DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài “Khảo sát thành phần hợp chất và khả năng bảo quản nước mía của dịch chiết cây Rau mèo (Orthosiphon aristatus)” được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 03 năm 2023 đến tháng 07 năm 2023, tại phòng Nghiên cứu dược liệu và cây dược liệu (BIO 309), Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu nghiên cứu 3.2.1. Vật liệu
Cây Râu mèo hoa trắng được thu hái tại tỉnh Đồng Tháp, vào thời điểm cây bắt đầu ra hoa. Tại thời điểm này hàm lượng các hợp chất trong cây đạt cao nhất.
Cây Râu mèo (lá và thân) sau khi thu hái sẽ được loại bỏ lá úa vàng và rửa sạch.
Tiến hành phơi khô ở nhiệt độ dưới 60°C đến độ 4m nguyên liệu dưới 12% theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV.
Mẫu bột lá Mấu bột thân
Hình 3.1. Mẫu bột lá và thân sau khi xay 3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Nội dung 1: Xác định độ ẩm và hiệu suất chiết của mẫu thân, lá cây Râu mèo ở các nồng độ ethanol 40%, 60% và 80%
3.3.1.1. Độ 4m bột nguyên liệu
Độ âm của bột nguyên liệu được xác định bằng phương pháp cân khối lượng không đối (theo TCVN 1867:2001). Cốc cân được rửa sạch, đánh số, mở nắp và cho vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 105°C trong 1 giờ. Sau đó, đậy nắp cốc cân và chuyên vào
bình hút 4m có silica gel dé làm nguội đến nhiệt độ phòng. Cân 2 g nguyên liệu cho vào cốc cân, sau đó cân khối lượng tổng hợp. Tiếp theo cho vào tủ sấy, mở nắp và say ở 105°C. Cứ sau 2 giờ cân lại 1 lần. Cân đến khi mẫu thử đạt khối lượng không đổi sẽ tính được độ âm bột nguyên liệu. Kết quả độ âm bột nguyên liệu được thê hiện bởi giá trị trung bình của 3 lần lặp lại + SEM và được phân tích bằng phần mềm Minitab 16.
Cây Râu mèo | —> | Thu hái, rửa sạch | —3 | Phơikhô |—>| Xay
| Sau 2 giờ cõn 1 lần | <—| Sấy 105°C <CÍ Can vio cúc |ô—| Mau bot
Hình 3.2. Quy trình xác định độ ẩm bột.
Độ âm của mẫu thử, tính bằng phan trăm theo công thức (TCVN 1867:2001):
_ Mị —m;
H% = ——— x 100
m
Trong đó:
H: Độ ẩm của mẫu thử (%);
mi: Khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy (g);
ma: Khối lượng cốc và mau sau khi sấy (8);
m: Khối lượng mẫu thử trước khi sấy (g).
3.3.1.2. Quy trình chiết xuất hợp chất
Mau lá, thân của cây Rau mèo được chiết xuất bằng phương pháp ngâm dam trong dung môi ethanol ở các nồng độ 40%, 60% và 80% theo tỉ lệ 1:10 (1 g mẫu với 10 ml dung môi). Ngâm ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Dịch chiết được lọc bằng giấy lọc Whatman. Bả mẫu bột được thu hồi và chiết tiếp lần 2 trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Gộp dịch lọc sau hai lần chiết đem đi cô cách thủy để đuổi dung môi ở nhiệt độ dưới 60°C. Quy trình chiết xuất được thé hiện trong Hình 3.3, dựa trên tiêu chuẩn Việt Nam V, phụ lục 12.10 và “Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ” của Nguyễn
Kim Phụng.
10
Ngâm trong ethanol 40%, 60%, 80%
) 22giờ
Dịch chiết Ba mau bột
Ngâm trong ethanol
24 giờ
| Cô cách thủy Ì < 60°C
Hình 3.3. Quy trình chiết xuất hợp chat.
3.3.1.3. Hiệu suất chiết cao
Hiệu suất chiết (E%) là tỉ số giữa tổng lượng cao thu được với tông khối lượng mẫu ban đầu. Mẫu dịch chiết được cho vào bình tam giác đã biết trước khối lượng.
