3.1. Nghiên cứu xác định sodium stearoyl lactylate bằng HPLC-PDA
3.1.2. Khảo sát quá trình xử lý mẫu
Do công thức cấu tạo của SSL gồm nhóm ưa béo ảnh hưởng lớn đến tính chất vật lý (gốc trearoyl chuỗi dài) và nhóm ưa nước (gốc ester của acid lactic với ion natri) nên SSL hòa tan tốt trong các dung môi hữu cơ kém phân cực hoặc pha dầu [11]. Hơn nữa, khi phân tích SSL, sản phẩm cuối cùng được tính theo acid lactic nên các dung môi được chọn phải không hòa tan được acid lactic và muối lactate (nếu có) trong nền mẫu. Do đó, thực hiện khảo sát trên 3 nền dung môi hữu cơ đáp ứng các yêu cầu trên và phổ biến trong phòng thí nghiệm là ethyl acetate, hexane và chloroform với 2 nền bánh mì và bánh quy thêm chuẩn.
Kết quả ở hình 3.6 cho thấy ở cả 2 nền mẫu khảo sát là bánh mì và bánh quy, ethyl acetate cho hiệu suất thu hồi cao nhất sau đó là hexane và chloroform. Hơn nữa, ethyl acetate cũng được đánh giá là dung môi thân thiện hơn so với 2 dung môi còn lại [26]. Do đó, ethyl acetate là dung môi được chọn để chiết SSL trong nghiên cứu này. Hình ảnh sắc ký đồ theo phụ lục 1, bảng hiệu suất thu hồi theo dung môi chiết thể hiện ở phụ lục 2.
Hình 3.6. Biểu đồ hiệu suất thu hồi theo dung môi chiết
0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 120.0
Chloroform Hexan Ethyl acetat
Hiệu suất thu hồi (%)
Dung môi chiết Bánh mì Bánh quy
3.1.2.2. Khảo sát quá trình làm khô
Qua tham khảo các tài liệu [33, 31, 30], sau khi SSL được chiết ra khỏi nền mẫu bằng ethyl acetate, quá trình làm khô dung môi hữu cơ được diễn ra để làm giàu và thu được phần cặn rắn phục vụ cho quá trình xà phòng hóa được diễn ra. Các nghiên cứu đã được công bố sử dụng hệ thổi khô nitrogen cho quá trình làm khô này.
Tại phòng thí nghiệm của chúng tôi, quá trình làm khô có thể sử dụng hệ thổi khô nitrogen hoặc hệ cô quay chân không. Tiến hành khảo sát hai cách làm khô sử dụng nền mẫu bánh mì và bánh quy thêm chuẩn. Hiệu suất thu hồi của hai quá trình là tương đương nhau (hình 3.7), do đó, để tiết kiệm thời gian, quá trình làm khô bằng hệ cô quay chân không được sử dụng trong nghiên cứu này.
Hình 3.7. Hiệu suất thu hồi quá trình làm khô
3.1.2.3. Khảo sát quá trình làm sạch sử dụng SPE
Theo lí thuyết, sodium stearoyl lactylate là dạng ester, sau khi xà phòng hóa với KOH sẽ thu được muối stearate và muối lactate của potassium và khi cho HCl vào dung dịch trên sẽ thu được acid stearic và acid lactic. Tuy nhiên, khi chiết với ethyl actetate trong các nền bánh mì, bánh quy, các loại chất béo hoặc chất khác tan được trong pha hữu cơ này sẽ được chiết theo, sau quá trình xà phòng hóa sẽ thu được
0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0
Bánh mì Bánh quy
Hiệu suất thu hồi (%)
Nền mẫu
Thổi khô nitrogen Cô quay chân không
váng béo và tạp chất khác (hình 3.8). Do đó, cần có bước làm sạch sử dụng cột chiết pha rắn để thu được dung dịch tinh khiết nhất có thể và chứa acid lactic. Qua tham khảo các tài liệu [33, 31, 30], cột Intersil C18 500 mg/6mL (CL sciences, Tokyo, Japan) được sử dụng trong nghiên cứu này.
