TỔNG QUAN
Tổng quan về thuốc bảo vệ thực vật sinh học
1.1.1 Tình hình sử dụng thuốc bảo vệ thực vật sinh học
Hiện nay, nhiều quốc gia đang chú trọng phát triển sản xuất nông nghiệp bền vững, nhằm tăng năng suất và sản lượng nông sản để đảm bảo an ninh lương thực, đồng thời giảm thiểu tác động tiêu cực đến sức khỏe con người và môi trường Việc thích ứng với biến đổi khí hậu cũng là một yếu tố quan trọng Trong bối cảnh này, sử dụng thuốc bảo vệ thực vật sinh học được coi là giải pháp hiệu quả nhất để đạt được mục tiêu trên.
Theo nghiên cứu của Fortune Business Insights Pvt Ltd, thị trường thuốc BVTV sinh học đã ghi nhận mức tăng trưởng trung bình hàng năm 24% trong giai đoạn 2014-2017 Cụ thể, giá trị thị trường đạt 1,3 tỷ USD vào năm 2011, tăng lên 3,36 tỷ USD vào năm 2017 Dự báo, thị trường này sẽ đạt 6,42 tỷ USD vào năm 2023 và 10,19 tỷ USD vào năm 2025.
Thị trường thuốc trừ sâu sinh học tại Việt Nam đã đạt giá trị 30,7 triệu USD vào năm 2019 và dự kiến sẽ tăng lên 65,7 triệu USD vào năm 2024, với tỷ lệ tăng trưởng hơn 16,4% mỗi năm Đến tháng 6/2020, theo Thông tư số 10/2019/TT-BNNPTNT của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng tại Việt Nam đã ghi nhận hơn 231 hoạt chất với 721 tên thương phẩm được đăng ký lưu hành và sử dụng.
Hiệp hội rau quả Đà Lạt đã hợp tác với Trung tâm Nghiên cứu hóa sinh ứng dụng Tp Hồ Chí Minh để nghiên cứu và điều chế thành công các hoạt chất azadirachtin từ hạt và cành cây Neem, tạo ra ba loại thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) là Neemcide 3000EC, Neemcide 3000 SP, và Neemcide 3000 ES, giúp xua đuổi và diệt côn trùng gây hại cho cây trồng và kho lương thực Bên cạnh đó, các dự án nghiên cứu và ứng dụng thuốc BVTV sinh học như Phyto-M, SH-Silu, Capsaicin, Talin, Becberin, cùng với các chiết xuất từ cây bạch đàn, vỏ lụa hạt điều, bồ hòn, bình bát cũng đang được tiến hành đăng ký vào danh mục thuốc BVTV được phép sử dụng tại Việt Nam.
1.1.2 Thuốc bảo vệ thực vật sinh học
Thuốc trừ sâu sinh học, hay còn gọi là thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học, là những chất tự nhiên có khả năng kiểm soát dịch hại một cách an toàn và không độc hại Chúng bao gồm các sinh vật sống như thiên địch, các chế phẩm tự nhiên, chế phẩm vi sinh, và hóa chất truyền tin (semiochemical) được áp dụng nhằm quản lý hiệu quả dịch hại cho cây trồng.
Thuốc trừ sâu sinh học được quan tâm là vì sản phẩm này:
- Ít gây hại đến môi trường
- Chỉ tác động đến các sinh vật có chủ đích
- Hiệu quả mặc dù chỉ phun một lượng rất nhỏ và phân hủy nhanh nên hiện tượng phơi nhiễm thấp và tránh gây ô nhiễm
Thuốc trừ sâu sinh học phân thành 3 nhóm:
- Thuốc trừ sâu vi sinh
- Thuốc trừ sâu thảo mộc
1.1.2.1 Thuốc trừ sâu vi sinh
Thuốc trừ sâu vi sinh là sản phẩm chứa các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm, virus và tảo, được sử dụng làm hoạt chất (a.i) để kiểm soát côn trùng gây hại Một trong những loại thuốc trừ sâu vi sinh phổ biến nhất là vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt), có khả năng tiêu diệt côn trùng gây hại cho các loại cây trồng như bắp cải và khoai tây thông qua việc tiết ra độc tố đặc hiệu.
Thuốc trừ sâu sinh học được sản xuất bằng cách chuyển gen chứa protein diệt sâu bọ từ vi khuẩn Bt vào cây trồng Nhờ đó, cây trồng có khả năng tự sản xuất chất trừ sâu, giúp bảo vệ chúng khỏi dịch hại một cách hiệu quả.
