Xác Định hàm lượng stearoyl lactylate trong một số thực phẩm có nguồn gốc từ tinh bột bằng phương pháp sắc ký

Xác Định hàm lượng stearoyl lactylate trong một số thực phẩm có nguồn gốc từ tinh bột bằng phương pháp sắc ký

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1 PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo

2 PGS.TS Nguyễn Thị Ánh Hường

Hà Nội - 2024

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo

và PGS.TS Nguyễn Thị Ánh Hường đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn em trong

quá trình nghiên cứu, tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô giáo tại bộ môn Hóa Phân Tích và Khoa Hóa học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Hà Nội đã truyền đạt những kiến thức, kĩ năng để em hoàn thành các môn học trong khóa học này cũng như áp dụng vào thực tế

Em xin cảm ơn TS Vũ Thị Trang các anh chị đồng nghiệp trong Viện kiểm

nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã hướng dẫn, giúp đỡ và phối hợp với em trong quá trình nghiên cứu để em có kết quả như ngày hôm nay

Em xin cảm ơn sự hỗ trợ của đề tài số ĐT.KHCN.034/22 thuộc dự án “Nghiên cứu đánh giá nguy cơ an toàn thực phẩm đối với việc sử dụng phụ gia thực phẩm trong sản xuất, chế biến thực phẩm có nguồn gốc từ tinh bột và đề xuất các giải pháp tăng cường năng lực quản lý”

Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm, động viên giúp em hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày tháng năm 2024

Học viên

Vũ Thị Nhật Lệ

1.1 Tổng quan về stearoyl lactylate 3

1.1.1 Khái niệm chung 3

1.1.2 Cấu tạo và thành phần của stearoyl lactylate 3

1.1.3 Tính chất hóa lý của stearoyl lactylate 4

1.2 Cơ chế và vai trò của stearoyl lactylate trong thực phẩm 5

1.2.1 Các tương tác của SSL với một số thành phần trong thực phẩm 5

1.2.2 Một số ứng dụng của SSL trong công nghiệp sản xuất thực phẩm 6

1.2.3 Yêu cầu kỹ thuật của phụ gia thực phẩm SSL 9

1.3 Ảnh hưởng của SSL đến sức khỏe và các quy định quản lý 10

1.3.1 Ảnh hưởng của SSL đến sức khỏe 10

1.3.2 Mức hàm lượng cho phép của SSL trong thực phẩm 11

1.4 Tổng quan các phương pháp phân tích sodium stearoyl lactylate 14

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 26

2.2 Thiết bị và hóa chất 27

2.2.1 Thiết bị 27

2.2.2 Hóa chất 29

2.3 Khảo sát điều kiện tối ưu trên thiết bị HPLC-PDA 31

2.4 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 32

2.4.1 Thông tin mẫu 32

2.4.2 Quy trình xử lý mẫu 32

2.4.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 33

2.5 Các thông số đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích 34

2.5.1 Độ đặc hiệu của phương pháp 34

2.5.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp 34

2.5.3 Khoảng tuyến tính 35

2.5.4 Độ chụm và độ đúng của phương pháp 36

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Nghiên cứu xác định sodium stearoyl lactylate bằng HPLC-PDA 39

3.1.1 Khảo sát các điều kiện HPLC-PDA 39

3.1.2 Khảo sát quá trình xử lý mẫu 46

Bảng 1.4 Tóm tắt một số nghiên cứu xác định sodium stearoyl lactylate 19

Bảng 3.1 Điều kiện khảo sát cột tách sắc ký 40

Bảng 3.2 Điều kiện khảo sát gradient 42

Bảng 3.3 Điều kiện HPLC-PDA tối ưu phân tích SSL 44

Bảng 3.4 Sự phụ thuộc của diện tích peak vào nồng độ của dẫn xuất lactate-NPH 53

Bảng 3.5 Kết quả giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp 55

Bảng 3.6 Kết quả phân tích độ lặp lại trên nền mẫu bánh mì (BM) và bánh quy (B) 56Bảng 3.7 Kết quả phân tích độ tái lập cách ngày trên nền mẫu bánh mì (BM) và bánh quy (B) 56

Bảng 3.8 Kết qủa độ thu hồi trong nền mẫu bánh mì và bánh quy 57

Bảng 3.9 Bảng tổng hợp kết quả độ lặp lại, tái lập và độ thu hồi 59

Bảng 3.10 Kết quả phân tích hàm lượng SSL trong mẫu thực 60

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu tạo chung của SSL (INS 481) 3

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của SSL 4

Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo cơ bản của hệ thống HPLC 23

Hình 1.4 Cấu tạo của detector PDA 24

Hình 1.5 Cơ chế phản ứng của acid cacboxylic và 2-NPH sử dụng EDC làm cấu tử tạo cặp, được xúc tác bởi pyridine 25

Hình 2.1 Ảnh chụp hệ thiết bị HPLC-PDA 27

Hình 2.2 Hình ảnh cột InterSep C18 500 mg/6mL 28

Hình 2.3 Nguyên lý xác định SSL thông qua dẫn xuất lactate-NPH 32

Hình 3.1 Phổ hấp thụ của dẫn xuất lactate 39

Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu trắng và chuẩn trong khảo sát cột tách sắc ký 41

Hình 3.3 Sắc ký đồ chuẩn dẫn xuất lactate-NPH với các chương trình 43

Hình 3.4 Sắc ký đồ phân tích sử dụng dung môi methanol 43

Hình 3.5 Sắc ký đồ chuẩn và mẫu bánh mì ở các dung môi pha động khác nhau 45

Hình 3.6 Biểu đồ hiệu suất thu hồi theo dung môi chiết 46

Hình 3.7 Hiệu suất thu hồi quá trình làm khô 47

Hình 3.8 Hình ảnh váng béo sau khi xà phòng hóa 48

Hình 3.9 Sắc kí đồ mẫu có/không qua cột SPE 49

Hình 3.10 Hình ảnh mẫu có qua cột SPE và không qua cột SPE 49

Hình 3.11 Hình ảnh cột Intersil C18 trước và sau khi qua cột 50

Hình 3.12 Quy trình xử lý mẫu tối ưu 51

Hình 3.13 Độ đặc hiệu của dẫn xuất lactic-NPH 52

Hình 3.14 Đường chuẩn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ dẫn xuất lactate-NPH 54Hình 3.15 Sắc ký đồ thí nghiệm LOD nền bánh mì (3.15A) và bánh quy (3.15B) 54

Hình 3.16 Biểu đồ kết quả phân tích SSL trong 20 mẫu thực 61

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt

ADI Acceptable daily intake Lượng ăn vào hằng ngày có thể

chấp nhận được AOAC Association of Official

Analytical Collaboration

Hiệp hội liên phòng thí nghiệm phân tích chính thức

CSL (INS 482) Calciumstearoyl-2-lactylate Calciumstearoyl-2-lactylate

1-ethyl-3-(3-dimetylaminopropyl)carbodiimua

dimetylaminopropyl)carbodiimua EFSA European Food Safety Authority Cơ quan an toàn thực phẩm Châu

1-ethyl-3-(3-Âu

FDA Food And Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm và Dược

phẩm Hoa Kỳ GC-FID Gas Chromatography - Flame

Ionization Detection

Sắc ký khí với detector ion hóa ngọn lửa

HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao INS International Numbering System

for Food Additives

Hệ thống mã số quốc tế cho phụ gia thực phẩm

JECFA Joint FAO/WHO Expert

Committee on Food Additives

Uỷ ban chuyên gia Quốc tế về Phụ gia Thực phẩm

MDL Method Detection Limit Giới hạn phát hiện của phương

pháp MQL Method Quantitative Limit Giới hạn định lượng của phương

pháp

NPH 2-nitrophenyl hydrazine 2-nitrophenyl hydrazine PAD Photo array Diod Detector Detector mảng diot phát quang RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

SSL (INS 481) Sodium stearoyl-2-lactylate Natri stearoyl-2-lactylat

TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng UPLC Ultra Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước phát triển về nông nghiệp đặc biệt là lúa nước, với thành tích đứng hàng đầu trên thế giới về xuất khẩu lúa gạo, nên các sản phẩm có nguồn gốc từ tinh bột cũng rất phong phú Với công nghệ kỹ thuật hiện nay, việc tạo ra và ứng dụng các chất phụ gia vào trong các sản phẩm tinh bột nhằm đáp ứng được kết cấu, mùi vị, màu sắc cũng như tăng cường các đặc tính vốn có và tạo ra các đặc tính, kết cấu mới của sản phẩm đang trở nên phổ biến hơn