Dịch chiết được cô cách thủy đề loại bỏ dung môi cho đến cắn, sấy cắn ở điều kiện 50°C đến khối lượng không đổi. Dé nguội trong bình hút âm và ghi nhận khối lượng dé xác định hiệu suất chiết (Hình 3.4). Kết quả về hiệu suất chiết xuất được phân tích bằng phần mềm Minitab 16.
1]
Hiệu suất chiết được xác định theo công thức (Nguyễn Thị Linh Tuyền và ctv,
2019):
(m¡ — mạ) X (100 —X)
pm = mx(00-H) X 60% =
Trong đó:
E: Hiệu suất chiết (%);
mo: Khối lượng bình rong (g);
mi: Khối lượng bình và cắn sau khi say ở 50°C (g);
m: Khối lượng mẫu khô (g):
X: Độ âm cao chiết;
H: Độ am mẫu thử.
- < 60°C -
Dịch chiết I—>{ Cô cách thủy | ——>
Vv
Say 50°C
Ỳ
Hiệu suất chiết cao <—_| Khối lượng không đôi |
Vv
Say 105°C
Vv
| Sau 3 giờ cân 1 lần |
Ụ
Độ âm cao chiét
Hình 3.4. Quy trình xác định hiệu suất chiết cao và độ âm cao chiết.
3.3.1.4. Độ Am cao chiết
Theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 12.16. Độ 4m cao chiết được xác định bằng phương pháp sấy, thông qua cân khối lượng mẫu sau khi sấy so với khối lượng mẫu ban đầu.
Dịch chiết sau khi được cô cách thủy dé đuổi dung môi cho đến cắn và sấy cắn ở 50°C dé xác định hiệu suất chiết. Thì tiếp tục sấy ở nhiệt độ 105°C trong 3 giờ. Lay ra
12
để nguội trong bình hút âm có chất hút ẩm silica gel. Cân, làm lại nhiều lần đến khi trọng lượng giữa 2 lần cân không đổi (Hình 3.4). Kết quả độ 4m cao chiết được thé hiện bởi giá trị trung bình của 3 lần lặp lại + SEM.
Độ am của cao chiết được tính theo công thức:
X% = —— x 100
m¡ — mạ
Trong đó:
X: Độ âm cao chiết (%);
mo: Khối lượng bình rong (g);
my: Khối lượng bình và can sau khi say ở 50°C (g);
mạ: Khối lượng bình và cao sau khi say 6 105°C (g).
3.3.2. Nội dung 2: Xác định hàm lượng polyphenol, flavonoid và khảo sát hoạt tính sinh học trong cây Rau mèo
3.3.2.1. Xác định hàm lượng polyphenol bằng phương pháp quang phổ
Hàm lượng polyphenol được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 765 nm, chất chuẩn là gallic acid (Cat#149-91-7,Merck).
Xây dựng đường chuẩn: 100 mg gallic acid được hòa tan trong methanol : nước cat
(50: 50 v/v) (Cat#67-56-1, Xilong) va pha loãng thành 100 mL thu được dung dich stock
gallic acid có nồng độ 1 mg/mL. Đường chuẩn gallic acid được đo ở các dãy nồng độ từ
0,05 - 0,25 mg/mL.
Phản ứng hiện màu: Hút 0,5 mL dung dịch chuẩn đã pha loãng trong dãy nồng độ (0,05 - 0,25 mg/mL) lần lượt vào các ống nghiệm có đánh sé thứ tự từ 0 - 5, thêm vào 5 mL thuốc thử Folin - Ciocalteu (tỷ lệ 1:10 trong nước cất) (Cat10900101000, Merck), sau đó cho 4 mL dung dịch NazCOs 1M (Cat497-19-§, Merck) vào, lắc đều và dé ôn định ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Do độ hap thụ quang của dãy nồng độ ở
bước sóng 765 nm.
Chuẩn bị địch chiết: Cõn 3 ứ mẫu lỏ hoặc thõn cho vào bỡnh tam giỏc cú dỏn nhón (lá, thân), lần lượt thêm vào 30 mL dung môi ethanol ở các nồng độ 40%, 60% và 80%, ngâm trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Dich chiết được lọc qua giấy lọc Whatman, bả được thu hồi và tái chiết lần 2. Thực hiện phản ứng hiện màu với thuốc thử Folin - Ciocalteu và NazCOa. Hàm lượng polyphenol được biểu diễn theo mg đương lượng
là
gallic acid trong một gram mẫu khô kiệt (mgGAE/g) (Faramayudal và ctv, 2022;
Pourmorad va ctv, 2006).
