóm 3 gồm các khung đọc mở

ORF gọi là yc (chưa rõ chức nang) và các gen mã hóa protein như matK, cemA Có

rat nhiều gen cpDNA tham gia trong phân tích phân loại thực vật như: 16S, rbeL, atpB,

ndhF, intron trnL vả matK, trải rộng từ bộ cho đến mức đưới loài Mỗi đoạn mã vạch

DNA có những đặc trưng riêng và có khả năng phân biệt sinh vật ở các mức độ khác

nhau Ví dụ, các đoạn DNA như: 18S, 16S, 5,68 có kha nang phân biệt sinh vật ở mức

họ và chi; các đoạn DNA, như: 26S, rbcL, ndnF, atpB có khả năng phan biệt ở mức chi

và loài; các đoạn DNA, như: ITS, matK, cytb, 5S spacer có khả năng phân biệt ở mức

loài và dưới loài (subspecies, varicty, strain) Tuy nhiên, các nhà khoa học cũng đã

khuyến cáo, chưa có đoạn DNA nào được sử dung làm mã vạch chung cho tất cả các

loài sinh vat Vì vậy, việc lựa chọn những đoạn DNA (genc) đặc trưng dé làm mã vạch

va việc phối hợp giữa các đoạn mã vạch DNA Ia rất cần thiết và đem lại hiệu quả cao

[16].

1.2.4 18S rRNA

Gene mã hóa 18S rRNA mã hóa tiểu đơn vi ribosome 18S ở sinh vật nhân thực

Giống như 16S rRNA ở sinh vật nhân sơ, trình tự gene 18S rRNA cũng bao gồm các

vùng bảo tồn và vùng biến đổi (V1-V9, không có V6) Trong số các vùng biến đổi, V4

có thông tin cơ sở đữ liệu đầy đủ nhất và hiệu quả phân loại tốt nhất Nó được sử dụng

nhiều nhất và là lựa chọn tốt nhất cho các phân tích đa dạng sử dụng 1§S rRNA Trình

tự rRNA 18S phản ánh sự khác biệt về loai giữa các sinh vật nhân chuẩn trong các mau

nhất định

Hình 1 1.Vùng 18S ở sinh vật nhân chuẩn.

Mặc dù vùng V4 đã được chỉ ra là quan trọng dé nhận dang các sinh vật nhân

thực đơn bao, Nhưng vẫn nên giải trình tự một phan lớn gene 18S với nhiều môi để tạo

ra kết quả tốt nhất, thay vì chỉ vùng V4 Các chuỗi trình tự đài sẽ cung cấp thông tínchính xác hơn cho việc nhận dạng cũng cho phép đưa dữ liệu vào các phân tích phát

sinh loài trong tương lai [14] Việc giải trình tự 18S rRNA được cho là phù hợp dé xácđịnh một chủng ở cấp chỉ hoặc họ vì đây là locus có ít sự thay đồi [14],[17]

1.2.5 Vùng đệm trong được sao mã (Internal Transcribed Spacer - ITS)

Vùng đệm trong được sao mã (ITS) giữa gene RNA ribosome của tiêu đơn vị nhỏ

(SSU/ 18S) và gene RNA ribosome của tiêu đơn vị lớn (LSU / 28S) là một dấu hiệu

phát sinh loài thường được sử dụng ITS của sinh vật nhân chuẩn chứa rRNA 5,8S

được bảo tôn va được chia thành các vùng siêu biến ITS1 và ITS2 [18] Ở nam và thực

vật, các gene rRNA 5,85, 18S va 28S được bao ton cao, trong khi ITS, do thuộc vùngkhông mã hóa, ít chịu áp lực chọn lọc tự nhiên hơn và thé hiện tinh đa hình tốt hơn ở

hau hết các sinh vật nhân chuẩn ITS được bảo tôn tương đối nhất quán trong loài,

trong khi có sự khác biệt đáng kê giữa các loài Các đoạn trình tu ITS có kích thướcnhỏ (350 bp và 400 bp) vả để phân tích Chúng đã được sử dụng rộng rãi trong phân

tích phát sinh loài {19].(20].