Một trong số nhóm chất phụ gia được sử dụng phổ biến trong các sản phẩm tinh bột là các chất nhũ hóa như glyceryl monostearate (INS 471), lactoglycerides (INS 472b), hay sodium stearoyl lactylate (INS 481),… Sodium stearoyl lactylate (SSL) có tác dụng làm tăng khả năng tạo các sản phẩm khác nhau của bột, tăng khả năng chịu tác động khi phối trộn bằng cơ giới, tăng khả năng giữ khí khi cho nấm men ít, làm tăng khối lượng bánh, tăng kích thước bề mặt, tăng cấu trúc vật lý, tăng khả năng bảo quản, làm giảm lượng shortening và tăng khả năng cắt mỏng,…Do đó, SSL được sử dụng trong các sản phẩm có nguồn gốc từ tinh bột như các loại bánh mì, bánh xốp và các sản phẩm bánh nướng khác [18, 1]

Mặc dù SSL có nhiều chức năng trong công nghệ sản xuất các sản phẩm có nguồn gốc từ tinh bột, nó vẫn cần được sử dụng với một giới hạn cho phép do những tác động ảnh hưởng đến sức khỏe Với các nghiên cứu thử nghiệm về độc tính, giá trị liều gây chết trung bình (LD50) của SSL là 25 g/kg thể trọng, không ghi nhận các ảnh hưởng liên quan đến quang sai nhiễm sắc thể, không có đột biến ở tế bào vi khuẩn và động vật có vú Một số tác dụng phụ khác được báo cáo như gây kích ứng da khi tiếp xúc và ảnh hưởng đến đường hô hấp khi hít phải [14, 24] Do đó, EFSA đã công bố giá trị ADI (lượng hấp thu hàng ngày có thể chấp nhận được) là 22 mg/kg thể trọng/ ngày đối với SSL khi dùng riêng biệt hoặc kết hợp với calcium stearoyl-2-lactylate (INS 482)[14]

Để kiểm soát hàm lượng SSL trong thực phẩm, cần thiết phải phát triển các phương pháp phân tích Đã có một số nghiên cứu được công bố về các phương pháp phân tích hàm lượng SSL trong thực phẩm như sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí với detector FID, hay sắc ký lỏng với detector khối phổ (probe APCI), hay sắc ký lỏng với detector PDA Trong đó, phương pháp sắc ký lỏng với detector PDA được ưu tiên lựa chọn và áp dụng nhiều nhất do thiết bị phổ biến, thời gian kiểm nghiệm nhanh và

cho độ nhạy cao với bước dẫn xuất hydrazine hóa Trên cơ sở đó, đề tài “Xác định

hàm lượng stearoyl lactylate trong một số thực phẩm có nguồn gốc từ tinh bột bằng phương pháp sắc ký” đã được lựa chọn để phân tích hàm lượng SSL trong các sản

phẩm có nguồn gốc từ tinh bột

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về stearoyl lactylate

1.1.1 Khái niệm chung

hỗn hợp muối sodium của acid stearoyl lactylic, các polyme của nó và một lượng nhỏ muối sodium của các acid có liên quan khác, được tạo ra từ phản ứng của acid stearic và acid lactic Các acid béo thực phẩm khác cũng có thể có mặt, tự do hoặc được este hóa bởi sự hiện diện của chúng trong acid stearic được sử dụng [9]

sodium của acid stearoyl lactylic và một phần nhỏ các muối khác của acid có liên quan, được tạo thành bằng cách este hóa acid stearic thương mại với acid lactic và trung hòa thành muối sodium stearoyl lactylate; có thể chứa acid palmitoyl và stearoyl lactylic không được khoáng hóa, acid béo tự do (chủ yếu là palmitic và stearic), acid lactic tự do và muối của este acid béo của acid lactic và acid lactic trùng hợp [14]

1.1.2 Cấu tạo và thành phần của stearoyl lactylate

SSL là một hỗn hợp gồm các muối: Sodium stearoyl-2-lactylate, Sodium stearoyl-1-lactylate và Sodium palmitoyl-1-lactylate Trong đó, Sodium palmitoyl-1-lactylate là sản phẩm từ phản ứng của acid palmitic, acid lactic và sodium hydroxyde

Cấu trúc của SSL có thể được viết chung gồm 3 thành phần chính: acid béo (acid stearic), lactylate và ion Na+ [14]

Hình 1.1 Cấu tạo chung của SSL (INS 481)

Nguyên liệu sodium stearoyl lactylate cũng có thể chứa các tạp chất từ nguyên liệu thô hoặc được tạo ra trong quá trình sản xuất gồm [14]: Acid palmitoyl lactylic, acid stearoyl lactylic, acid béo tự do (acid palmitic và acid stearic), acid lactic tự do, muối của este acid béo của acid lactic và muối của este acid béo của acid lactic polyme hóa

1.1.3 Tính chất hóa lý của stearoyl lactylate

SSL có công thức hóa học thành phần chính là C24H43O6 với khối lượng phân tử 450,59 g/mol, tồn tại ở dạng bột màu trắng hoặc hơi vàng, có mùi đặc trưng Công thức cấu tạo như hình 1.2 [19, 9]

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của SSL

Công thức cấu tạo của SSL gồm nhóm ưa béo (gốc stearoyl chuỗi dài) và nhóm ưa nước (gốc ester của acid lactic với ion sodium) nên SSL không hòa tan trong nước hoặc khả năng hòa tan trong nước kém ở nhiệt độ thấp, phân tán trong nước nóng; hòa tan trong ethanol, dầu ăn nóng và chất béo, các acid hữu cơ kém phân cực [32]

Các tính chất vật lý đặc trưng khác của SSL được thể hiện trong bảng 1.1 [14]

Nhiệt độ sôi (°C, 760 mmHg) 532-533

(1) Hệ số phân vùng octanol/nước (2) Giá trị HLB – Hydrophile -Lipophile Balance – mối tương quan cân bằng ưa nước- ưa dầu được xác định bằng cách tính tỷ lệ phần trăm trọng lượng phân tử cho các thành phần ưa nước và ưa dầu, thang đo dao động từ 1-20 [16]

1.2 Cơ chế và vai trò của stearoyl lactylate trong thực phẩm

1.2.1 Các tương tác của SSL với một số thành phần trong thực phẩm

• Tương tác với tinh bột

Phần acid stearic của lactylate tham gia vào quá trình tạo phức tinh bột theo cách tương tự như glycerol monostearate (GMS) [40] Acid stearic xen vào cấu trúc xoắn ốc của tinh bột tạo thành một phức hợp không hòa tan (phức hợp tinh bột-lactylate) Phức hợp này ngăn cản quá trình oxy hoá, giúp cải thiện chức năng của tinh bột và giảm tình trạng ôi thiu đối với các sản phẩm bánh mì Bên cạnh đó, có thể bản chất ion của lactylate tạo ra lực đẩy ion giữa các phức hợp tinh bột-lactylate giúp giải thích phần nào khả năng làm mềm vụn bánh mì Ngoài ra, do cấu trúc của vụn bánh mì về cơ bản là các hạt tinh bột trong nền protein, sự tương tác giữa các hạt có thể dẫn đến sự biến đổi nền protein, do đó làm chậm quá trình ôi thiu [8, 7]

Trong một nghiên cứu khác về tương tác của lactylate và tinh bột, Tenney và cộng sự [39] đã nghiên cứu ảnh hưởng của SSL 0,5% đến độ nhớt sệt của tinh bột ngô, gạo, lúa mì, khoai tây và khoai mì từ pH 3,0 đến 9,0 Ảnh hưởng của SSL khá khác nhau, phụ thuộc rất nhiều vào loại tinh bột và độ pH của dung dịch Nghiên cứu chỉ ra rằng, SSL thường làm tăng nhiệt độ hồ hóa, đặc biệt là trong khoảng pH cao

Trong nghiên cứu ảnh hưởng của SSL đến độ nhớt nóng của tinh bột ngô biến tính và tinh bột sắn biến tính trong amylograph ở pH 4,5 và 6,5 của Tenney và van