Hình 3.8. Hình ảnh váng béo sau khi xà phòng hóa
Thực hiện quá trình dẫn xuất hóa với dịch chiết được làm sạch qua cột chiết pha rắn và không được làm sạch qua cột chiết pha rắn cho thấy, khi không qua cột, sắc ký đồ thu được có tạp chất, peak bị dính tạp và khó tách (hình 3.9). Hơn thế nữa, hiệu suất thu hồi cũng giảm, có thể do dịch không qua cột còn chứa cặn hoặc tạp chất (hình 3.10), nên sẽ có các tác nhân cản trở đến quá trình dẫn xuất hóa hóa cũng như độ hấp thụ quang của detector. Do đó, bước làm sạch qua cột SPE là cần thiết trong nghiên cứu này.
Hình 3.9. Sắc kí đồ mẫu có/không qua cột SPE
(EA6- bánh mì không qua cột, EA14-bánh mì qua cột; EA1-bánh quy không qua
cột; EA13-bánh quy qua cột)
Hình 3.10. Hình ảnh mẫu có qua cột SPE và không qua cột SPE
(EA6- bánh mì không qua cột, EA14-bánh mì qua cột; EA1-bánh quy không qua
cột; EA13-bánh quy qua cột)
0.0 5.0 10.0 min
0.0 0.5 1.0 1.5
mAU(x100) 400nm,4nm
10.219/818013 10.781/71125
0.0 5.0 10.0 min
0.0 0.5 1.0 1.5
mAU(x10) 400nm,4nm
10.167/85740 10.461/4896610.732/180830
0.0 5.0 10.0 min
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
mAU(x100) 400nm,4nm
10.207/921818 10.769/78290
0.0 5.0 10.0 min
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
mAU(x100) 400nm,4nm
10.174/723037 10.738/1249078
EA6 EA14
EA13 EA1
Lactate-NPH Lactate-NPH
Lactate-NPH Lactate-NPH
3.1.2.3. Khảo sát độ đặc hiệu của cột SPE
Qua tham khảo các tài liệu [33, 31, 30], cột Intersil C18 500 mg/6mL (CL sciences, Tokyo, Japan) được sử dụng trong cả 2 nghiên cứu này, do đó, chúng tôi thực hiện qua cột Intersil C18 500 mg/6mL với 1 mL chuẩn 150 mg/L. Hiệu suất thu hồi 98,9 % cho thấy, cột đặc hiệu đối với acid lactic.
Hình ảnh tạp chất được giữ lại trên cột được thể hiện ở hình 3.11.
Hình 3.11. Hình ảnh cột Intersil C18 trước và sau khi qua cột
Như vậy, sau khi tiến hành khảo sát các thông số về điều kiện xử lý mẫu, quy trình xử lý mẫu tối ưu như hình 3.12.
Đồng nhất mẫu, cân 2,5g mẫu vào ống ly tâm
+ 20ml HCL 0,1M + 15mlethyl acetate + 2g NaCl
Lắc, ly tâm, lọc, chiết lặp
+ Đinh mức 50ml ethyl acetate + Cô quay chân không + 1ml KOH 1%, lắc
Thủy phân bể 95°C, 60 phút để bay hơi ethanol
+ 0,5 ml H2O (tránh làm khô) + 5 ml HCL 0,1M
+ Lọc qua giấy lọc
2 mL qua cột InertSep C18
(Hoạt hóa 10 mL MeOH, 10 mL HCl 0,1 M)
+ giửa giải 4ml HCL 0,1M
Định mức 10 mL bằng HCl 0,1M
Lấy 1 mL dịch sau qua cột
+ 200 àL EDC-HCl 0,25M + 200 àL 2-NPH 0,02M
Thủy phân 60oC trong 20 phút
+ 200 àL KOH 5%
Thủy phân 60oC trong 15phút
Làm nguội
Định mức 5 mL bằng HCl 0,1 M
+Lọc qua màng 0,2 àm vào vial
Phân tích trên thiết bị HPLC
Hình 3.12. Quy trình xử lý mẫu tối ưu