3.1. Nghiên cứu xác định sodium stearoyl lactylate bằng HPLC-PDA
3.1.1. Khảo sát các điều kiện HPLC-PDA
Quét phổ từ 190 – 800 nm của chuẩn lactate dẫn xuất NPH ở nồng độ 200 mg/L. Phổ thu được như hình 3.1 cho thấy bước sóng hấp thụ mạnh tại các đỉnh 224 nm, 279 nm và 397 nm. Mặc dù tín hiệu của đỉnh ở khoảng 400 nm không phải là cao nhất, tuy nhiên, do bước sóng 400 nm là vùng phổ mà hầu hết các chất, thuốc thử và tạp chất hấp thụ rất yếu [34], nên nó được lựa chọn để định lượng lactate dẫn xuất trong nghiên cứu này.
Hình 3.1.Phổ hấp thụ của dẫn xuất lactate
3.1.1.2. Khảo sát cột tách sắc ký
Qua tham khảo các tài liệu [33, 31, 30] và điều kiện phòng thí nghiệm, khảo sát cột tách sắc ký sử dụng chuẩn lactate với dẫn xuất nitrophenyl hydrazine ở nồng độ 100 mg/L với 2 điều kiện phân tích như bảng 3.1.
200 250 300 350 400 450 500 550 nm
0 25 50mAU 10.425/ 1.00
205 261 321 482 508
224 279 397 485
Bảng 3.1 Điều kiện khảo sát cột tách sắc ký
Thông số Điều kiện 1 Điều kiện 2
Cột tách Symmetry C8
(5àm, 4,6 x 250mm)
Reliant C18 (5àm, 4,6 x 250mm) Tốc độ dòng 1 mL/phút 0,8 mL/phút
Pha động Acid formic 0,1% (A)
MeOH (B)
Acid formic 0,1% (A) Acetonitrile (B)
Chương trình rửa giải
Isocratic A: B (75:25, v/v)
Gradient
Thời gian (phút)
Nồng độ kênh A
Nồng độ kênh B
95,0 5,0
8,0 10,0 90,0
12,0 10,0 90,0
15,0 95,0 5,0
20,0 95,0 5,0
Kết quả phân tích trên cột C8 (hình 3.2A, 3.2B) cho thấy peak chất bị kéo đầu, gioãng chân còn khi phân tích trên cột C18 (hình 3.2C, 3.2D) tuy vẫn còn chưa tách được chất phõn tớch nhưng peak gọn và cõn đối hơn. Do đú, cột Reliant C18 (5àm, 4,6 x 250mm) được lựa chọn để có các khảo sát thêm.
Hình 3.2. Sắc ký đồ mẫu trắng và chuẩn trong khảo sát cột tách sắc ký
Sắc ký đồ phân tích: điều kiện 1 (hình 3.2A-mẫu trắng, 3.2B- mẫu chuẩn);
điều kiện 2 (hình 3.2C-mẫu trắng, 3.2D- mẫu chuẩn) 3.1.1.3. Khảo sát chương trình gradient
Sau khi chọn cột Reliant C18 (5àm, 4,6 x 250mm), tiến hành khảo sỏt chương trình gradient bằng cách cố định điều kiện pha động A: acid formic 0,1 % và pha động B: acetonitrile với các chương trình gradient như ở bảng 3.2.
Nhận thấy với chương trình gradient như tài liệu [33] chất phân tích được rửa giải ở khoảng phút thứ 7 – 8 và bị dính với peak dẫn xuất dư, pha động khi đó đang chuyển đột ngột từ 95% kênh A sang 90 % kênh B. Dẫn xuất lactate-NPH kém phân cực [32], do đó, sẽ được rửa giải nhanh khi chuyển qua pha động kém phân cực và khó tách khi chuyển qua pha động kém phân cực một cách đột ngột. Do đó, chúng tôi khảo sát kéo dài thời gian chuyển từ pha động phân cực sang pha hữu cơ kém phân cực và giảm tỉ lệ dung môi pha động kém phân cực giúp cho quá trình tách của chuẩn dẫn xuất và dẫn xuất dư được tốt nhất.
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min
0.0 2.5 5.0
mAU400nm,4nm
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5mAU(x10)
400nm,4nm
11.377/702888 12.139/141218
0.0 5.0 10.0 15.0 min
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50
mAU(x10) 400nm,4nm
0.0 5.0 10.0 15.0 min
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
mAU(x100) 400nm,4nm
3.2A 3.2B
3.2C 3.2D
Lactate-NPH
Lactate-NPH
Bảng 3.2. Điều kiện khảo sát gradient
Gradient 1
Thời gian Nồng độ kênh A Nồng độ kênh B
90,0 10,0
3,0 40,0 60,0
9,0 40,0 60,0
12,0 90,0 10,0
15,0 90,0 10,0
Tốc độ dòng 0,8 mL/phút
Gradient 2
Thời gian Nồng độ kênh A Nồng độ kênh B
90,0 10,0
5,0 70,0 30,0
8,0 70,0 30,0
12,0 90,0 10,0
15,0 90,0 10,0
Tốc độ dòng 0,8 mL/phút
Kết quả phân tích chuẩn lactate dẫn xuất nitrophenyl ở nồng độ 100 mg/L với 2 chương trình gradient cho thấy với chương trình gradient 1, lactate dẫn xuất và peak dẫn xuất dư bị dính, chưa tách ra được (Hình 3.3 A) còn với chương trình gradient 2, peak chuẩn dẫn xuất và dẫn xuất dư tách ra khỏi nhau tốt với hệ số phân giải R = 2,035 (Hình 3.3B). Do đó, chọn chương trình gradient 2 cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.3. Sắc ký đồ chuẩn dẫn xuất lactate-NPH với các chương trình
(gradient 1 (hình 3.3A) và chương trình gradient 2 (hình 3.3B))
3.1.1.4. Khảo sát dung môi kênh A và B
Khảo sát dung môi hữu cơ (kênh B)
Hai dung môi pha hữu cơ thường được sử dụng trong phân tích sắc ký là acetonitrile và methanol. Trong các tài liệu [31, 30] hai pha động trên đều được sử dụng và cho kết quả tốt. Tiến hành phân tích dẫn xuất lactate-NPH với pha động kênh B là acetonitrile và methanol với chương trình gradient 2 như đã khảo sát ở trên.