ITS được cho là một locut mạnh đê xác định loai vì thay đôi nhiều hơn 1§S (đặc

biệt là ITS2) Đối với nhiều loại tảo, và đặc biệt là tảo lục, vùng ITS (ITS1, 5,88 fDNA

và ITS2) rất quan trọng dé xác định loài Trong các nhóm nay, ITS thường được giải trình tự bằng cách sử dụng các môi "phd quát" Tuy nhiên, nên tham khảo các nghiên

cứu đã được công bố và chọn méi đã được chứng minh là hoạt động tốt Nên giải trình

tự đầy đủ vùng ITS1, 5.88 rDNA va ITS2 đề có thể cung cấp thêm dữ liệu hữu ích thay

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 THỜI GIAN, DIA DIEM VÀ DOI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Thời gian nghiên cứu

Dé tai được tiền hành từ tháng 10/2022 — 4/2023.

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu sinh trưởng của vi tảo: Phòng thí nghiệm Sinh học Trung tâm khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm TP Hỗ Chí Minh; 280 An Dương Vương, P.4, Q.5, TP Hỗ Chi Minh.

2.1.3 Doi tượng nghiên cứu

Vị tảo lục

2.1.4 Vật liệu nghiên cứu

Các mẫu tảo được cung cấp bởi phòng sinh học trung tâm Trường Đại học Sư Phạm Thành phó Hỗ Chi Minh.Tông số có 6 mẫu tảo, các mẫu tảo được thu thập tại khu dự trữ sinh quyền Can Giờ tại 5 tọa độ khác nhau và đã được phân lập bước đầu

bằng micropipete Các điểm lay mẫu vả kết quả phân lập bước đầu thé hiện ở bang 2.1.

Qua bảng 2.1 có thé quan sát thấy 3 mẫu vi tỏa có hình thái đồng nhất và 3 mẫu vi tảo

có hình thái chưa đồng nhất.

2.2 QUY TRÌNH THỰC HIỆN NGHIÊN CỨU

BI: Nuôi cấy đơn đồng BI: Nhuộm và định hìnhmẫu _]

: Định đanh hình thái Đa: Có định mẫu trên lame

3: Dinh danh phan tir B3: Khử nước

: Tách DNA B1: Dan mẫu

Bó: PCR vùng tinh tự 18S và ITS

B7: Kiem tra chất lượng san phẩm PCR

bảng điện di.

BS: Giải trình tự, phan tích trình tự

B9: Tra cứu BLAST, định danh loài

BIG: Xây đựng cây phát sinh chúng loại

Hình 2 1.Sơ đồ quy trình nghiên cứu.

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái.

Các mẫu nước thu thập được quan sát đưới kính hiển vi Leica ATC 2000 có sử

dụng phan mém hệ thống camera kính hiển vi S-eye Hình thái hiển vi được quan sát,

ghi nhận và đối chiếu với các tiêu chuẩn đã được công bỏ

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy đơn dòng

Mục tiêu cua việc phân lập va làm sạch tảo 1a thu được các ching đơn dong, có

nghĩa là một chủng của một loài duy nhất ma không có chất gay 6 nhiễm Mục dich của việc lam việc với nuôi cấy vi tảo đơn dong trong nghiên cứu là dé đảm bao rang các kết quả thu được từ một nghiên cứu đến trực tiếp từ các loài vi tảo được nghiên cứu chứ

không phải từ một vi sinh vật gây ô nhiễm [21]

Nuôi cấy đơn dòng trong khóa luận này được thực hiện theo các phương pháp

nuôi cay trải trên thạch agar, đây là phương pháp cô điền được sử dụng rộng rãi và phủ

hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Quy trình được thực hiện theo hai phương phápcấy trải trên thạch và 46 thạch [22]

Các bước thực hiện:

Chuẩn bị thạch: Dùng elern 2 L dun | L môi trường BG11 đến 95°C Từ từ cho

1 lượng agar thích hợp và khuấy đều Môi trường rắn được chuẩn bị bang cách cho 10g

agar! | L môi trường Môi trường bán rắn được chuẩn bị bằng cách cho 5 g agar/ 1 L

môi trường Đẻ thạch nguội bớt (khoảng 50-60°C) đối với môi trường rắn dùng cho

cay trải, thạch được đô ra các dia petri đã được hấp vô trùng, dé nguội va cho vảo túi

chứa, bảo quản ở nhiệt độ 40C.