Vactor [7], ở mức SSL1%, có rất ít ảnh hưởng đến nhiệt độ hồ hoá hoặc độ nhớt so với tinh bột nguyên bản

Một nghiên cứu khác của Ghiasi và cộng sự [16] về sự ảnh hưởng của SSL và monoglycerid gốc dầu cọ đến sự trương nở và khả năng hòa tan của tinh bột mì ở các nhiệt độ khác nhau Sự có mặt của SSL làm quá trình trương nở diễn ra ở khoảng 85˚C, sau đó xảy ra hiện tượng phồng hạt và dừng lại ở 95˚C Phức hợp SSL – tinh bột nhanh chóng được hình thành lại khi nhiệt độ giảm [37]

• Tương tác với protein

Lactylate được cho là tương tác với protein theo ít nhất hai cách Phần acid stearic hình thành liên kết kỵ nước với các vùng không phân cực trên protein [32] Ngoài ra, sự ghép cặp ion xảy ra giữa phần carboxylic của lactylate và dư lượng acid amin mang điện tích trên protein Việc trung hòa điện tích trên protein có thể dẫn đến sự kết tụ protein Đối với nền bột bánh mì, điều này xảy ra dẫn đến độ nhớt của bột tăng lên, khả năng giữ khí tốt hơn và cuối cùng là khối lượng bánh mì lớn hơn

DeStefanis và cộng sự [37] đã công bố nghiên cứu cho thấy SSL có tương tác với phần protein của bột bánh mì trong giai đoạn trộn, ủ và giai đoạn đầu của quá trình nướng bánh Ở khoảng 60 ∘C, khi gluten biến tính và tinh bột bắt đầu hồ hóa, SSL chuyển sang phần tinh bột và tạo thành phức chất

1.2.2 Một số ứng dụng của SSL trong công nghiệp sản xuất thực phẩm

SSL hòa tan trong dầu và chất béo, cũng như có khả năng hút các phân tử nước về phía nó, do đó, nó hữu ích trong việc tạo nhũ tương dầu trong nước (nhũ hóa) và giữ độ ẩm cho thực phẩm; hơn nữa, SSL còn tương tác với tinh bột và tạo phức với protein Vì các lí do này, SSL được sử dụng làm chất nhũ hóa bột trong các loại bánh nướng có men, có hàm lượng chất béo cao Bên cạnh đó, SSL cũng được sử dụng làm chất tạo bọt trong các món tráng miệng được đánh bông từ sữa hoặc làm kem không chứa sữa, khi đó nó hoạt động như một chất hoạt động bề mặt và chất tạo phức SSL cũng được sử dụng trong bột làm trắng với vai trò là chất thay thế chất béo [35, 15]

• Ứng dụng của SSL trong công nghiệp sản xuất bánh mì

Đối với ngành làm bánh, việc tối ưu hóa các đặc tính của bột và nâng cao chất lượng sản phẩm cũng như kéo dài thời gian sử dụng của sản phẩm là vấn đề được quan tâm Sau khi nướng, độ tươi của bánh giảm đi rất nhanh, dẫn đến ôi thiu và không bán được Do đó, thách thức đối với ngành công nghiệp sản xuất bánh mì là cải thiện đặc tính của bột nhào cũng như làm chậm quá trình ôi thiu để giữ được chất lượng bánh mì ở mức cao nhất có thể SSL đã phát huy tác dụng trong quá trình lên men, xử lý cơ học, tạo hình và vận chuyển, cũng như trong quá trình ủ và giai đoạn nướng bánh để cho khối lượng lớn hơn và cấu trúc mảnh vụn của thành phẩm được cải thiện [37, 13] Hơn nữa, trong nghiên cứu của Lisa Elmen cho thấy, sự có mặt của 0,025 % SSL trong sản phẩm đã làm giảm nồng độ của lớp vi khuẩn Clostridia và các loại vi khuẩn khác [37, 13]

- Tăng men và làm mềm vụn bánh [37]: SSL dễ hòa tan trong bột nhào mà

không cần hydrate hóa trước, nó tương đối ổn định trong quá trình nhào nặn và bảo quản SSL tương đối rẻ nhưng vẫn mang lại các đặc tính gia công bột nhào tốt, khối lượng bánh tốt và đảm bảo độ mềm của vụn bánh mì đã khiến SSL trở thành một trong những chất phụ gia làm bánh tăng men hữu ích nhất

Về khả năng làm mềm vụn, SSL vượt trội hơn CSL Mặc dù tác dụng làm mềm vụn của SSL thay đổi ở một mức độ nào đó đối với từng loại bột mì, nhưng nhìn chung có một sự cải thiện đáng kể Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, việc sử dụng SSL làm giảm hàm lượng sử dụng khuẩn amylase mà vẫn tạo ra bánh mì có độ mềm và giá trị kết dính tương tự Điều này ngăn ngừa việc bánh mì quá nhão, đồng thời duy trì độ mềm tối đa và tổng thể chất lượng thực phẩm [13]

Junge và cộng sự đã có các nghiên cứu về khả năng giữ khí trong bánh mì khi sử dụng các chất nhũ hóa Kết quả SEM cho thấy các chất nhũ hóa tạo ra nhiều tế bào khí nhỏ hơn và tạo ra hạt mịn trong thành phẩm hơn khi không sử dụng [37]

- Tăng thể tích và độ bền bột nhào [17]: Trong sản xuất bánh mì công nghiệp,

tính chất lưu biến của bột rất quan trọng Do sự tương tác tốt với protein, SSL có khả

năng tăng thể tích và chống lại các tác động cơ học Nhờ khả năng tạo phức với protein, giúp hình thành nền gluten, SSL giúp tạo ra một khối bột dẻo hơn, nhưng không quá đàn hồi, như trong trường hợp bột nhào bị oxy hóa quá mức Bột nhào cũng mềm hơn so với bột nhào chưa được tạo nhũ [10] Hơn nữa, SSL hoạt động như một chất nhũ hóa tăng cường bột, nó có khả năng tạo màng lỏng có cấu trúc dạng phiến ở bề mặt phân cách giữa gluten và tinh bột Điều đó cải thiện khả năng tạo màng của gluten để giữ lại khí do nấm men tạo ra, do đó làm tăng khối lượng[39]

- Tăng tính đối xứng [17]: Tính đối xứng rất quan trọng trong một số loại bánh

mì như hamburger và bánh mì áp chảo trắng Các nghiên cứu chỉ ra rằng, nên sử dụng SSL 0,25% để đạt được tính đối xứng mong muốn [27]

- Tạo ra lớp vỏ bánh mì giòn [17]: SSL được biết là tạo ra vỏ bánh mì giòn do

ảnh hưởng của lactylate đến quá trình tạo phức protein Khi nhiệt độ tăng dần lên trong giai đoạn đầu nướng bánh, lactylate bắt đầu chuyển từ protein sang tinh bột Lớp phủ tinh bột này làm chậm đáng kể quá trình hồ hóa tinh bột, giúp giữ độ nhớt thấp và tăng khả năng giãn nở trong lò

• Ứng dụng của SSL trong bánh ngọt và bánh nướng lên men hóa học

SSL được sử dụng phổ biến làm chất nhũ hóa cho các loại men hóa học Bản chất anion của các lactylate tạo ra điện tích âm xung quanh các micelle Các micelle có cùng điện tích đẩy nhau, giảm sự kết tụ, dẫn đến tăng khối lượng và cấu trúc vụn mịn Do bản chất anion này, SSL cũng có ảnh hưởng đến tính liên tục của albumen trứng và cấu trúc protein lúa mì [17, 27]

• Ứng dụng của SSL trong bánh quy và bánh quy giòn

SSL được sử dụng trong các công thức bánh quy và bánh quy giòn để đạt được sự phân bổ đồng đều hơn của shortening trong bột (Shortening là một thuật ngữ được sử dụng trong ngành làm bánh để mô tả chất béo, dầu, các dẫn xuất của chúng hoặc hỗn hợp của chúng nhằm cải thiện chất lượng bánh) Điều này dẫn đến giảm độ nhớt

của bột nhào, tăng độ dàn trải và đồng đều Ngoài ra, SSL có thể làm giảm lượng shortening cần thiết, giúp giảm chi phí trong khi vẫn duy trì các đặc tính khác [23]