Mau trang: methanol : nước cất, Folin — Ciocalteu, NaxCO3 1M.
Hàm lượng polyphenol tổng số trong mẫu thử (Nguyễn Thanh Nho va ctv, 2021):
_CxVxFx 100
~ mx (100 — H)
TPC
Trong đó:
C: Nong độ gallic acid ngoại suy từ đường chuẩn (mg/mL);
V: Thể tích mẫu thử (mL);
F: Độ pha loãng:
m: Khối lượng mẫu khô (g);
H: Độ am mẫu thử (%);
TPC: Hàm lượng polyphenol tổng số của mẫu thử (mgGAE/g).
3.3.2.2. Xác định hàm lượng flavonoid bằng phương pháp quang pho
Hàm lượng flavonoid được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 415 nm, chất chuẩn là quercetin (#Cat90-18-6, Merck).
Xây dựng đường chuẩn: Cân 10 mg chất chuẩn quercetin, hòa tan trong ethanol 80%
(#Cat64-17-5, Xilong) và pha loãng thành 100 mL thu được dung dịch stock quercetin
có nồng độ 0,1 mg/mL. Đường chuẩn quercetin được đo ở các dãy nồng độ từ 0,02 —
0,1 mg/mL.
Phản ứng hiện màu: Hút 0,5 mL dung dịch chuẩn đã pha loãng trong dãy nồng độ (0,02 — 0,1 mg/mL) lần lượt vào các ống nghiệm có đánh số thứ tự từ 0 - 5, thêm vào 1,5 mL ethanol 95%. Sau đó cho 0,1 mL AICI; 10% (Cat#7784-13-6, Xilong) vào, hỗn hop được thêm 0,1 mL CH:COOK 1M (Cat#127-08-2, Xilong) và 2,8 mL nước cat, lắc đều rồi để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Do độ hap thụ quang của day nồng độ ở bước sóng 415 nm.
Chuẩn bị địch chiết: Cõn 3 ứ mẫu lỏ hoặc thõn cho vào bỡnh tam giỏc cú dỏn nhón (lá, thân), lần lượt thêm vào 30 mL dung môi ethanol ở các nồng độ 40%, 60% và 80%, ngâm trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết được lọc qua giấy lọc Whatman, bả được thu hồi và tái chiết lần 2. Thực hiện phản ứng hiện màu với AIC] và CH:COOK. Do độ hấp thu quang ở bước sóng 415 nm. Kết qua hàm lượng flavonoid
14
được biểu diễn theo mg đương lượng quercetin trên một gram mẫu khô kiệt (mgQE/g)
(Chang và ctv, 2002; Faramayuda và, 2022).
Mẫu trắng: ethanol, AICl: 10%, CH:COOK 1M và nước cat.
Hàm lượng flavonoid tổng số trong mẫu thử (Nguyễn Thành Nho và ctv, 2021):
_CxVxFx 100
~ mx (100 — H)
TFC
Trong đó:
C: Néng độ quercetin ngoại suy từ đường chuẩn (mg/mL);
V: Thể tích mẫu thử (mL);
F: Độ pha loãng:
m: Khối lượng mẫu khô (g):
H: Độ âm mẫu thử (%);
TFC: Hàm lượng flavonoid tổng số (mgQE/g).
3.3.2.3. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH
Nguyên tac: DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là một gốc tự do bền, có màu
tím và có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517 nm. Khi có mặt chất chống oxi hóa, nó
sẽ bị khử thành 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH - H), có màu vàng. Quá trình
thay đổi từ màu tím sang màu vàng của DPPH khi có mặt chất chống oxy hóa là do electron tự do cua sốc DPPH bắt cặp với một electron từ chất chống oxy hóa và một nguyên tử hydro dé tạo thành DPPH - H khử. Kết quả của sự khử màu tương đương với lượng nguyên tử hydro được giữ lại trong DPPH - H. Do mức giảm độ hap thu ở bước sóng 517 nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxi hóa (Bùi
Thị Km Lý và ctv, 2021).
