Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một trong những công cụ hiệu quả nhất trong hóa học phân tích, được sử dụng để tách, nhận biết và định lượng các hợp chất có thể hòa tan trong chất lỏng.
Nguyên tắc của phương pháp: dung dịch mẫu được tiêm vào cột chứa chất hấp phụ (pha tĩnh) và một chất lỏng (pha động) được bơm ở áp suất cao qua cột [3]. Quá trình tách dựa trên sự khác biệt về tốc độ di chuyển của chất phân tích do sự tương tác khác nhau giữa chất phân tích với pha động và pha tĩnh. Tùy thuộc vào mức độ tương tác của các thành phần khác nhau, quá trình rửa giải diễn ra tại các thời điểm khác nhau. Các chất có ái lực lớn hơn với pha tĩnh sẽ di chuyển chậm hơn và khoảng cách ngắn hơn trong khi các hợp chất có ái lực ít hơn sẽ di chuyển nhanh hơn và khoảng cách xa hơn. Trong sắc ký lỏng truyền thống, dung môi thường chảy qua cột dưới tác dụng của trọng lực nên để hoàn thành quá trình tách sắc ký thường mất nhiều giờ, thậm chí nhiều ngày. Ngược lại, trong kỹ thuật HPLC, dung môi sẽ được đẩy qua cột dưới áp suất cao lên đến 400 atm, cột tách có đường kính từ 2,1 mm đến 4,6 mm và chiều dài từ 30 mm đến 250 mm, đặc biệt cỡ hạt pha tĩnh nhỏ hơn từ 2 μm
đến 50 μm. Tất cả các yếu tố này làm cho HPLC trở thành một phương pháp sắc ký nổi bật do có độ phân giải cao, hiệu quả tách tốt, thời gian tách ngắn và khả năng ứng dụng rộng rãi [45].
Cấu tạo cơ bản của một hệ thống HPLC được thể hiện trong hình 1.3 [3].
Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo cơ bản của hệ thống HPLC
Trong đó: 1-Bình chứa dung môi; 2- Bộ loại khí; 3- Bơm cao áp; 4- Bộ tiêm mẫu; 5- Cột sắc ký; 6- Detector; 7 - Máy tính; 8 – Máy in
Detector chuỗi diod (mảng diod) là detector hấp thụ quang nhưng cho phép đo đồng thời tại nhiều bước sóng (đo phổ UV) trong quá trình sắc ký, cho phép đánh giá độ tinh khiết của peak và góp phần xác định định tính thêm chắc chắn. Độ hấp thụ tia cực tím thay đổi tùy thuộc vào bước sóng. Detector PDA cho phép truyền 1 dải ánh sáng rộng qua mẫu trong khoảng 190 – 800 nm và sau đó, ánh sáng được tách thành các bước sóng riêng lẻ sau khi qua mẫu. Quang phổ ánh sáng được hướng tới một dãy diode cảm quang (Hình 1.4) [4].
Hình 1.4. Cấu tạo của detector PDA
Đa số các phương pháp phân tích HPLC đều phát hiện trực tiếp chất phân tích.
Tuy nhiên, đối với sodium stearoyl lactylate được xác định thông qua acid lactic có khả năng đáp ứng detector UV kém hoặc trong trường hợp hàm lượng chất phân tích trong mẫu thấp thì giải pháp tối ưu để tăng độ nhạy và độ chọn lọc là dẫn chất hoá chất phân tích với thuốc thử thích hợp tạo thành sản phẩm có khả năng đáp ứng với detector, thuận lợi phát hiện và thu được độ chính xác cao hơn. Các thuốc thử được lựa chọn sao cho sản phẩm tạo thành không những có hấp thu cực đại để tăng độ nhạy mà còn có độ chọn lọc cao, đồng thời phải giảm ảnh hưởng của sản phẩm phản ứng giữa nền mẫu và thuốc thử.
2-Nitrophenylhydrazine (2-NPH) được sử dụng rộng rãi để tạo dẫn xuất với acid cacboxylic, aldehyd và xeton trong các mẫu công nghiệp và sinh học, phenylhydrazine thay thế nitro (NPH) là thuốc thử tạo dẫn xuất nổi tiếng để phát hiện và xác định acid cacboxylic [21, 31]. So với các dẫn xuất acid cacboxylic được điều chế bằng anilin, các dẫn xuất NPH tương ứng cho thấy đặc tính hấp thụ tốt hơn do hiệu ứng dịch chuyển mạnh của nhóm nitro. 2-Nitrophenylhydrazine hydrochloride (2-NPHãHCl) là lựa chọn phự hợp nhất vỡ dẫn xuất của nú hấp thụ mạnh ở bước súng 392 nm, vùng phổ mà hầu hết các chất thuốc và tạp chất hấp thụ rất yếu [34]. Các hợp chất này phản ứng với 2-NPH tạo thành các dẫn xuất, được phân tách bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và được phát hiện bằng detector mảng diode (DAD).
Phổ UV cung cấp thông tin về nhóm chức của các hợp chất: acid cacboxylic hoặc xeton/aldehyde.
Dưới đây là sơ đồ phản ứng của acid cacboxylic và 2-NPH sử dụng EDC làm tác nhân liên kết, được xúc tác bởi pyridine (Hình 1.5) [34].
Hình 1.5. Cơ chế phản ứng của acid cacboxylic và 2-NPH sử dụng EDC làm cấu tử
tạo cặp, được xúc tác bởi pyridine
Từ những luận giải trên, trong nghiên cứu này phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với bước dẫn xuất bằng 2-nitrophenyl hydrazine được phát triển để xác định acid lactic có nguồn gốc từ sodium stearoyl lactyates (SSL). Phương pháp được phát triển dựa trên phương pháp chính thức được báo cáo trước đó [33, 31, 30].