• Ứng dụng của SSL trong trong công nghiệp chế biến các loại mì - Pasta: Các công thức mì ống cơ bản nhất có thể chỉ gồm bột báng và nước

Tuy nhiên, có những đặc tính chỉ đạt được khi bổ sung chất nhũ hóa Chẳng hạn như việc sử dụng chất nhũ hóa để duy trì độ cứng trong mì ống đóng hộp hoặc mì ống được sử dụng trong súp [48] SSL ở 0,5% trọng lượng có thể làm giảm sự mất nước khi nấu xuống thấp nhất, mang đến độ dính ít nhất và vẻ ngoài sáng bóng nhất Mì ống chứa 0,5% SSL được đánh giá là cứng hơn mì ống chứa 0,5% glycerol monostearate [12, 40]

- Mì ăn liền: Trong một nghiên cứu, để giữ lại tinh bột trong mì chiên ăn liền,

giúp mì cứng hơn và ít dính hơn đã đạt được khi bổ sung SSL ở mức 0,25% và 0,5% do khả năng giúp tạo phức với một số loại tinh bột Sự hình thành phức hợp SSL và tinh bột làm giảm lượng tinh bột bị mất nước trong quá trình nấu Các công trình nghiên cứu khác cũng kết luận rằng độ bền kéo và lực cắt của mì ép đùn tăng lên khi nồng độ SSL tăng lên từ 0 % đến 1,5 % [8]

1.2.3 Yêu cầu kỹ thuật của phụ gia thực phẩm SSL

SSL được bổ sung vào thực phẩm với vai trò là phụ gia thực phẩm, do đó, các yêu cầu kỹ thuật quy định chất lượng của phụ gia này cũng đã được thiết lập Tùy theo các cơ quan, tổ chức, các quốc gia, khu vực khác nhau sẽ có thể có các quy định khác nhau Bảng 1.2 là các yêu cầu kỹ thuật được quy định cho SSL theo tiêu chuẩn EU số 231/2012 và tiêu chuẩn JECFA 2006 [14]

Bảng 1.2 Các yêu cầu kỹ thuật của phụ gia thực phẩm SSL theo tiêu chuẩn EU số

1.3 Ảnh hưởng của SSL đến sức khỏe và các quy định quản lý

1.3.1 Ảnh hưởng của SSL đến sức khỏe

Tác dụng của SSL trong quá trình sản xuất thực phẩm đã được ghi nhận ở nhiều mặt tích cực, đặc biệt đối với những sản phẩm có nguồn gốc từ tinh bột Tuy nhiên, song song với những tác dụng tích cực này, cũng có những lo ngại liên quan đến các tác động tiềm ẩn mà SSL có thể gây ra cho sức khỏe con người

Tuy chưa có các thí nghiệm in vivo và in vitro với SSL, nhưng với CSL được

đánh dấu 14C ở nhóm lactate (Canxi stearoyl-2-[U-14C] lactylate) cho thấy sự hấp thụ gần như hoàn toàn chất đánh dấu phóng xạ Độc tính của SSL và CSL được đánh giá sẽ tương tự nhau Độc tính cấp tính qua đường miệng ở chuột cho thấy giá trị liều gây chết trung bình (LD50) là trên 25 g/kg thể trọng [19] Các nghiên cứu chưa được công bố ở chuột và chó về độc tính bán cấp và bán mãn tính qua đường miệng cho thấy

NOAEL là 5% trong chế độ ăn (tương ứng với 2500 mg/kg thể trọng/ngày) đối với SSL hoặc CSL Chuột được cho dung nạp liều lượng lớn sodium stearoyl-2-lactylate và calcium stearoyl-2-lactylate trong một năm mà không có bằng chứng về độc tính Chó có vẻ ít nhạy cảm hơn chuột khi tiếp xúc với calcium stearoyl-2-lactylate qua đường miệng [14, 19] Không có dữ liệu về độc tính sinh sản và khả năng gây ung thư vì các sản phẩm thủy phân, acid stearic và acid lactic là thành phần của thực phẩm tự nhiên và là một phần của quá trình chuyển hóa nội sinh ở động vật có vú [24]

Ishidate và cộng sự đã thực hiện xét nghiệm quang sai nhiễm sắc thể với CSL trên dòng tế bào nguyên bào sợi phổi hamster Trung Quốc (CHL) Tác dụng gây độc tế bào đã được nghiên cứu trong các thử nghiệm sơ bộ và mức 50% liều gây ức chế sự phát triển của tế bào được chọn là liều cao nhất để thử nghiệm độc tính gen Kết quả cho thấy, việc tiếp xúc với CSL không gây ra hiệu ứng đa bội hoặc nhiễm sắc thể [22]

Một tác dụng phụ khác có thể xảy ra của SSL là không dung nạp thực phẩm, hoặc “không thể tiêu hóa đúng cách hoặc tiêu hóa hoàn toàn một số loại thực phẩm”, có thể gây bệnh và các triệu chứng mãn tính Nếu hít phải ở dạng nguyên chất, sodium stearoyl lactylate có thể gây kích ứng nhẹ đường hô hấp Các báo cáo khác về sự mất cân bằng sodium khi sử dụng quá nhiều sodium stearoyl lactylate có thể dẫn đến nồng độ sodium trong cơ thể trở nên bất thường [6]

1.3.2 Mức hàm lượng cho phép của SSL trong thực phẩm

Do chưa cảnh báo nào về mức độ nguy hiểm của SSL đối với cơ thể người, SSL được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) và Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA), cũng như Ủy ban chuyên gia FAO/WHO về Phụ gia Thực phẩm (JECFA) chấp thuận là một thành phần an toàn SSL không độc hại, có thể phân hủy sinh học, và thường được sản xuất bằng cách sử dụng nguyên liệu đầu vào có thể tái tạo sinh học

Theo tài liệu của EFSA, ước tính phơi nhiễm dựa trên MPL nằm trong khoảng 29-92 mg/kg thể trọng/ngày đối với trẻ mới biết đi, 28-81 mg/kg thể trọng/ngày đối

với trẻ em, 13-32 mg/kg thể trọng/ngày đối với thanh thiếu niên, 8-21 mg/kg thể trọng/ngày đối với người lớn và 5-15 mg/kg thể trọng/ngày đối với người cao tuổi ở mức trung bình Ở mức độ cao, ước tính phơi nhiễm nằm trong khoảng 69-223 mg/kg thể trọng/ngày đối với trẻ mới biết đi, 44-190 mg/kg thể trọng/ngày đối với trẻ em, 21-59 mg/kg thể trọng/ngày đối với thanh thiếu niên, 19- 53 mg/kg thể trọng/ngày đối với người lớn và 16-31 mg/kg thể trọng/ngày đối với người cao tuổi Sự phơi nhiễm ước tính với SSL và CSL xảy ra chủ yếu thông qua việc tiêu thụ các sản phẩm sữa lên men có hương vị bao gồm các sản phẩm được xử lý nhiệt, bánh mì, bánh mì cuộn và thấp hơn ADI (22 mg/kg thể trọng/ngày) đối với tất cả người trưởng thành kể cả người già, nhưng vượt quá ADI đối với các nhóm dân số khác ở mức trung bình và đối với tất cả các nhóm dân số ở mức cao [14]

Quy định về việc sử dụng SSL trong một số sản phẩm thực phẩm ở Hoa Kỳ được mô tả trong mục 21 chương 1, phần 172 CFR 172.846 và 21 CFR 177.120 [43] Ủy ban Châu Âu đã phê duyệt mức độ sử dụng tối đa (MPLs) của SSL trong Quy định (EU) số 1129/2011 Quy định này yêu cầu các quốc gia thành viên EU thường xuyên đánh giá mức độ phơi nhiễm của người dân với loại phụ gia thực phẩm này [14, 19] Mức giới hạn tối đa cho phép của SSL được trình bày trong bảng 1.3

Bảng 1.3 Hàm lượng tối đa cho phép của SSL trong một số loại thực

phẩm ở Hoa Kỳ và EU

Đối tượng thực phẩm

Giới hạn tối đa

Đối tượng thực phẩm

Giới hạn tối đa

Đối tượng thực phẩm

Giới hạn tối

đa

Đồ nướng, bánh kếp, bánh quế 0,5 %

Sản phẩm sữa lên men có hương liệu

(được xử lí nhiệt)