Cấy tảo: Đối với các loài vi tảo có khả năng phát triển trên bề mặt thạch sẽ được

cấy trải trên bề mặt Đối với một số loài tảo không phát triển được trên bé mặt, 0,1 mL tảo được trộn với 5 mL môi trường bán rắn và đồ lên trên môi trường rắn dé tạo lớp

phủ bán rắn.

U: Tat cả các mẫu cay được ủ ở nhiệt độ phòng (30 + 2 ° C), dưới ánh sáng

huỳnh quang (chu kỳ 12 giờ sáng / 12 giờ tối) trong 2 đến 4 tuần đến khi xuất hiện

khuẩn lạc

Loại bo các vi khuẩn: Các khuẩn lạc xuất hiện trên dia được chọn lọc va làm

sạch thêm bằng cách sử dung phương pháp xử kháng sinh lysozyme dé loại bỏ các tạpchất gây ô nhiễm vi khuân từ các môi trường nuôi cấy Các khuẩn tảo sau khi được

phân lập bằng micropipette được đặt trong canh trường Luria Bertani có bổ sung

lysozyme (20 lg / mL) và hỗn hợp khang sinh (cefotaxime-500 Ig / mL và tetracycline

50 Ig / mL) trong 24 giờ ở 370C, Tế bao sau đó được chuyên vao môi trường BGII vả

tiếp tục nuôi cấy trong 15 ngày ở 250C dưới ánh sáng trắng liên tục

Bang 2 2.Thanh phần môi trường BG11

Thanh phan chính Stock - Thanh phan chinh

2 Ca(NO›)› 4H2O 100,00 g/L 9.1 Nas EDTA 2H20 | 4.36g/L

2.3.3 Phương pháp tách chiết DNA

Tách chiết DNA được thực hiện bằng bộ KIT Plant DNA extraction của công ty

ABT, có điều chỉnh đẻ phù hợp với đối tượng vi tảo lục.

Thanh phan bộ kit.

Bang 2 3.Thanh phan bộ kit Plant DNA extraction

uy cach

PLSI buffer 25 mL

PLS2 buffer 10 mL

1 Cho khoảng 500 mg mẫu tảo vào tube 1,5 mL Nghién mẫu bằng chảy

cho đến khi nát mẫu.

2 Thêm 400 pL PLS1 buffer vào tube 1,5 mL chứa mẫu ở trên Cho tiếp 10

uL Rnase A vào, vortex đều và ủ 65°C trong 60 phút Vortex thường xuyên trongquá trình ủ.

3 Cho 130 pL PLS2 bufffer vào, trộn đều va ủ 2-8°C trong 20 phút.

4 Ly tâm ở tốc độ 13000 rpm trong 5 phút Hút dịch nổi chuyên sang tube

1.5 mL mới Thêm vào PBB bufffer ương đương 1,5 lần thé tích dịch nỗi vortex

đều

5 Chuyên hỗn hợp sang cột sillica đặt sẵn trong tube 2 mL (tối đa 600 uL).

Ly tâm ở tốc độ 13000 rpm trong | phút Giữ lại cột và loại bỏ phan chat long

bên dưới Lặp lại với phần hỗn hợp còn lại.

6 Dat lại cột vào tube 2 mL cũ Thêm 500 pL PWB (pha trong ethanol tí lệ

3:7) và ly tâm ở tốc độ 13000 rpm trong 1 phút Lap lại bước nay 1 lần nữa

7 Dat lại cột vào tube 2 mL cũ Lam khô cột bằng cách ly tâm ở tốc độ

13000 vòng trong 1 phút.

§ Chuyên cột sang tube 1.5 mL mới Thêm 50 pL EB buffer vả ú một phút

ở nhiệt độ phòng Ly tâm ở tốc độ 13000 rpm trong | phút, thu phan dịch chứa

DNA bên dưới.