1.1.2.3 Thuốc trừ sâu thảo mộc Đây là các chất trong tự nhiên như chiết xuất từ thực vật hoặc pheromone (chất dẫn dụ) dùng để kiểm soát dịch hại bằng các con đường khác nhau bao gồm độc tiếp xúc, độc vị độc hoặc xông hơi Tuy phổ tác động thường không rộng nhưng một số loại còn có khả năng diệt cả nhện hại cây Sau khi xâm nhập, thuốc nhanh chóng tác động đến hệ thần kinh, gây tê liệt và làm chết côn trùng Do thuốc trừ sâu thảo mộc nhanh bị phân huỷ, nên chúng không tích luỹ trong cơ thể sinh vật, trong môi trường và không gây hiện tượng sâu chống thuốc [3] Một số hoạt chất chiết xuất từ thực vật được dùng làm thuốc trừ sâu như:
Pyrethrin: có trong hoa loài Chrysanthemun leucanthemun và các cây
Chrysanthemum là một hoạt chất có tác động mạnh mẽ đến côn trùng qua con đường tiếp xúc, trong khi tác động đến nhện yếu hơn Hoạt chất này hoạt động bằng cách đóng kênh vận chuyển ion Na+, kéo dài giai đoạn mở và ngăn cản dẫn truyền xung thần kinh, dẫn đến cái chết nhanh chóng của côn trùng Thuốc chứa hoạt chất này được sử dụng để diệt côn trùng và nhện trên rau, chè, nhiều loại cây trồng, cây cảnh, cũng như côn trùng ký sinh trên gia súc và động vật trong nhà Đặc biệt, pyrethrin có độ độc rất thấp đối với con người, động vật máu nóng và môi trường.
Rotenon và các rotenoid là alkaloid có trong rễ, thân lá và hạt của một số cây thuộc họ Papilionaceae, đặc biệt là trong rễ cây Derris spp., nhất là Derris eleptica Các hợp chất này gây độc bằng cách ức chế quá trình chuyển hoá trong hô hấp, làm rối loạn chuyển hoá điện tử của NADH và dehydrogenase, đồng thời tách và vận chuyển hydro từ cơ chất đến ubiquinon Chúng cũng tác động đến enzyme citorom b, CX1, C và enzym oxydase, có vai trò xúc tác trong quá trình vận chuyển điện tử đến oxy, dẫn đến hoạt hoá oxy phân tử và coenzyme.
Q, làm giảm nghiêm trọng tiêu thụ oxi, ức chế hô hấp trong ty thể [7]
Azadirachtin (AZ) là một trong bốn hợp chất chính có khả năng diệt sâu bọ từ dịch chiết hạt và lá cây neem Với cấu trúc tương tự ecdysone, AZ hoạt động như một chất đối kháng, ngăn cản quá trình lột xác của côn trùng, từ đó giảm khả năng sinh sản, ngăn cản con cái đẻ trứng và rút ngắn tuổi thọ của côn trùng trưởng thành AZ cũng tiêu diệt trứng, gây ngán ăn cho ấu trùng và côn trùng trưởng thành, đồng thời ức chế sự phát triển từ ấu trùng đến nhộng và từ nhộng đến trưởng thành Ngoài việc diệt côn trùng, azadirachtin còn có khả năng tiêu diệt tuyến trùng và nấm, và đặc biệt, hoạt chất này hầu như không độc hại với cá, động vật thủy sinh, ong mật, chim và động vật hoang dã khác.
Matrine: hoạt chất có hiệu lực diệt sâu mạnh nhất trong dịch chiết cây khổ sâm
Matrine là một loại thuốc trừ sâu có tác dụng rộng rãi, hiệu quả trong việc diệt nhiều loại côn trùng chích hút và nhai, cũng như các loại nhện gây hại cho cây Chất này hoạt động bằng cách làm tê liệt hệ thần kinh trung ương của côn trùng, dẫn đến ngừng hô hấp và cái chết nhanh chóng của chúng Hơn nữa, Matrine còn có khả năng gây ngán ăn và xua đuổi bướm, giúp kéo dài hiệu quả sử dụng Đặc biệt, thuốc không có tác dụng nội hấp và xông hơi, ít độc hại đối với con người, động vật máu nóng và các sinh vật khác, đồng thời bị phân hủy nhanh chóng trong môi trường.