5000 mg/kg

Ngũ cốc ăn sáng đã chế biến sẵn

4000 mg/kg

Kem phủ, pudding, topping 0,2 % Ngũ cốc ăn sáng

5000 mg/kg Thịt hộp

4000 mg/kg

Kem trong cà phê 0,3 % Sản phẩm bánh

nướng

5000 mg/kg

Hỗn hợp đồ, uống dạng bột

2000 mg/kg Khoai tây

khử nước 0,5% Tráng miệng

5000 mg/kg Kẹo cao su

2000 mg/kg

Đồ ăn nhẹ 0,2 %

Đồ ăn nhẹ làm từ khoai tây, ngũ cốc, bột mì hoặc tinh bột

2000 mg/kg Đồ uống có cồn

8000 mg/kg

Nước sốt và nước thịt 0,25 %

Các sản phẩm tương tự từ sữa, bao gồm cả chất làm trắng đồ

uống

3000 mg/kg

Trà, cà phê hòa tan

2000 mg/kg

Chất thay thế phô

Nhũ tương dầu và chất béo khác (Quy

10000 mg/kg

Bánh kẹo có đường

5000 mg/kg

định của EC số 1234/200711) Đồ uống hương

Các loại bánh kẹo

khác

5000 mg/kg

Chế phẩm rau quả

2000 mg/kg

1.4 Tổng quan các phương pháp phân tích sodium stearoyl lactylate

SSL là chất nhũ hóa thực phẩm, đặc biệt được sử dụng trong các sản phẩm bánh và bánh mì để cải thiện kết cấu Chúng nên được sử dụng ở mức thấp nhất mà tại đó đạt được hiệu quả công nghệ mong muốn trong một loại thực phẩm cụ thể và với hàm lượng không vượt quá mức tối đa theo qui định Để đánh giá hàm lượng SSL trong thực phẩm, các phương pháp phân tích SSL đã được phát triển bao gồm: GC-FID [11] [20] [44, 33], sắc ký lớp mỏng TLC [33, 41, 26], sắc ký lỏng khối phổ LC-MS [26] [29] [38], hay sắc ký lỏng với detector PDA [30] [31] [33]

FSA cũng phát triển phương pháp xác định trực tiếp lactylate bằng sắc ký khí GC-FID sau quá trình methyl hóa [20] Chất nhũ hóa (50 mg) được trộn với chuẩn nội, metyl tricosanoat C23methyl ester Sau đó, được xử lý bằng boron triflorua/methanol (3,0 mL), siêu âm trong 1-2 phút và phản ứng trong 90 phút ở nhiệt độ phòng Thêm hexan (2,0 mL) và nhanh chóng thêm nước để dừng phản ứng Sau quá trình tách pha hexan, phần chiết methyl ester này được loại bỏ trước khi phân

tích GC Điều kiện GC: Cột 30 m 𝑥𝑥 0,22 mm 𝑥𝑥 0,25 µm BPX-70, khí mang H2-100 kPa, chế độ tiêm chia dòng, nhiệt độ tiêm mẫu 275oC, chương trình cột từ 160 oC trong 1 phút tăng lên 250 oC với tốc độ 4 oC/phút (giữ trong 5 phút) Kết quả cho thấy tổng hàm lượng stearoyl lactylate của các mẫu SSL nằm trong khoảng 35-37%; đối với các mẫu CSL ở mức xấp xỉ 30%

Yukawa và Hanada đã phát triển phương pháp phân tích CSL trong bánh mì bằng sắc ký khí với detector ion hóa ngọn lửa (GC-FID) [44] Mẫu bánh mì sau khi chiết được chỉnh pH đến 6,5 (bằng ammoniac) Sau khi xử lý bằng α-amylase, mẫu được chiết phân đoạn qua resin trao đổi cation acid mạnh (Organo A) để tạo thành dạng acid sử dụng sắc ký cột Wako Gel C-200 Điều kiện sắc ký khí bao gồm: khí mang nitơ (tốc độ dòng 50 mL/s), detector ion hóa ngọn lửa; cột 3 mm 𝑥𝑥 1 m, silicon GE SE-30 3%, nhiệt độ cột từ 150 oC đến 240 oC, chương trình nhiệt độ 5 độ/phút, nhiệt độ detector 270oC Phương pháp chuẩn nội được sử dụng để định lượng dựa trên đường chuẩn tỷ lệ diện tích pic Kết quả phân tích các mẫu bánh mì thương mại cho thấy hàm lượng CSL trong khoảng 0,2%

Juhee Park và cộng sự [33] đã nghiên cứu thiết lập phương pháp phân tích SL trong sản phẩm đồ uống, kem thực vật (trà sữa, caramel latte, kem whipping,…) và các sản phẩm bánh, đồ ăn vặt (bánh mì bơ tỏi, muffin, waffle,…) ở Hàn Quốc bằng sắc ký khí (GC) Hệ thống GC được trang bị detector ion hóa ngọn lửa (FID) và bộ mẫu tự động với cột mao quản DB-1 (0,25 mm 𝑥𝑥 9,30 m 𝑥𝑥 0,25 µm) Với các mẫu đồ uống, kem, SL được chiết bằng ethyl acetate Đối với các mẫu bánh mì/đồ ăn nhẹ, mẫu được chiết với dung dịch đệm MES/TRIS (4,88 g MES và 3,05 g TRIS trong 500 mL nước deion) Sau thủy phân bằng alpha-amylase (30 µg) trong 60 phút ở 40 oC, mẫu được thêm HCl 1M (10 mL), NaCl (2 g) và chiết với ethyl acetate Để tạo dẫn xuất các mẫu, sau quá trình chiết, 5 mL dung dịch trên được làm khô dưới khí nitơ khí và mẫu khô được tạo dẫn xuất thêm (trimetylsilylation) với pyridin (900 µL), sau đó là BSTFA (270 µL) và TMCS (30 µL) Mẫu đã được ủ ở 105 oC trong 30 phút và lọc qua sodium sunfate trước khi phân tích bằng GC Phương pháp cho hệ số xác định R2 là 0,999 Giới hạn phát hiện và định lượng lần lượt là 16,54 và 50,12 µg/kg

Hiệu suất thu hồi với nền đồ uống là 97,0 %; nền bánh và đồ ăn vặt là 102,5 %; nền kem thực vật là 93,1 % với độ chụm RSDr = 0,88-1,1 %; RSDR %= 0,3 -2,0%

1.4.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Năm 1979, Wheeler đã phát triển phương pháp xác định SSL trong bột mì và hỗn hợp bột mì [41] SSL trong mẫu thử được chiết bằng cloroform và tách khỏi các lipid khác thông qua phương pháp sắc ký lớp mỏng, sau đó định lượng bằng phương pháp đo màu sử dụng phức của Fe3+ và dẫn xuất acid hydroxamic Quá trình chiết mẫu được thực hiện trên máy lắc cơ học với khoảng 10 mL chloroform và 1 giọt HCl đậm đặc (để chuyển SSL về dạng acid tự do) và được lọc qua natri sulfat khan Sau khi làm khô, phần cặn được hòa tan trong chính xác 1,0 mL CHCl3 SSL được nhận biết bằng thuốc thử bromphenol blue Để định lượng SSL, dải SSL được cạo từ tấm TLC được hòa tan trong hỗn hợp 1:1 gồm dung dịch sodium hydroxyde trong ethanol và dung dịch hydroxylamine, lên màu với sắt perchlorate và đo ở bước sóng 530 nm