9.DNA được sử dung ngay hoặc bao quản ở -20°C

Chất lượng của DNA tổng số được phân tích bằng phương pháp điện di trêngel agarose 1% có nhuộm với EtBr lug/mL Điện đi được thực hiện trong 45 phat,

hiệu điện thế 100 V trong dung dich TBE 1X va sử dung thang DNA chuẩn Ikb của

Bio Basic Inc Ban gel được quan sát trên ban ánh sáng UV và chụp hình đề lưu trữ

2.3.4 Phương pháp điện di trên gel agarose 1%

Bước 1: Đô gel: Cân 0,6 g agarose cho vào bình tam giác 250 mL, thêm 60 mL

dung dịch TBE LX Lắc nhẹ cho agarose hòa lẫn với dung địch đệm Dat bình tam giác

vào lò vi song dun khoảng 2 - 3 phút Dung dịch bên trong sôi lên và trở thành mau

trắng trong Lấy bình tam giác ra, đợi 15 phút khi chạm vào thấy vừa nóng (60°C) thì

thêm 1,5 ug/ mL ethidium bromide lắc bình tam giác và đồ nhẹ dung địch vào khuôn

điện di Chờ khoảng 20 phút đê agarose đặc lại [23]

Bước 2: Chay gel: Lay nhẹ lược ra dé không làm rach gel và các giéng rồi dat

khuôn vào bẻ điện di Thêm dung dich đệm TBE 1X phủ mặt gel Tra mẫu vào giếng:DNA với tỷ lệ 5 wL được trộn với 3 wL Tag Premix 2X (cho thê tích 8 wL) và tra vào

các giếng trên gel [23].

2.3.5 Phương pháp PCR trình tự 188 và ITS

Thành phần phản ứng PCR

Phân tử DNA được khuếch đại bằng phản ứng PCR với 2 marker phân tứ được

sử dụng là gene mã hóa RNA ribosome 18S và vùng ITS với các cặp mdi được thé hiện

ở bảng 2.3, dé khuếch đại phản ứng PCR can các thành phan trong bang 2.4 và chạy

chu trình nhiệt ở trong bang 2.5 và 2.6 đưới đây:

Bang 2.4 Cặp mdi sử dụng dé khuếch đại phản ứng PCR các mẫu chủng tảo

pmol/ pL)

Tông thé tích | t

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Bảng 2.6 Chu trình nhiệt khuếch đại vùng ITS của phản ứng PCR.

Giai đoạn Nhiệt độ Thời Chu

Tiên biên

tính

Biên tính

nhuộm với EtBr |] pg/ mL Điện đi được thực biện trong 45 phút, hiệu điện thế 100 V

trong dung dịch TBE 1X và sử dụng thang DNA chuẩn Ikb của Bioline Bản gel được

quan sát trên bản ánh sáng UV vả chụp hình dé lưu trữ.

2.3.6 Phương pháp giải trình tự vùng ITS và vùng 18S và hiệu chỉnh trình tự

của các mẫu tảo

a) Giải trình tự sản phẩm PCR

San phẩm PCR sau khi được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% có kết qua

vạch DNA sáng rõ sẽ được gửi đi giải trình tự hai chiều (chiều xuôi và chiều nược)

bằng phương pháp Sanger tại công ty Ist Base — Malaysia Kết quả giải trình tự được

so sánh với các trình tự tương đồng trên NCBI

b) Hiệu chính trình tự

Sau khi có được kết quả giải trình tự, các trình tự sẽ được hiệu chỉnh theo cácbước sau:

Loại bỏ những tín hiệu không chính xác ở hai đầu trình tự khảo sát: các tín hiệu ở

đầu và cuối trình tự thường có đỉnh (peak) không rõ ràng trong một số trường hợp tín

hiệu rất thập và không thể phân biệt rõ ràng các đỉnh tín hiệu Việc đọc basc ở vùng

này không bao đảm độ tin cậy và cần phải được loại bỏ bằng phần mèm FinchTV 1.4.0.

