3.1. Nghiên cứu xác định sodium stearoyl lactylate bằng HPLC-PDA
3.1.3. Đánh giá phương pháp
Tiến hành phân tích mẫu trắng thuốc thử, mẫu trắng nền mẫu, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn tại mức hàm lượng 250 mg/kg. Sắc ký đồ của các mẫu trắng thuốc thử, mẫu trắng nền mẫu, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn được thể hiện trong hình 3.13.
Hình 3.13. Độ đặc hiệu của dẫn xuất lactic-NPH
(hình 3.13A- mẫu trắng thuốc thử, 3.13B- chuẩn 200 mg/L; 3.13C- mẫu trắng nền
mẫu; 3.13D- mẫu trắng thêm chuẩn)
Từ sắc ký đồ cho thấy, mẫu trắng thuốc thử và mẫu trắng nền mẫu không có tín hiệu của chất phân tích, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn có xuất hiện peak của dẫn xuất lactate-NPH với thời gian lưu chênh lệch nhau không quá 5%. Chứng tỏ, phương pháp có độ đặc hiệu cao.
0.0 5.0 10.0 min
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5mAU(x100)
400nm,4nm
10.213/2006314 10.779/404004
0.0 5.0 10.0 min
0.0 2.5 5.0 7.5
mAU400nm,4nm
10.808/90713
0.0 5.0 10.0 min
0.0 2.5 5.0 7.5
mAU(x10) 400nm,4nm
10.199/733991 10.766/49047
3.13A 3.13B
3.13C 3.13D
Lactate-NPH
Lactate-NPH
3.1.3.2. Xây dựng đường chuẩn
Các dung dịch có nồng độ biến thiên trong khoảng 0,5- 200 mg/L của chuẩn acid lactic tính từ lithium lactate dùng để dựng đường chuẩn được pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc. Mỗi dung dịch được phân tích 3 lần và tiến hành theo các điều kiện đã tối ưu ở bảng 3.3. Giá trị peak trung bình của các lần đo lặp lại là số liệu để dựng đường chuẩn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ. Các kết quả được trình bày trong bảng 3.4 và hình 3.14.
Bảng 3.4. Sự phụ thuộc của diện tích peak vào nồng độ của dẫn xuất lactate-NPH
STT Dẫn xuất lactate-NPH
Nồng độ (mg/L) Diện tích peak Bias %
1 0,5 5445 6,28
2 1,0 1058 4,31
3 2,0 21021 4,17
4 5,0 48008 -4,55
5 10,0 104145 3,66
6 20,0 195277 -2,77
7 80,0 806616 0,45
8 200,0 2006314 -0,05
Kết quả phương trình đường chuẩn và hệ số hồi quy tương ứng: y= 10036x + 111,64 với hệ số R2 = 1 cho thấy hệ số tương quan biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ chất phân tích tốt [2].
Hình 3.14. Đường chuẩn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ dẫn xuất lactate-NPH
3.1.3.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) lactate của phương pháp được thực hiện như mục 2.5.2 với nền mẫu bánh mì và bánh quy. Hình 3.15 dưới đây thể hiện một số sắc ký đồ về thử nghiệm giới hạn định lượng trên nền mẫu bánh mì và bánh quy.
Hình 3.15. Sắc ký đồ thí nghiệm LOD nền bánh mì (3.15A) và bánh quy (3.15B)
Kết quả cụ thể được thể hiện trong bảng 3.5 về giới hạn phát hiện và giưới hạn định lượng SSL trong nền bánh mì và bánh quy thêm chuẩn.