Độ thu hồi SSL từ bột có thể đạt 92-96%

Năm 2011, Hiroki Kubota và cộng sự đã phát triển phương pháp sắc ký bản mỏng TLC để phân tách và nhận dạng các thành phần trong SSL thương mại [26] Cho dung dịch SSL chloroform (0,5 g/mL) lên tấm TLC silica gel và trộn với ete dầu mỏ–diethyl ete–acid acetic (100:100:1) Phun thuốc thử bromocresol green (BCG) để phát hiện các hợp chất có nhóm carboxyl (màu vàng), sau đó đặt bản TLC vào buồng iode để phát hiện các hợp chất hydrocarbon (màu nâu), xác định giá trị Rf của vết.Các vết được tách khỏi TLC và được phát hiện dưới dạng một đỉnh đơn bằng phân tích HPLC và sắc ký ion tổng LC-MS (TIC)

lượng electron 80 eV, tách sắc ký thực hiện trên cột Partisil 5 silica gel (15 𝑥𝑥 0,47 cm, 5 µm) Hai chất nhũ hóa sodium và calcium stearoyl lactylate được thêm vào dung dịch HCl 1M (20ml) và dietyl ete (3 𝑥𝑥 7 mL) Các lớp hữu cơ được gộp lại, sau đó rửa sạch bằng nước và NaCl bão hõa Mẫu được xà phòng hóa bằng boron triflorua-methanol trước khi bơm vào hệ thống sắc ký Kết quả thu được cho thấy thành phần chính trong mỗi mẫu là este acid béo của acid lactic Ngoài ra còn phát hiện được este acid béo của acid lactic trùng hợp trong các mẫu nghiên cứu Phân tích bán định lượng chỉ ra có khoảng một nửa tổng hàm lượng acid lactic của chất nhũ hóa được este hóa với acid béo [38]

Hiroki Kubota và cộng sự năm 2012 đã nghiên cứu các thành phần của sodium stearoyl lactylate thương mại tại Nhật Bản bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) [26] Stearoyl lactate và stearoyl-2-lactylate được tinh chế bằng sắc ký TLC và silica gel để thu được chất chuẩn Tổng lượng acid lactic tự do, acid lactic có nguồn gốc từ SL được xác định bằng LC-MS Với thiết bị LC-MS AQUITY UPLC Quattro Premier (Waters) sử dụng cột Inertsil C8 (5 μm, 2,1 mm × 150 mm), cùng với pha động acid formic 0,1 % - Acetonitrile (10: 90); nhiệt độ cột 40 oC, tốc độ dòng 0,2 mL/phút, thể tích tiêm 5 μL Các điều kiệm MS như ESI(-), điện áp mao quản 3,00 kV, nhiệt độ nguồn 120 oC, ở chế độ SIM Kết quả cho thấy SSL bao gồm acid lactic (8,4%), acid stearic (15%), SL (57%) và SLL (13%) Đây là nghiên cứu đầu tiên xác định các thành phần của SSL mua ở Nhật Bản bằng TLC và LC-MS

khô được nghiền trong máy xay Mẫu được chiết với HCl 0,1 mol/L, ethyl acetate và NaCl 5 mL dung dịch được làm khô bằng khí nitơ và thu cặn Sau đó, được xà phòng hóa bằng dung dịch KOH (1%, w/v) ở nhiệt độ 95 °C trong 60 phút và acid hóa với 2 mL dung dịch HCl 0,1 mol/L, làm sạch qua cột InertSep-C18 (500 mg/6 mL) Dịch qua cột được dẫn xuất với 200 µL dung dịch 2-NPH 0,02 M và 200 µL dung dịch EDC-HCl 0,25 M ở 60 °C trong 20 phút, dừng phản ứng với 200 μL dung dịch KOH (5% w/v) ở 60 °C trong 15 phút Định mức 5 mL bằng dung dịch HCl 0,1 mol/L Dung dịch dẫn xuất được phân tích bằng hệ thống HPLC-PDA sử dụng cột Inertsil C8-4 (5 µm, 4,6 × 150 mm) Pha động gồm 25% acid formic 0,1% và 75% methanol ở tốc độ dòng 1,0 mL/phút Bước sóng phát hiện được đặt ở 400 nm Phương pháp cho hệ số tương quan đường chuẩn R2= 0,999 trong khoảng làm việc 0,5 -200 mg/L Hiệu suất thu hồi 79 -102 %, độ lặp lại và độ tái lập nhỏ hơn 6,8 % và 7,2 % Giới hạn định lượng 0,2 g/kg (S/N=10)

Năm 2019, Junhee Park và cộng sự [33] đã nghiên cứu phương pháp phân tích stearoyl lactylate trong thực phẩm tại Hàn Quốc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với detector DAD ở bước sóng 400 nm sau bước dẫn xuất hydrazine hóa phát triển từ nghiên cứu của Mikawa 2012 Quá trình xử lý mẫu tương tự phương pháp của Mikawa, tuy nhiên, dung dịch được dẫn xuất với 0,02 M 2-NPH (400 µL) và 0,25 M 1-ethyl-3-(3-dimetylaminopropyl)carbodiimua hydroclorua (EDC-HCl) (400 µl) ở 60 oC trong 20 phút, sau đó thêm dung dịch KOH 5% (400 µL) trong bể cách thủy thêm 15 phút nữa và để nguội trong 10 phút Dung dịch HCl được thêm vào thể tích cuối cùng là 5 mL trước khi phân tích HPLC Chương trình gradient acid formic 0,1% và acetonitrile với tốc độ dòng 1 mL/phút trên cột Agilent Eclipse XDB- (5 µm, 4,6 × 250 mm) Phương pháp HPLC mới cho thấy hệ số tương quan (R2) là 0,999 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) lần lượt là 0,26 và 0,78 µg/kg, độ chụm RSDr = 0-0,1 %; RSDR = 0,0-0,2 % Độ thu hồi 99,0% với nền đồ uống; 97,5% với nền bánh mì và đồ ăn vặt; 78,1% với nền kem thực vật

Các phương pháp phân tích SSL trong các nền mẫu khác nhau được tóm tắt như bảng 1.4

Bảng 1.4 Tóm tắt một số nghiên cứu xác định sodium stearoyl lactylate

Chất phân tích

Nền mẫu

GC-Chất nội chuẩn (nonadecanoyl-1-lactylate) được sử dụng cùng với bước tiền xử lý với enzyme amylase

LOD 0,04 và LOQ 0,12 mg este/mL; Hiệu suất thu hồi 85-109 % [11]

SL

Nguyên liệu SSL, CSL

FID

GC-Sử dụng chất chuẩn nội, metyl tricosanoat C23methyl ester, mẫu được xử lý bằng boron triflorua/methanol Cột 30 m × 0,22 mm × 0,25 micron BPX-70, khí mang H2-100 kPa, chế độ tiêm mẫu split mode, nhiệt độ tiêm mẫu 275 oC, chương trình cột từ 160 oC trong 1 phút tăng lên 250 oC với tốc độ 4 oC/phút (giữ trong 5 phút)

Hàm lượng SL của các mẫu SSL nằm trong khoảng 35-37%; và xấp xỉ 30% với các mẫu CSL

Hàm lượng CSL trong khoảng 0,2% [44]

SSL, Đồ GC- Cột mao quản DB-1 (0,25 mm × 9,30 m × 0,25 µm) Mẫu R2: 0,999; LOD 16,54 µg/kg; LOQ

kem thực vật, bánh, đồ ăn vặt

pyridin (900 µL), sau đó là BSTFA (270 µL) và TMCS (30 µL)

97,0 %; nền bánh và đồ ăn vặt là 102,5 %; nền kem thực vật là 93,1%

Mẫu thử được chiết bằng chloroform và tách bằng TLC, xác định hàm lượng bằng đo màu sử dụng phức Fe3+ và dẫn xuất acid hydroxamic SSL

Độ thu hồi 92-97% với chế phẩm SSL thương mại và các mẫu bột mì thêm SSL

[41]

Thành phần trong SSL

Nguyên liệu SSL TLC

Dung dịch SSL chloroform (0,5 g/mL) lên tấm TLC silica gel và trộn với ete dầu mỏ–diethyl ete–acid acetic (100:100:1) Phun thuốc thử bromocresol green (BCG) để phát hiện các hợp chất có nhóm carboxyl (màu vàng), sau đó đặt bản TLC vào buồng iode để phát hiện các hợp chất hydrocarbon (màu nâu), xác định giá trị Rf của vết

Các thành phần phân tách tốt với các giá trị Rf 0,7, 0,3 và 0,1 [26]

Các thành

phần trong

Thực phẩm LC-MS

Mẫu được chiết trong dung dịch HCI 1 M và dietyl ete, sau đó rửa bằng nước và bằng dung dịch natri clorua bão hòa Cột 5-µm Partisil 5 silica gel; năng lượng electron 80 eV

4 mẫu từ 2 nhà sản xuất cho thấy các thành phần chính là acid 2-stearoyl và 2-palmitoyllactic và muối của chúng (hoặc acid 2-stearoyloxypropionic và

[38]

SSL, CSL

acid 2-palmitoyloxypropionic và muối của chúng)