Kiểm tra các sai lệch giữa hai kết quả giải trình tự:

- Sử dung tinh năng Reverse — complement có trong phần mềm FinchTV 1.4.0 đề

đổi chiều của trình tự giải bằng mỗi ngược Kết quả giải trình tự nucleotide cần được đối chiếu va so sánh giữa kết quả giải bằng mỗi xuôi va mdi ngược Thao tác nảy giúp

giảm thiêu việc đọc sai base, những tín hiệu không rõ ràng trong trình tự khi đọc với

môi xuôi có thé được giải quyết trong khi đọc kết qua với mdi và ngược lại

- Sử dụng tính năng Dot plot có trong phần mềm SeaView 4.5.4 để kiểm tra mức

độ tương đồng vả tìm sai lệch giữa hai kết quả giải trình tự Hai trình tự sau khi được

sắp xếp gióng cột cần phải tương đồng nhau, những sai lệch thu được cho thấy các sai

sót trong khi đọc base bằng máy tự động và cân được kiểm tra trực tiếp lại trên biêu đồ

phát huỳnh quang dé lựa chọn kết qua đáng tin cậy

- Tạo trình tự đồng nhất: sử dụng tinh năng Consensus sequence có trong phan

mém SeaView 4.5.4 dé tạo trình tự nucleotide đông nhất từ hai kết quả giải trình tự của

môi xuôi và môi ngược

co) Phương pháp phân tích trình tự

Tiên hành so sánh các trình tự mới với các trình tự đã được công bo trên NCBIbằng công cụ BLAST trên NCBI Kết quả giải trình tự được so sánh sự khác nhau về vị

trí các nucleotide giữa các cặp loài bằng phan mém SeaView 4.5.4.

2.3.7 Phương pháp đánh giá kết qua tìm kiếm BLAST

Sau khi hoàn thành việc tra cứu BLAST, kết qua sẽ được đánh giá có phù hợp đẻ

định danh loài chính xác hay không Nếu mức độ trùng khớp (khi sử dụng trình tự ITS)

giữa trình tự của các loài được giải trình tự trong khóa luận nảy và trình tự được công

bố là 99,0% trở lên, tên loài được sử dụng Nếu sự giống nhau nhỏ hơn 99,0% vả lớn

hơn hoặc bằng 98,0%, chủng trong nghiên cứu này và chủng đã được công bố không

chắc chan thuộc cùng một loài, khi đó sẽ sử dụng kí hiệu “cf.", như trong Chlorella ef.

Vulgaris, Chữ viết tắt “ef.” về cơ bản có nghĩa là “so sánh với” và chỉ ra sự không chắcchắn của nhận dạng Nếu sự trùng khớp các chuỗi nhỏ hơn 98,0%, sử dụng kí hiệu

“sp.”, như trong Chlorella sp [14].

2.3.8 Phương pháp làm tiêu bản

Chúng tôi thực hiện bộ tiêu bản theo như phương pháp làm tiêu ban có định một

số loài vi khuẩn lam của Phan Thị Trúc Linh (2009), trong quá trinh thực hiện sẽ điều

chỉnh quy trình dé phù hợp với đỗi tượng vi tảo [7]

a) Chuẩn bị

Chuẩn bị mẫu: Mẫu vi táo sau khi được làm sạch được cô định trong các lọ trữ

mẫu với dung địch formol 5%.

Chuẩn bị hóa chất:

® Dung dịch định hình formol 5%: dé được 100 mL dung dich formol 5%,

ta cho 5 mL formol vào 95 mL nước cat

e Thuốc nhuộm xanh methylene 1%

s Dung dịch ethanol ở các nông độ can pha: cho ethanol tuyệt đối vào ống

đong 250 mL, tha ethanol kế vào và thêm nước cất cho đến khi ethanol kế nỗi

ngay vạch chi nông độ ethanol can pha Các nồng độ ethanol can sử đụng tăng

dân như sau: 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, cthanol

tuyệt đối (99,59%).

e Dung dịch buthanol trong ethanol tuyệt đối: lượng Buthanol và ethanol

tuyệt đối đẻ pha các dung dịch có nông độ can thiết theo bảng sau:

Bang 2.8 Lượng butanol và ethanol tuyệt đối dé pha các dung dich butanol

Canada pha trong butanol: cho baum canada và butanol vào bình tam giác

250 mL với tỉ lệ 1:1, dùng đũa khuấy cho baum canada tan hết rồi lọc bằng

giấy lọc, cho dung dich trên vào tủ sấy ở 70oC đến khi dung dịch trong suốt

(khoảng 30 phút).