y = 10036x + 111,64
R² = 1
0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000
0.0 50.0 100.0 150.0 200.0
Diện tích (mAU)
Nồng độ (mg/L)
0.0 5.0 10.0 min
-1.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
mAU400nm,4nm
/10.258/6765
0.0 5.0 10.0 min
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
mAU400nm,4nm
/10.260/6191
3.15A 3.15B
Bảng 3.5. Kết quả giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp
Nền mẫu
Khối lượng cân (g)
Thể tích định mức (ml)
Hệ số pha loãng
k1 Hệ số
pha loãng
k2 Diện tích pic
Nồng độ mg/L
Hàm lượng mg/kg
TB mg/kg SD LOD
mg/kg
LOQ mg/kg R
Bánh mì
1 2,6133 50 0,5 0,4 6765 0,62 11,90
11,2 0,66 2,00 6,66 5,61 2 2,7507 50 0,5 0,4 7029 0,65 11,75
3 2,5349 50 0,5 0,4 6553 0,60 11,85 4 2,6935 50 0,5 0,4 6349 0,58 10,80 5 2,7688 50 0,5 0,4 6591 0,61 10,95 6 2,5977 50 0,5 0,4 6859 0,63 12,10 7 2,6772 50 0,5 0,4 6249 0,57 10,70 8 2,5932 50 0,5 0,4 6182 0,57 10,95 9 2,4538 50 0,5 0,4 5982 0,55 11,20 10 2,8641 50 0,5 0,4 6233 0,57 10,00
Bánh quy
1 2,8806 50 0,5 0,4 6191 0,57 9,85
9,87 0,48 1,45 4,82 6,83 2 2,8232 50 0,5 0,4 6220 0,57 10,10
3 2,7968 50 0,5 0,4 6242 0,57 10,25 4 2,5617 50 0,5 0,4 5507 0,51 9,85 5 2,6735 50 0,5 0,4 5994 0,55 10,30 6 2,9316 50 0,5 0,4 6100 0,56 9,55 7 2,4939 50 0,5 0,4 5293 0,49 9,75 8 2,8627 50 0,5 0,4 6133 0,56 9,85 9 2,6524 50 0,5 0,4 6041 0,55 10,45 10 2,9459 50 0,5 0,4 5617 0,52 8,75
Giá trị R đối với nền mẫu bánh mì là 5,61 và nền mẫu bánh quy là 6,83, đều nằm trong khoảng 4-10, phù hợp với yêu cầu của AOAC [2]. Như vậy, giới hạn phát hiện trên nền bánh mì và bánh quy lần lượt là 2,00 mg/L và 1,45 mg/L. Từ đó, giới hạn định lượng tương ứng là 6,66 và 4,82 mg/kg.
3.1.3.4. Đánh giá độ chụm và độ đúng của phương pháp
Tiến hành khảo sát độ lặp lại, tái lập của phương pháp như mục 2.5.4 với nền mẫu bánh mì và bánh quy. Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả phân tích độ lặp lại trên nền mẫu bánh mì (BM) và bánh quy (B)
Ký hiệu mẫu
Khối lượng cân mẫu
(g)
Thể tích định mức mL
Hệ số pha loãng k1
Hệ số pha loãng
k2
Diện tích pic
Nồng độ (ppm)
Hàm lượng mg/kg
Trung bình mg/kg
SD RSD
%
Bánh mì