Mẫu bột lá, thân Râu mèo được chiết với ethanol ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ và chiết 2 lần. Mẫu dịch chiết thu được sẽ tiến hành cô cách thủy và sây ở 50°C để thu lay cao chiết. Pha loãng cao chiết trong methanol(Catf/67-56-1, Xilong) thành các day nồng độ 50 - 250 g/mL. Dung dịch DPPH 0,6 mM (Cat#1898-66-4, Merck) được pha
trong methanol.
Mẫu đối chứng dương: Ascorbic acid (Cat#50-81-7, Merck) được pha trong nước cất tới các day nồng độ từ 20 - 100 pg/mL.
Quy trình: Cho 0,5 mL dung địch thử vào các ống nghiệm (được đánh số thứ tự từ 0 - 7) có sẵn 3 mL methanol, cho tiếp 0,5 mL dung dịch DPPH 0,6 mM. Hỗn hợp
15
được ủ trong tối ở nhiệt độ phòng 30 phút và đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 517 nm (Đỗ Văn Mãi và ctv, 2017; Chanda và Dave, 2009).
Mẫu đối chứng thay dung dịch thử bằng methanol, mẫu trắng chỉ chứa methanol.
Hoạt tính chống oxy hóa được tính theo công thức:
OD, — OD,
HTCO = (——) x 100
OD, Trong đó:
HTCO: Hoạt tính chống oxy hóa (%);
OD:: Độ hap thụ quang của mẫu thử;
OD.: Độ hấp thụ quang của đối chứng.
Từ kết quả tính được và nồng độ mẫu, xây dựng được phương trình với y là phần trăm hoạt tính chống oxy hóa, x là nồng độ mẫu thử nghiệm. Thay giá trị y = 50, tính được giá trị ICso, ICso là giá trị biểu thị nồng độ cần thiết dé khử 50% gốc tự do DPPH.
Giá trị ICso của dich cao chiết mẫu sẽ được so sánh với giá trị ICso của chất chuẩn ascorbic acid. Giá trị ICso càng thấp tương ứng với hoạt tính kháng oxy hóa càng cao và ngược lại. Thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần, kết quả được phân tích bằng phần mềm Minitab 16.
3.3.2.4. Đánh giá khả nang kháng Staphylococcus aureus và Escherichia coli
Khao sát khả năng khang Staphylococcus aureus va Escherichia coli của cao
chiết bằng phương pháp khuéch tán đĩa giấy của Kirby — Bauer.
Chuẩn bị mẫu thử: Mẫu nguyên liệu ban đầu được chiết với ethanol trong 24 giờ, lặp lại 2 lần. Lọc lấy dịch chiết và cô cắn thu cao chiết. Phần cao chiết được hòa tan trong nước cất đến các nồng độ khảo sát là 300, 600, 900 mg/mL.
Chuẩn bị dung dịch 0,5 McFarland: hút 0,05 mL dung dịch BaCl; 1%
(Cat#10326-27-9, Xilong) vào ống nghiệm chứa 9,95 mL dung dịch H;aSO¿; 1%
(Cat#7664-93-9, Duchefa), vortex đều. Kiểm tra độ đục bang máy do OD ở bước
sóng 625 nm, giá trị OD625 phải đạt từ 0,08 - 0,1.
Chuẩn bị các chủng vi sinh: các chủng vi sinh vật gồm S. aureus, E. coli được
hoạt hóa trong 10 mL môi trường LB lỏng (Phụ lục 3) ở nhiệt độ phòng sau 24 - 48h.
Sau thời gian hoạt hóa tiến hành ria các chủng vi sinh vật lên các đĩa môi trường thạch, ủ ở 37°C. Khi khuẩn mọc đều tiến hành thí nghiệm. Dùng que cấy vòng bắt khuẩn lạc đơn cho vào ống nghiệm chứa 10 mL NaCl 0,9% (Cat#7647-14-5, Xilong) đã được
16
hấp khử tring, vortex đều, so sánh và điều chỉnh độ đục tương đương với chuẩn McFarland. Mật độ vi sinh vật trong ống nghiệm rơi ở khoảng 108 CFU/mL. Điều chỉnh độ đục bằng cách thêm vào sinh khối vi sinh hoặc nước muối sinh lý để có mật độ cần khảo sát.