1.1.3 Điều kiện của một loại thuốc có thể gây độc cho sinh vật
1.1.3.1 Thuốc phải tiếp xúc được với sinh vật Đây là điều kiện tiên quyết để thuốc phát huy tác dụng Muốn thuốc tiếp xúc được với dịch hại nhiều nhất, người sử dụng phải nắm chắc đặc tính sinh vật học, sinh thái học của dịch hại và đặc tính của từng loại thuốc, tìm biện pháp xử lý thích hợp để thuốc tiếp xúc nhiều nhất với dịch hại , đồng thời, hạn chế thuốc tác động đến các sinh vật không là đối tượng phòng trừ, giảm nguy cơ gây hại của thuốc đến môi sinh, môi trường [3]
1.1.3.2 Thuốc phải xâm nhập được vào cơ thể sinh vật
Thuốc xâm nhập vào cơ thể sinh vật qua con đường tiếp xúc, hay còn gọi là thuốc ngoại tác động, có khả năng gây độc hại khi thẩm thấu qua biểu bì của chúng.
Thuốc xâm nhập vào cơ thể dịch hại qua con đường vị độc, hay còn gọi là thuốc có tác động đường ruột, gây độc cho sinh vật khi đi qua hệ tiêu hóa Độ pH của dịch ruột và thời gian thuốc tồn tại trong dạ dày và ruột non ảnh hưởng đáng kể đến hiệu lực của thuốc.
Thuốc xâm nhập qua đường hô hấp là những thuốc có khả năng bay hơi, gây độc không khí bao quanh dịch hại và gây độc cho sinh vật [11, 12]
Tổng quan về một số chiết xuất thảo mộc có khả năng kháng côn trùng
1.2.1 Cúc áo hoa vàng ( Spilanthes acmella L Murr.)
Cúc áo hoa vàng là loại cây thân nhỏ, có thể mọc đứng hoặc bò lan, chiều cao khoảng 0.4 - 0.7 m Lá cây có hình trứng hoặc thon dài với mép lá có răng cưa lớn hoặc hơi gợn sóng, kích thước phiến lá dài từ 3 - 7 cm và rộng từ 1 - 3 cm Hoa của cây mọc thành cụm ở đầu cành, có hình dáng hơi giống hình nón, mép hoa có cờ và màu sắc nhạt, chiều dài hoa khoảng 2 cm.
Cây có hoa dẹt với lá bắc hình bầu dục nhọn ở đầu, tràng hoa màu vàng và hoa hình ống ở giữa Quả của cây có hình bẹp, màu nâu nhạt và có 2 răng ở ngọn Loài cây này mọc hoang phổ biến khắp Việt Nam và cũng được tìm thấy ở một số nước trong khu vực Đông Nam Á.
Nghiên cứu của Maimulyanti và cộng sự đã xác định rằng cúc áo hoa vàng chứa các thành phần hóa học quan trọng như tannin, flavonoid, saponin, alkaloid và steroid Đặc biệt, hợp chất spilanthol thuộc nhóm alkamide cho thấy khả năng kháng côn trùng hiệu quả.
Nghiên cứu của Sharma cho thấy cúc áo hoa vàng có khả năng diệt côn trùng mạnh, đặc biệt là nhờ vào vỏ vạt và hợp chất spilanthol được chiết xuất từ loài hoa này Hoạt tính diệt côn trùng được đánh giá thông qua phương pháp tính độc trực tiếp đối với ấu trùng.
Plutella xylostella L được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25 ± 2°C và độ ẩm 65% Lá bắp cải cắt tròn 6.5 cm được nhúng vào các mẫu thử với nồng độ khác nhau, sau đó cho vào đĩa petri với 10 cá thể ấu trùng Sau 24 và 48 giờ, spilanthol ở nồng độ 2 g/L gây tử vong 95 - 100% ấu trùng, trong khi dịch chiết vỏ hạt từ methanol và hexane ở nồng độ 5 g/L lần lượt gây tử vong 60 - 70% và 80 - 90% Giá trị LC50 của spilanthol, dịch chiết methanol và hexane lần lượt là 1.49, 5.14, 5.04 g/L, cho thấy tiềm năng diệt côn trùng của cúc áo hoa vàng Nghiên cứu khác cho thấy cúc áo hoa vàng có khả năng kháng ăn đối với ấu trùng Leucinodes orbonalis, với dịch chiết dichloromethane gây ngán ăn mạnh nhất (68.88%) so với dịch chiết nước (45.48%) tại nồng độ 5% Ngoài ra, dịch chiết lá cúc áo hoa vàng cũng cho thấy hiệu quả diệt trừ tốt đối với ấu trùng muỗi Asdes aegypti và Culex quinquefasciatus, với nồng độ gây chết 90% lần lượt là 23.23 và 68.24 ppm.