BM-1 2,5414 50 0,5 0,4 205242 20,4 402,1
406,7 7,76 1,91 BM -2 2,3498 50 0,5 0,4 190938 19,0 404,6
BM -3 2,5137 50 0,5 0,4 209869 20,9 415,7 BM -4 2,5069 50 0,5 0,4 207808 20,7 412,8 BM -5 2,5734 50 0,5 0,4 203959 20,3 394,6 BM -6 2,5601 50 0,5 0,4 210874 21,0 410,1
Bánh quy
B -1 2,5168 50 0,5 0,4 293172 29,2 580,1
600,9 18,5 3,07 B -2 2,5006 50 0,5 0,4 307506 30,6 612,4
B -3 2,5522 50 0,5 0,4 295683 29,5 577,0 B -4 2,4939 50 0,5 0,4 301195 30,0 601,5 B -5 2,4584 50 0,5 0,4 306777 30,6 621,5 B -6 2,5091 50 0,5 0,4 308818 30,8 613,0
Bảng 3.7. Kết quả phân tích độ tái lập cách ngày trên nền mẫu bánh mì (BM) và
bánh quy (B)
Ký hiệu mẫu
Khối lượng
cân mẫu (g)
Thể tích định mức mL
Hệ số pha loãng k1
Hệ số pha loãng
k2
Diện tích pic
Nồng độ (ppm)
Hàm lượng mg/kg
Trung bình mg/kg
SD RSD
%
Bánh mì
BM-1 2,5414 50 0,5 0,4 205242 20,4 402,1
419,5 17,7 4,22 BM -2 2,3498 50 0,5 0,4 190938 19,0 404,6
BM -3 2,5137 50 0,5 0,4 209869 20,9 415,7 BM -4 2,5069 50 0,5 0,4 207808 20,7 412,8 BM -5 2,5734 50 0,5 0,4 203959 20,3 394,6 BM -6 2,5601 50 0,5 0,4 210874 21,0 410,1 BM -a 2,4292 50 0,5 0,4 215790 21,5 442,3
BM -b 3,2436 50 0,5 0,4 283656 28,3 435,5 BM -c 3,0576 50 0,5 0,4 268632 26,8 437,5 BM -d 3,2004 50 0,5 0,4 282829 28,2 440,1
Bánh quy
B -1 2,5168 50 0,5 0,4 293172 29,2 580,1
611,2 21,2 3,47 B -2 2,5006 50 0,5 0,4 307506 30,6 612,4
B -3 2,5522 50 0,5 0,4 295683 29,5 577,0 B -4 2,4939 50 0,5 0,4 301195 30,0 601,5 B -5 2,4584 50 0,5 0,4 306777 30,6 621,5 B -6 2,5091 50 0,5 0,4 308818 30,8 613,0 B -a 2,5145 50 0,5 0,4 306877 30,6 607,8 B -b 2,8152 50 0,5 0,4 352202 35,1 623,1 B -c 2,7675 50 0,5 0,4 349828 34,8 629,6 B -d 2,8199 50 0,5 0,4 365822 36,4 646,1
Kết quả trong bảng 3.6 và bảng 3.7 cho thấy, độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (RSDr) là 1,91% và 3,07% đối với nền mẫu bánh mì và bánh quy (đều nhỏ hơn mức 3,7 % theo yêu cầu của AOAC ở ngưỡng hàm lượng 0,1%). Độ lệch chuẩn tương đối tái lập khác ngày RSDR% là 4,22 % đối với mẫu bành mì và 3,47 % đối với mẫu bánh quy (đều nhỏ hơn 6,0% theo yêu cầu của AOAC ở ngưỡng hàm lượng 0,1%). Do đó phương pháp đạt yêu cầu về độ chụm theo AOAC.
