2.5.1.Độ đặc hiệu của phương pháp
Độ chọn lọc của phương pháp được đánh giá thông qua việc so sánh sắc ký đồ của chuẩn lactate đã được dẫn xuất trên 3 loại mẫu: mẫu trắng, mẫu trắng bánh mì thêm chuẩn SSL ở mức 1500 mg/kg và mẫu chuẩn lithium lactate tại nồng độ 100 mg/L. Phương pháp có độ chọn lọc cao đối với chất phân tích khi không phát hiện tín hiệu của chất phân tích trên mẫu trắng, tín hiệu chất phân tích không bị ảnh hưởng bởi các tín hiệu chất khác và thời gian lưu của chất phân tích trong mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn khác nhau không có ý nghĩa thống kê [2].
2.5.2.Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp
• Giới hạn phát hiện (LOD)
Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền.
• Giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của nền. Ước lượng LOQ của phương pháp dựa vào độ nhạy của thiết bị. Chọn mẫu thử có nồng độ thấp (trong khoảng 5 đến 7 lần LOD ước lượng). Trong nghiên cứu này, giá trị LOQ được xác định khi phân tích các mẫu trắng bánh mì và bánh quy thêm chuẩn SSL ở ngưỡng hàm lượng (10 mg/kg) và phân tích lặp lại 10 lần [2].
Tính giá trị trung bình x− , và độ lệch chuẩn SD
LOD = 3 × SD LOQ = 10 × SD
1 n
) x x SD (
2 i
−
= ∑ −
Đánh giá LOD đã tính được: tính R =
x− / LOD
- Nếu 4 ≤ R ≤ 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính được là đáng tin cậy
- Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, hoặc thêm một ít chất chuẩn vào dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R
- Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn, hoặc pha loãng dung thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R
2.5.3. Khoảng tuyến tính
Khoảng tuyến tính được xác định trong khoảng 0,5 mg/L – 200 mg/L với 8 điểm chuẩn. Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Sau đó, vẽ đường biểu đồ thể hiện sự phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ. Các dung dịch chuẩn được chuẩn bị mới hằng ngày và phân tích ngay sau khi dẫn xuất.
Hệ số hồi quy tuyến tính R trên nền dung môi R2 ≥ 0,995.
Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn. Sau khi lập đường chuẩn xong cần kiểm tra bằng phương pháp tính ngược lại nồng độ của các điểm chuẩn sử dụng để xây dựng đường chuẩn, từ đó tính các giá trị độ chệch theo công thức sau:
C 100 C C
c c
i = t − ×
∆ Trong đó: ∆i: Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn
C : Nồng độ tính ngược theo đường chuẩn của các điểm chuẩn t
C : Nồng độ của các điểm chuẩn c
Giá trị ∆ không được vượt quá ±15% cho tất cả các nồng độ, riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận giới hạn ±20%.
2.5.4.Độ chụm và độ đúng của phương pháp
Độ chụm của phương pháp được xác định dựa trên độ lặp lại và độ tái lập nội bộ.
• Độ lặp lại
Độ lặp lại (độ chụm) đặc trưng cho mức độ gần nhau giữa các giá trị riêng lẻ xi
khi tiến hành trên các mẫu thử giống hệt nhau, bằng cùng một phương pháp phân tích, trong cùng điều kiện thí nghiệm (cùng người phân tích, trang thiết bị, phòng thí nghiệm) trong các khoảng thời gian ngắn. Do vậy còn gọi là độ chính xác trong phòng thí nghiệm [2]. Độ lặp lại được thực hiện phân tích trên nền mẫu bánh mỳ trắng và bánh quy trắng được thêm chuẩn SSL ở ngưỡng hàm lượng 400 mg/kg và 600 mg/kg với 6 lần phân tích lặp (n=6).
• Độ tái lập nội bộ
Độ tái lập nội bộ đặc trưng cho mức độ phân tán của kết quả phân tích các mẫu thử giống hệt nhau bằng cùng một phương pháp phân tích, trong các điều kiện thí nghiệm khác nhau (người phân tích, trang thiết bị) trong các khoảng thời gian khác nhau [2]. Trong nghiên cứu này, độ tái lập nội bộ được tiến hành phân tích 10 lần giữa các ngày khác nhau (n=10), thực hiện thêm chuẩn trên 2 nền mẫu bánh mì và bánh quy.
Độ lặp lại và độ tái lập nội bộ được xác định qua độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD). Công thức tính SD và RSD như sau:
𝑆𝑆𝑆𝑆 =�∑(𝑆𝑆𝑖𝑖− 𝑆𝑆𝑡𝑡𝑡𝑡)2
𝑛𝑛 −1
𝑅𝑅𝑆𝑆𝑆𝑆(%) = 𝑆𝑆𝑆𝑆
𝑆𝑆𝑡𝑡𝑡𝑡 × 100%
Trong đó: Si là diện tích của pic điện di thứ i.
Stb là diện tích trung bình của n lần phân tích.
n là số lần phân tích lặp.
• Độ thu hồi (độ đúng)
Độ thu hồi chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của dãy lớn các kết quả thí nghiệm và các giá trị quy chiếu được chấp nhận. Do đó, thước đo độ đúng thường đánh giá qua sai số tương đối hay bằng cách xác định độ thu hồi qua thêm chuẩn.
Thực hiện thêm chuẩn sodium stearoyl lactylate ở 3 mức hàm lượng SSL (400 – 1600) mg/kg vào mẫu trắng bánh mì và bánh quy, tiến hành phân tích lặp lại 3-4 lần [2].
Độ thu hồi (H):
𝐻𝐻 =𝐶𝐶𝑡𝑡𝑡𝑡 𝐶𝐶𝑙𝑙𝑡𝑡 × 100 Trong đó:
H: Hiệu suất thu hồi (%).
Ctt: Nồng độ thực tế của mỗi chất phân tích thu được (tính theo đường chuẩn).
Clt: Nồng độ lý thuyết của mỗi chất phân tích tính toán từ lượng chuẩn thêm vào.
2.6. Ứng dụng phương pháp phân tích mẫu thực tế
Áp dụng các điều kiện phân tích HPLC-PDA và điều kiện xử lý mẫu đã tối ưu, tiến hành phân tích xác định hàm lượng Sodium stearoyl lactylate trong 20 mẫu thực được thu thập tại thị trường Hà Nội.
SSL được tính thông qua acid lactic từ các nguồn có chứa gốc lactate trong công thức, không bao gồm lượng acid lactic tự do. Trong các sản phẩm nguyên liệu
SSL thương mại, có 20% tỉ lệ acid lactic đến từ các nguồn sodium stearoyl lactylate, sodium palmitol-lactylate [26, 30]. Do đó, hàm lượng SSL được tính theo công thức:
X = C × 10020 Trong đó: X là hàm lượng SSL (mg/kg)
C: hàm lượng acid lactic tình từ đường chuẩn lactate dẫn xuất 100/20 là tỉ lệ 20% acid lactic trong các nguồn sodium stearoyl lactylate, sodium palmitol-lactylate.