Ngâm đĩa giấy whatman trong dung dịch chứa mẫu và kháng sinh trong 20 phút.
Hút 100 uL dịch khuẩn cho vào các đĩa môi trường LB agar đã chuẩn bị trước, dùng que cấy trang vô trùng trải đều trên đĩa chờ đặt đĩa giấy khuếch tán. Dùng kẹp gap đã hơ nóng đỏ, để nguội để gắp các đĩa giấy gồm mẫu, đối chứng âm và đối chứng dương đặt lên bề mặt môi trường LB agar tất cả được thực hiện trong điều kiện vô trùng, ủ ở 37°C trong 24 giờ. Thực hiện thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đọc kết quả và xác định đường kính kháng khuẩn.
Chứng dương: Amoxicillin 0,1% (#Cat26787-78-0, Merck).
Chứng âm: Nước cat.
3.3.3. Nội dung 3: Thử nghiệm bảo quản nước mía ở nhiệt độ phòng và 4°C
Mẫu nước mía được thanh trùng bằng nhiệt ở 72°C trong vòng 15 giây (Vũ Kim Dung và ctv, 2020). Cao chiết sau khi loại dung môi được hòa tan với nước cất vô trùng và bổ sung vào mẫu nước mia để đạt nồng độ khảo sát là 300 mg/mL và 600 mg/mL.
Quá trình thử nghiệm sẽ theo dõi các chỉ tiêu về pH và đếm tổng vi khuẩn hiếu khí (theo TCVN 8275-1:2010 (ISO 21527-1:2008)) ở 0, 2, 4 và 6 ngày trong điều kiện bảo
quản ở nhiệt độ phòng và 4°C. Quá trình thử nghiệm mô ta trong Hình 3.5.
Bảng 3.1. Thử nghiệm khả năng bảo quản nước mía ở nhiệt độ phòng và 4°C
Mẫu Nông độ mg/mL Nhiệt độ (°C)
1 0 Nhiệt độ phòng 2 300 Nhiệt độ phòng 3 600 Nhiệt độ phòng 4 0 4
5 300 4 6 600 4
Nhiệt độ phòng dao động từ 29,3 — 30,2°C (do nhiệt độ tại 3 thời điểm 9h, 13h và 16h trong
ngày).
Vi
giữ 15 giây
Bao quan ở 4°C va nhiệt độ phòng
| Thanh trùng ở 72°C |
Ngày 0, 2, 4, 6
Dém vi khuẩn hiếu khí
TCVN 8275-1:2010 (ISO 21527-1:2008)
Hình 3.5. Quá trình thử nghiệm kha năng bảo quan nước mía.
3.3.3.1. Xác định độ pH
Bằng cách sử dụng máy đo pH. Độ pH của nước ép trong quá trình bảo quản giảm là đo các vi sinh vật dần xuất hiện và có thé dẫn đến hư hỏng nước ép.
3.3.3.2. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn hiếu khí
Quy trình:
Hút 10 mL mẫu cho vào bình tam giác chứa 90 mL SPW (Phụ lục 3). Lắc đều, thu được dung dịch mẫu ở 10'!. Hút 1 mL mẫu thử cho vào 9 mL SPW được 102 tiếp tục dé được các nồng độ pha loãng 103 10“ 10°. Hút 0,1 mL mẫu cấy trang lên đĩa môi trường PCA (Phụ lục 3). Ủ ở 30°C trong 48 - 72 giờ. Chọn những đĩa có số khuẩn lạc khoảng 25 - 250 đề đếm.
N
n1ixVxf1+t..+nixVxfi Trong do:
A: số tế bao (đơn vị hình thành khuẩn lạc) trên ImL mẫu (CFU/mL);
N: tông sô khuân lạc đêm được trên các đĩa đã chọn;
18
ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i;
V: thể tích dịch mẫu (mL) cấy vào trong mỗi đĩa;
fi: độ pha loãng tương ứng.
3.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu thập được sẽ được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 va phần mềm Minitab 16. Đọc kết quả dựa vào bang ANOVA, bảng trung bình và so sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức bằng phương pháp Tukey’s test.
19