Hình 3.4. Sắc ký đồ phân tích sử dụng dung môi methanol
(mẫu trắng (hình 3.4A) và mẫu chuẩn lactate-NPH (hình 3.4B))
Từ sắc ký đồ 3.4B của chuẩn lactate-NPH khi phân tích bằng pha động methanol và 3.3B của chuẩn lactate-NPH khi phân tích bằng pha động acetonitrile cho thấy, pha động methanol không cho kết quả như kì vọng, trong đó, với pha động
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5mAU(x100)
400nm,4nm
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min
0.0 2.5 5.0 7.5
mAU(x10) 400nm,4nm
10.188/446788 10.756/157580
3.3A 3.3B
0.0 5.0 10.0 min
0.0 1.0 2.0
mAU400nm,4nm
0.0 5.0 10.0 min
0.0 1.0 2.0 3.0
mAU400nm,4nm
3.4A 3.4B
Lactate-NPH
Lactate-NPH
acetonitrile, cho peak sắc ký đẹp, đối xứng và hệ số phân giải tốt. Do đó, pha động acetonitrile được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
Khảo sát dung môi phân cực (kênh A)
Qua tham khảo tài liệu [33, 31, 30], dung môi phân cực được sử dụng là acid formic 0,1%. Thực hiện khảo sát nồng độ dung môi phân cực sử dụng nước, acid formic 0,05%; acid formic 0,1% và acid formic 0,2 % với chuẩn nồng độ 100 -200 mg/L và mẫu thử bánh mì. Kết quả cho thấy, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về hệ số tách R giữa các nồng độ dung môi khác nhau được sử dụng với cả chuẩn và mẫu phân tích (Hình 3.5). Xét trên dung môi thân thiện hơn và làm sạch hệ thống, chúng tôi chọn dung môi AF 0,1 % để tiến hành phân tích.
Tóm lại, điều kiện phân tích trên thiết bị HPLC-PDA được tối ưu như ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Điều kiện HPLC-PDA tối ưu phân tích SSL
Điều kiện Thông số
Cột tỏch Reliant C18 (5àm, 4,6 x 250mm) Tốc độ dòng 0,8 mL/phút
Pha động Acid formic 0,1% (A); Acetonitrile (B)
Chương trình rửa giải
Gradient Thời gian Nồng độ kênh A Nồng độ kênh B
90,0 10,0
5,0 70,0 30,0
8,0 70,0 30,0
12,0 90,0 10,0
15,0 90,0 10,0
Hình 3.5. Sắc ký đồ chuẩn và mẫu bánh mì ở các dung môi pha động khác nhau
(Hình 3.5A-dung môi nước; hình 3.5B-dung môi AF 0,05%; hình 3.5C-dung môi AF 0,1%; hình 3.5D-dung môi AF 0,2% - với mã 1 là chuẩn, mã 2 là mẫu bánh mì)
0.0 5.0 10.0 min
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
mAU(x100) 400nm,4nm
10.229/2001050 10.809/246839
0.0 5.0 10.0 min
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
mAU(x100) 400nm,4nm
10.214/910929 10.790/76933
0.0 5.0 10.0 min
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
mAU(x100) 400nm,4nm
10.199/1998819 10.766/251057
0.0 5.0 10.0 min
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00mAU(x100)
400nm,4nm
10.193/908606 10.762/78462
0.0 5.0 10.0 min
0.0 0.5 1.0 1.5
mAU(x100) 400nm,4nm
10.226/1393876 10.788/101864
0.0 5.0 10.0 min
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
mAU(x100) 400nm,4nm
10.207/921818 10.769/78290
0.0 5.0 10.0 min
0.0 2.5 5.0 7.5
mAU(x10) 400nm,4nm
10.192/834713 10.758/166332
0.0 5.0 10.0 min
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00mAU(x100)
400nm,4nm
10.169/906614 10.732/78838
3.5A1 3.5A2
3.5B1 3.5B2
3.5C1 3.5C2
3.5D1 3.5D2
Lactate-NPH Lactate-NPH
Lactate-NPH Lactate-NPH
Lactate-NPH Lactate-NPH
Lactate-NPH Lactate-NPH