Thành phần trong SSL

Nguyên liệu SSL LC-MS

Inertsil C8 (5 μm, 2,1 mm × 150 mm), pha động acid formic 0,1%-Acetonitrile (10:90); nhiệt độ cột 40 oC, tốc độ dòng 0,2 mL/phút, thể tích tiêm 5 μL Chế độ ESI (-), điện áp mao quản 3,00 kV, nhiệt độ nguồn 120 oC, ở chế độ SIM

SSL bao gồm acid lactic (8,4%), acid stearic (15%), SL (57%) và SLL (13%)

[26]

phẩm

PDA

HPLC-Dẫn xuất acid cacboxylic với 2-NPH-HCl với sự có mặt EDC-HCl sau bước làm sạch trên cột InertSep C18; cột Inertsil C8-4 (5µm, 4,6 × 150 mm) pha động gồm acid formic 0,1 % và methanol (75:25, v/v) ở chế độ đẳng dòng, tốc độ dòng 1,0 mL/phút, bước sóng phát hiện 400 nm

Hệ số tương quan đường chuẩn R2= 0,999 trong khoảng làm việc 0,5 -200 mg/L Hiệu suất thu hồi 79 -102 % với các nền và RSDr < 6,8 % RSDR < 7,2 % LOD= 0,2 g/kg

LOD 0,26 µg/mL, LOQ 0,78 µg/mL, độ chụm RSDr = 0-0,1%; RSDR = 0,0-0,2% Độ thu hồi 99,0% với nền đồ uống; 97,5% với nền bánh mì và đồ ăn vặt; 78,1% với nền kem thực vật

[33]

Như vậy, các nghiên cứu đã được công bố cho thấy các tác giả đã tiến hành phân tách, định lượng SL hoặc SSL trong thực phẩm với các phương pháp khác nhau Tuy nhiên, phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC không được đánh giá cao về độ nhạy cũng như độ chính xác, phương pháp này chủ yếu dùng để phân lập các thành phần trong nguyên liệu SSL, không được dùng để định lượng chính xác Phương pháp GC-FID hay LC-MS được xem là tốn kém và độ lặp lại cũng như độ nhạy không cao, ảnh hưởng bởi nền mẫu lớn, hơn nữa cần sử dụng nội chuẩn Các phương pháp được ưu tiên hiện nay là HPLC-PDA với hệ thiết bị đơn giản, phổ biến, với dẫn xuất hydrazine hóa cho độ nhạy và độ chọn lọc cao đáp ứng phân tích hàm lượng SSL trong mẫu thực phẩm ở dạng phụ gia bổ sung Đây cũng là phương pháp được lựa chọn phát triển trong nghiên cứu này

1.5 Tổng quan về phương pháp HPLC-PDA với dẫn xuất hydrazine

nitrophenyl-Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một trong những công cụ hiệu quả nhất trong hóa học phân tích, được sử dụng để tách, nhận biết và định lượng các hợp chất có thể hòa tan trong chất lỏng

Nguyên tắc của phương pháp: dung dịch mẫu được tiêm vào cột chứa chất hấp phụ (pha tĩnh) và một chất lỏng (pha động) được bơm ở áp suất cao qua cột [3] Quá trình tách dựa trên sự khác biệt về tốc độ di chuyển của chất phân tích do sự tương tác khác nhau giữa chất phân tích với pha động và pha tĩnh Tùy thuộc vào mức độ tương tác của các thành phần khác nhau, quá trình rửa giải diễn ra tại các thời điểm khác nhau Các chất có ái lực lớn hơn với pha tĩnh sẽ di chuyển chậm hơn và khoảng cách ngắn hơn trong khi các hợp chất có ái lực ít hơn sẽ di chuyển nhanh hơn và khoảng cách xa hơn Trong sắc ký lỏng truyền thống, dung môi thường chảy qua cột dưới tác dụng của trọng lực nên để hoàn thành quá trình tách sắc ký thường mất nhiều giờ, thậm chí nhiều ngày Ngược lại, trong kỹ thuật HPLC, dung môi sẽ được đẩy qua cột dưới áp suất cao lên đến 400 atm, cột tách có đường kính từ 2,1 mm đến 4,6 mm và chiều dài từ 30 mm đến 250 mm, đặc biệt cỡ hạt pha tĩnh nhỏ hơn từ 2 μm

đến 50 μm Tất cả các yếu tố này làm cho HPLC trở thành một phương pháp sắc ký nổi bật do có độ phân giải cao, hiệu quả tách tốt, thời gian tách ngắn và khả năng ứng dụng rộng rãi [45]

Cấu tạo cơ bản của một hệ thống HPLC được thể hiện trong hình 1.3 [3]

Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo cơ bản của hệ thống HPLC Trong đó: 1-Bình chứa dung môi; 2- Bộ loại khí; 3- Bơm cao áp; 4- Bộ tiêm mẫu; 5- Cột sắc ký; 6- Detector; 7 - Máy tính; 8 – Máy in

Detector chuỗi diod (mảng diod) là detector hấp thụ quang nhưng cho phép đo đồng thời tại nhiều bước sóng (đo phổ UV) trong quá trình sắc ký, cho phép đánh giá độ tinh khiết của peak và góp phần xác định định tính thêm chắc chắn Độ hấp thụ tia cực tím thay đổi tùy thuộc vào bước sóng Detector PDA cho phép truyền 1 dải ánh sáng rộng qua mẫu trong khoảng 190 – 800 nm và sau đó, ánh sáng được tách thành các bước sóng riêng lẻ sau khi qua mẫu Quang phổ ánh sáng được hướng tới một dãy diode cảm quang (Hình 1.4) [4]

Hình 1.4 Cấu tạo của detector PDA

Đa số các phương pháp phân tích HPLC đều phát hiện trực tiếp chất phân tích Tuy nhiên, đối với sodium stearoyl lactylate được xác định thông qua acid lactic có khả năng đáp ứng detector UV kém hoặc trong trường hợp hàm lượng chất phân tích trong mẫu thấp thì giải pháp tối ưu để tăng độ nhạy và độ chọn lọc là dẫn chất hoá chất phân tích với thuốc thử thích hợp tạo thành sản phẩm có khả năng đáp ứng với detector, thuận lợi phát hiện và thu được độ chính xác cao hơn Các thuốc thử được lựa chọn sao cho sản phẩm tạo thành không những có hấp thu cực đại để tăng độ nhạy mà còn có độ chọn lọc cao, đồng thời phải giảm ảnh hưởng của sản phẩm phản ứng giữa nền mẫu và thuốc thử

2-Nitrophenylhydrazine (2-NPH) được sử dụng rộng rãi để tạo dẫn xuất với acid cacboxylic, aldehyd và xeton trong các mẫu công nghiệp và sinh học, phenylhydrazine thay thế nitro (NPH) là thuốc thử tạo dẫn xuất nổi tiếng để phát hiện và xác định acid cacboxylic [21, 31] So với các dẫn xuất acid cacboxylic được điều chế bằng anilin, các dẫn xuất NPH tương ứng cho thấy đặc tính hấp thụ tốt hơn do hiệu ứng dịch chuyển mạnh của nhóm nitro 2-Nitrophenylhydrazine hydrochloride (2-NPH·HCl) là lựa chọn phù hợp nhất vì dẫn xuất của nó hấp thụ mạnh ở bước sóng 392 nm, vùng phổ mà hầu hết các chất thuốc và tạp chất hấp thụ rất yếu [34] Các hợp chất này phản ứng với 2-NPH tạo thành các dẫn xuất, được phân tách bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và được phát hiện bằng detector mảng diode (DAD)

Phổ UV cung cấp thông tin về nhóm chức của các hợp chất: acid cacboxylic hoặc xeton/aldehyde

Dưới đây là sơ đồ phản ứng của acid cacboxylic và 2-NPH sử dụng EDC làm tác nhân liên kết, được xúc tác bởi pyridine (Hình 1.5) [34]

Hình 1.5 Cơ chế phản ứng của acid cacboxylic và 2-NPH sử dụng EDC làm cấu tử

tạo cặp, được xúc tác bởi pyridine

Từ những luận giải trên, trong nghiên cứu này phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với bước dẫn xuất bằng 2-nitrophenyl hydrazine được phát triển để xác định acid lactic có nguồn gốc từ sodium stearoyl lactyates (SSL) Phương pháp được phát triển dựa trên phương pháp chính thức được báo cáo trước đó [33, 31, 30]