Tiến hành khảo sát độ thu hồi của phương pháp như mục 2.5.4 với nền mẫu bánh mì và bánh quy. Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết qủa độ thu hồi trong nền mẫu bánh mì và bánh quy
mẫu Nền
thêm Mức chuẩn
Ký hiệu mẫu
Khối lượng cân (g)
Thể tích định (mL) mức
Hệ số loãng pha
k1 Hệ số loãng pha k2
Diện tích
pic
Nồng (ppm) độ
lượng Hàm mg/kg
Hiệu suất
thu hồi (%)
Bánh mì
Mức 1 400 mg/kg
spk-1a 2,5414 50 0,5 0,4 205242 20,4 402,12 102,2 spk-1b 2,3498 50 0,5 0,4 190938 19,0 404,59 95,1 spk-1c 2,5137 50 0,5 0,4 209869 20,9 415,73 104,5 spk-1d 2,5069 50 0,5 0,4 207808 20,7 412,76 103,5
spk-1e 2,5734 50 0,5 0,4 203959 20,3 394,64 101,6 spk-1f 2,6601 50 0,5 0,4 210874 21,0 394,73 105,0 Mức 2
1000 mg/kg
spk-2a 2,5467 50 0,5 0,4 507374 50,5 992,33 101,1 spk-2b 2,5276 50 0,5 0,4 488969 48,7 963,56 97,4 spk-2c 2,5057 50 0,5 0,4 501769 50,0 997,43 100,0 Mức 3
1500 mg/kg
spk-3a 2,5042 50 0,5 0,4 800264 79,7 1591,87 99,7 spk-3b 2,4061 50 0,5 0,4 799879 79,7 1655,97 99,6 spk-3c 2,0666 50 0,5 0,4 807853 80,5 1567,90 100,6
Bánh quy
Mức 1 600 mg/kg
spk-1a 2,5168 50 0,5 0,4 293172 29,2 580,11 97,3 spk-1b 2,5006 50 0,5 0,4 311868 31,1 621,12 103,5 spk-1c 2,5522 50 0,5 0,4 295683 29,5 576,97 98,2 spk-1d 2,4939 50 0,5 0,4 301195 30,0 601,47 100,0 spk-1e 2,4584 50 0,5 0,4 306777 30,6 621,46 101,9 spk-1f 2,5091 50 0,5 0,4 308818 30,8 612,96 102,5 Mức 2
900 mg/kg
spk-2a 2,5692 50 0,5 0,4 473072 47,1 917,13 98,2 spk-2b 2,5478 50 0,5 0,4 468374 46,7 915,64 97,2 spk-2c 2,5924 50 0,5 0,4 459745 45,8 883,31 95,4 Mức 3
1400 mg/kg
spk-3a 2,584 50 0,5 0,4 701115 69,8 1351,55 99,8 spk-3b 2,5195 50 0,5 0,4 713840 71,1 1411,31 101,6 spk-3c 2,6204 50 0,5 0,4 733991 73,1 1395,28 104,5
Kết quả phân tích hiệu suất thu hồi trong bảng 3.8 cho thấy, độ thu hồi của mẫu bánh mì trong khoảng 95,1 – 105,0% (ở mức thêm chuẩn 400 mg/kg); 97,4- 101,1%
(ở mức thêm chuẩn 1000 mg/kg) và 99,6- 100,6% (ở mức thêm chuẩn 1500 mg/kg) và đối với mẫu bánh quy trong khoảng 97,3 – 103,5% (ở mức thêm chuẩn 600 mg/kg);
95,4 – 98,2 % (ở mức thêm chuẩn 900 mg/kg) và 99,8- 104,5% (ở mức thêm chuẩn 1400 mg/kg). Các kết quả này đều trong khoảng 90 -107% giới hạn độ thu hồi cho phép của AOAC ở ngưỡng hàm lượng 100 ppm.
Kết quả tổng hợp độ lặp lại, độ tái lập và độ thu hồi được trình bày ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Bảng tổng hợp kết quả độ lặp lại, tái lập và độ thu hồi
Nền mẫu RSDr
(%)
RSDR
(%)
Hiệu suất thu hồi Mức
Thêm chuẩn (mg/kg)
Độ thu hồi (%)
Bánh mì 1,91 4,22
1 400 95,1-105,0
2 1000 97,4 – 101,1 3 1500 99,6 – 100,6
Bánh quy 3,07 3,47
1 600 97,3 – 103,5
2 900 101,8 – 104,7
3 1400 99,8 – 104,5
Yêu cầu AOAC ở ngưỡng hàm lượng
0,1% < 3,7% < 6,0% 95-105%
Kết quả tổng hợp trong bảng 3.9 cho thấy, phương pháp phân tích đều đáp ứng được các yêu cầu về độ đúng và độ chụm theo AOAC ở ngưỡng hàm lượng 0,1% [2].