® Dung dịch rửa lame và lamelle: cho bột bicromate kali vào nước cất với

tỉ lệ bicromate kali : nước cat = 1:10, Dùng đũa khuấy cho bột bicromate kali tan hết Thận trọng va từ từ thêm vảo | lượng sulphuric acid đậm đặc bằng

với lượng bicromate kali.

Chuẩn bị lame và lamelle: ngâm lame vả lamelle trong dung dich rửa lame va lamelle Khoảng 24 giờ sau vớt lame và lamelle ra rửa bằng nước cho hết màu vàng của Bicromate kali rồi cho vào tủ say để séy khô Mục đích của bước này là dé cho

lame va lamelle được sạch và trong trước khi chúng ta thực hiện tiêu bản.

b) Thực hiện tiêu bản cỗ định

Qui trình tổng quát gồm các bước cơ ban sau:

Bước 1 Định hình và nhuộm: mẫu vi tảo sau khi được làm sạch vi tảo được cho

Erlen dé định hình và nhuộm bằng dung xanh methylene 1% theo tí lệ tương đương |

phan vi tảo và 3 phan dung dịch xanh methylene 1% Thời gian nhuộm mẫu tôi thiểu là

Thao tác khử nước với ethanol: dựng nghiêng các lame đã dán mẫu vào các cốc

thủy tinh 100 mL có cthanol ở nông độ thấp đến cao, sau thời gian xác định, chuyển

lame nay lần lượt sang các nông độ ethanol tăng dan.

Thao tác khử nước với dung địch Butanol: dùng ống nhỏ giọt hút Butanol va nhỏ

lên lame ở vị trí đã trãi mẫu, sau thời gian xác định, nghiêng lame cho dung dịchButanol chảy vào châu hứng Thao tác tương tự lần lượt cho các nông độ tăng dan

10 20 [30 [40 [50 [60 [70 | 80 [90 Nong độ cthanol và | 5

buthanol (%)

Thời gian (giây)

Bảng 2.9.Thời gian khử butanol và ethanol ở các nồng độ khác nhau.

Bước 4 Dán mẫu: Ding đũa thủy tỉnh nhúng vào dung địch Baum Canada rồinhỏ một giọt Baum Canada ngay vùng có mẫu đã được dán trên lame, tiễn hành đậylamelle lại như khi thực hiện tiêu bản tạm thời Khi đậy lưu ý tránh tạo thành bọt khí vả

điều chinh cho lamelle nam cân đỗi và ngay ngắn trên lame Dé tiêu bản vào mâm đựng

tiêu ban vả chờ cho Baum Canada khô tự nhiên (khoảng Š ngày) hay cho vào ta sấy ở

40° C - 50° C Baum Canada phải cứng lại trước khi đem tiêu ban quan sat dưới kính

hiển vi.

Bước 5 Dán nhãn: có thé dùng gòn quan quanh đầu kim mii giáo hoặc tăm bông

thấm Butanol lau sạch Baum Canada tràn ra ngoai lúc đậy lamelle Quan sát dé chon

những tiêu bản dat yêu cầu như: sạch sẽ, ít lẫn tap chất, không bot khí, vi mẫu bắt mau

thuốc nhuộm và đàn mỏng, tế bào ít bị co, Dán nhãn cho biết tên giống và thời gian

thực hiện tiêu bản Các tiêu ban sau khi đán nhãn xong nên cho vào hộp đựng tiêu bản

dé bao quản

thực hiện

CHƯƠNG 3: KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KET QUÁ NUOI CÁY VI TAO DON DONG

3.1.1 Kết quả cấy trải vi tảo trên dia thạch

Các mẫu tảo nhận từ phòng sinh học trung tâm có hình thái đồng nhất và chưa

đồng nhất Quan sát dưới kính hiền vi thay ton tại 2 hình thái khác nhau trong một mẫu.