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu quy trình xác định hàm lượng stearoyl lactylate trong một số thực phẩm có nguồn gốc từ tinh bột bằng phương pháp sắc ký

- Ứng dụng phương pháp đã nghiên cứu, xác định hàm lượng lượng stearoyl lactylate trong một số sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ tinh bột trên thị trường

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề ra, các nội dung cần thực hiện bao gồm: - Nghiên cứu, khảo sát các điều kiện tối ưu để xác định hàm lượng stearoyl lactylate trong một số thực phẩm có nguồn gốc từ tinh bột bằng phương pháp sắc ký

• Khảo sát bước sóng phân tích • Khảo sát cột tách sắc ký • Khảo sát chương trình rửa giải • Khảo sát thành phần pha động • Khảo sát quy trình xử lý mẫu thực phẩm có nguồn gốc tinh bột - Đánh giá phương pháp phân tích:

• Độ đặc hiệu của phương pháp • Xây dựng đường chuẩn • Xác định giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) • Đánh giá độ chụm và độ đúng của phương pháp phân tích - Áp dụng quy trình tối ưu để phân tích hàm lượng stearoyl lactylate trong một số thực phẩm có nguồn gốc từ tinh bột trên thị trường

M40, 4: Bộ phận tiêm mẫu tự động autosampler, 5: Buồng cột)

2.1.1.2 Các thiết bị khác và dụng cụ

Các thiết bị gồm: - Cân phân tích của hãng Mettler Toledo (Thuỵ Sĩ), độ chính xác 0,1 mg - Cân kỹ thuật của hãng Scientech (Thuỵ Sĩ), độ chính xác 0,1 mg

- Tủ lạnh Sanaky VH-2899W dùng bảo quản mẫu (Việt Nam) - Hệ cô quay chân không có bể điều nhiệt

- Bể điều nhiệt có thể điều chỉnh nhiệt độ - Bộ chiết pha rắn SPE và bơm áp suất - Máy đồng nhất mẫu

Các dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu gồm: - Dụng cụ thủy tinh: bình định mức, pipet, cốc, ống nghiệm - Bình cô quay

- Micropipet các loại: 1000 µL; 200 µL; 20 µL - Ống nhỏ: 2 µL để đựng mẫu phân tích

- Các lọ Falcon 15 mL; 50 mL để đựng dung dịch chuẩn và mẫu - Bộ xylanh lọc mẫu có đường kính màng lọc là 0,45 µm

- Cột Intersil C18 500 mg/6mL (GL sciences, Tokyo, Japan) (hình 2.2) - Một số dụng cụ thông thường khác trong phòng thí nghiệm

Hình 2.2 Hình ảnh cột InterSep C18 500 mg/6mL

2.1.1.4 Hóa chất dung môi

- 2-nitrophenylhydrazine (2-NPH) độ tinh khiết ≥ 97 % với 30 % nước (Trung Quốc), Code: 128830100; Lot: A0403188

- 1-ethyl-3-(3-dirnethylaminopropy]) carbodiimide hydrochloride (EDC) từ Thermo scientific; Code: 22981; Lot: XK35L574

- Dung dịch HCl 36,5% (Merck) - KOH (Merck)

- Pyridine (Trung Quốc) - Các dung môi khác: n-hexan, chloroform, ethyl acetate, ethanol, methanol (Merck) với độ tinh khiết dùng trong sắc ký

- Nước deion: là nước cất hai lần được lọc qua bộ lọc siêu tinh khiết có cột trao đổi cation, anion và màng lọc 0,22 µm

2.1.1.5 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn và hoá chất thuốc thử

• Pha dung dịch chuẩn gốc acid lactic 1000 mg/L

Dung dịch chuẩn acid lactic được pha từ chất chuẩn lithium L-lactate tương ứng (mục 2.2.1.1) trong nước deion: Cân chính xác 106 mg chất chuẩn chuyển vào bình định mức 100,0 mL, hòa tan và định mức tới vạch bằng nước deion thu được dung dịch gốc có nồng độ 1000 mg/L Dung dịch được bảo quản trong tủ lạnh

• Pha dung dịch chuẩn làm việc

Dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 0,5 – 200 mg/L acid lactic được chuẩn bị bằng cách pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc 1000 mg/L trong nước sử dụng pipetman với các bình định mức thích hợp

• Pha dung dịch HCl 0,1 M

Dung dịch HCl 0,1 M được pha từ dung dịch HCl 36,5% bằng cách lấy 8,3 mL dung dịch HCl 36,5% bằng ống đong, pha loãng trong 1 L nước Dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ phòng

• Pha dung dịch KOH 1% (w/v)

Cân 5,0 g KOH vào cốc thuỷ tinh có dung tích 100 mL, hoà tan với 50 mL ethanol Chuyển dung dịch vào bình có nắp kín Dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ phòng

• Pha dung dịch KOH 5% (w/v)

Cân 25,0 g KOH vào cốc thuỷ tinh có dung tích 100 mL, hoà tan với 50 mL ethanol-nước (1:1, v/v) Chuyển dung dịch vào bình có nắp kín Dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ phòng

• Pha dung dịch KOH 5% (w/v)

Cân 25,0 g KOH vào cốc thuỷ tinh có dung tích 100 mL, hoà tan với 50 mL ethanol-nước (1:1, v/v) Chuyển dung dịch vào bình có nắp kín Dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ phòng

• Pha dung dịch 2-NPH-HCl (0,02 M)

Cân 0,45 g 2-NPH vào cốc thuỷ tinh có dung tích 100 mL, hoà tan từ từ bằng dung dịch HCl 0,3 M trong ethanol với tỷ lệ 1:1 (v/v) Chuyển phần dung dịch vào bình định mức 100 mL và định mức đến vạch bằng dung dịch HCl trong ethanol trên, lắc, trộn đều Dung dịch được bảo quản trong bình kín ở 4 oC trong 4 tuần

• Pha dung dịch EDC-HCl (0,25 M)

Cân 4,78 g EDC-HCl vào cốc thuỷ tinh có dung tích 100 mL, hoà tan trong dung dịch 3% pyridine trong ethanol (v/v) Chuyển phần dung dịch vào bình định mức 100 mL và định mức đến vạch bằng dung dịch trên, lắc, trộn đều Dung dịch được bảo quản trong bình kín ở 4 oC trong 4 tuần

2.3 Khảo sát điều kiện tối ưu trên thiết bị HPLC-PDA

Khảo sát một số điều kiện phân tích sodium stearoyl lactylate được thực hiện trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với detector mảng diot (HPLC-PDA) với dung dịch chất chuẩn có nồng độ 200 mg/L và mẫu trắng nền bánh mì và bánh quy được thêm chuẩn ở hàm lượng 350 mg/kg Các khảo sát được thực hiện bao gồm:

• Khảo sát bước sóng phân tích Thực hiện quét phổ mẫu chuẩn lactate dẫn xuất có nồng độ 200 mg/L trong khoảng 190 – 800 nm (khoảng UV-Vis) và so sánh các đỉnh hấp thụ cực đại

• Khảo sát cột tách Thực hiện khảo sát cột tách sắc ký sử dụng chuẩn lactate với dẫn xuất nitrophenyl hydrazine ở nồng độ 100 mg/L với 2 cột phân tích Symmetry C8 (5µm, 4,6 x 250mm) chương trình đẳng dòng acid formic 0,1% và methanol (75:25, v/v) và cột Reliant C18 (5µm, 4,6 x 250mm) chương trình gradient giữa acid formic 0,1% và acetonitrile

• Khảo sát chương trình rửa giải Thực hiện khảo sát các chương trình gradient giữa acid formic 0,1% và acetonitrile với thời gian rửa giải và tỉ lệ pha động thay đổi với mẫu blank thuốc thử và mẫu chuẩn lactate dẫn xuất ở nồng độ 100 mg/L/

• Khảo sát dung môi pha động Thực hiện khảo sát dung môi pha động A – dung môi phân cực (nước, acid formic 0,05%, 0,1% và 0,2%) và khảo sát dung môi pha động B – dung môi kém phân cực (Acetontrile và methanol) với mẫu trắng và mẫu chuẩn lactate dẫn xuất