Vì vậy chúng tôi tiến hành cay trải toàn bộ các mẫu trên dia thạch dé thu được các mau

tảo đơn dòng.

Chúng tôi sử dụng phương pháp cay trải trên thạch agar của Amos Richmond [6].

Trong quá trình nuôi cấy nhận thay các chủng vi tảo đều có thẻ phat triển tốt trên bè

mặt thạch và trong môi trường BG11 Các khuân lạc tảo nhỏ sẽ bắt đầu xuất hiện sau 1

tuần và lớn dan, 2 tuần 1a khoảng thời gian tốt để chuyên các khuân lạc tảo đạt yêu cầu

as £

sang erlen nudi cay.

(A Hình anh các loại tao sau cay trén bé mặt thạch được đặt trong môi trường

chiều sáng liên tục; B Hình ảnh các khuân lạc tảo đạt yêu cau, quan sat dưới kính hiền

vi x4.)

Các khuân lạc tảo nằm đơn lẻ, không nhiễm vi sinh vật, được chuyên vào bình nuôi cay chứa BGII, đặt trong điều kiện chiếu sáng liên tục sinh trưởng tốt Có thé quan sát thấy các erlen sẽ bat đầu xuất hiện màu xanh sau 2 tuần nuôi cấy Kiểm tra kết

quá dưới kính hiên vi, quan sát thấy hau như các ching tao đều đạt yêu cầu Hình dang

tế bào đồng nhất Từ đó thay được việc sử dụng phương pháp cấy trên bề mặt thạch để

phân lập các chủng tảo lục đạt hiệu qua cao hơn phương pháp pha loãng va bat tế bảo

đơn, nhưng phương pháp này cũng có rủi ro là không biết được chính xác hình thái của

nN nn

các chủng tảo ở bước chon lọc khuân lac tảo, mà chi có thé kiểm tra sau bước tăng sinh

trong erlen Như vậy sẽ có thé chủng đã được phân lập không đúng với mục đích banđâu.

Hình 3.2 Hình anh bình nuôi tao sau 1 tháng nuôi cấy tăng sinh.

Từ 5 mẫu tảo không đồng nhất ban đầu phân lập được 6 chủng tảo có hình thái

khác nhau, đa số có kích thước nhỏ từ 2 - 10 um

3.1.2 Các chúng tao đã nuôi cây đơn dòng thành công

Sau khi nuôi cây thanh công các chúng đơn dong chúng tôi tiến hành đặt mã số

cho chúng là: CHO1, CH02, CH03, CH04 CH05, CH06 dé tránh sự nhằm lẫn giữa các

mẫu trong quá trình nghiên cứu tiếp thco.

3.1.2.1 Ching vi tao CHOI

Mẫu tao CHOI có hình clip, sông đơn lẻ hoặc thành từng cụm 2 đến 4 tế bao, lục

lap chiếm vị tri gần hết tế bao và có 1 pyrenoid lớn nằm lệch về một phía, sinh sản

bằng hình thức phân đôi Kích thước tế bào: chiều ngang 3-6um, chiều rộng 4-7um.

3.1.2.2 Chúng vi tio CH02

3.4.Hình ảnh chủng tio CH02 chụp dưới kính hiên vi x100.

Mau tảo CH02 có hình lưỡi liềm, dị cực, một đầu tròn đầu còn lại nhọn hơn, sống

đơn lẻ, không thấy sự hiện diện của pyrenoid Kích thước tế bảo 3-10um.

3.1.2.3 Chủng vi tảo CH03

Hình 3.5.Hinh ảnh chúng tảo CH03 chụp dưới kính hiển vi x100.

Mẫu tảo CHO3 có hình elip, sống đơn lẻ hoặc thành từng cum 2 đến 4 tế bào, lục lap chiếm vị trí gần hết tế bao và có | pyrenoid lớn nằm lệch về một phía, sinh sản

bằng hình thức phân đôi Kích thước tế bào: chiêu ngang 3-6um, chiều rộng 4-7um.