1.2.2 Ớt ( Capsicum annuum L.) Ớt thuộc họ cà Solanaceae, là cây loại cỏ mọc hàng năm tại những nước ôn đới, sống lâu năm và thân phía dưới hóa gỗ ở những nước nhiệt đới Cây có rất nhiều cành, nhẵn Lá mọc so le, hình thuôn dài, đầu nhọn, phía cuống cũng thuôn hẹp, có cuống, phiến lá dài 2 - 4 cm, rộng 1.5 - 2 cm Hoa mọc đơn độc ở kẽ lá Quả mọc rủ xuống hay hướng lên trên (chỉ thiên), hình dáng thay đổi, khi thì tròn, khi thì dài, đầu nhọn, màu vàng hay đỏ Độ cay của ớt tùy theo các điều kiện khác nhau Ớt được trồng khắp nơi tại Việt Nam, có những loại mọc hoang [23]
Nghiên cứu cho thấy ớt chứa nhiều hợp chất hóa học quan trọng như phenolic, flavonoid, carotenoid, capsaicin và dihydrocapsaicin Bên cạnh đó, ớt cũng cung cấp các thành phần dinh dưỡng thiết yếu, bao gồm acid amin, acid béo, chất xơ và các nguyên tố vi lượng.
Nghiên cứu của Vinayaka và cộng sự đã chứng minh chiết xuất từ lá và quả của
Capsicum frutescens (L.) var Longa có khả năng kháng côn trùng đối với ấu trùng Aedes aegypti, trong đó cao chiết từ quả cho thấy hoạt tính hiệu quả hơn so với cao chiết từ lá Cụ thể, ở nồng độ 10 mg/mL, cao chiết lá không thể hiện hoạt tính sau 24 giờ, trong khi cao chiết quả đạt tỷ lệ tử vong lên tới 81%.
Trong một nghiên cứu, Ngai và cộng sự đã đánh giá hoạt tính kháng côn trùng của các chiết xuất phân đoạn từ quả ớt chỉ thiên (Capsicum annuum) trên ấu trùng Tenebrio molitor và Zophobas morio Kết quả cho thấy chiết xuất MeOH có khả năng gây tử vong từ 81 - 83% đối với Z morio và 76 - 88% đối với T molitor, trong khi chiết xuất hexane có hoạt tính kém nhất Đặc biệt, chiết xuất dichloromethane thể hiện hoạt tính mạnh nhất, gây chết toàn bộ cá thể ở nồng độ nhất định.
10 mg/mL ở cả 2 loài sau 1 ngày khảo sát [32]
Báo cáo của Li và cộng sự chỉ ra rằng cao chiết ớt có khả năng kháng 14 loại côn trùng gây hại trong nông nghiệp, không chỉ hiệu quả trong thí nghiệm phòng lab mà còn hoạt động tốt trong điều kiện thực tế trên đồng ruộng.
[33] Do đó, chiết xuất từ ớt có tiềm năng trong việc ứng dụng vào thuốc bảo vệ thực vật
Bình bát, thuộc họ Na (Annonaceae), là cây thân gỗ cao từ 6 đến 7.5 mét, với cành non có lông và cành già nhẵn Lá cây mọc so le, hình mác thuôn, dài 12 - 15 cm, rộng 4 cm, có gốc tròn và đầu nhọn, mặt trên nhẵn bóng, mặt dưới có ít lông tơ Hoa mọc ở kẽ lá, có 2 - 4 hoa màu vàng, với đài gồm 3 phiến hình tam giác và tràng hoa có 2 vòng Quả của cây hình tim, có 5 ô mờ, khi chín có màu vàng hoặc vàng pha đỏ, thịt quả màu trắng hoặc ngã vàng và ăn được Cây có nguồn gốc từ châu Mỹ và hiện nay được tìm thấy ở nhiều nơi trên thế giới như Ấn Độ, châu Phi, châu Úc Tại Việt Nam, cây mọc hoang và được trồng ở các vùng đất nhiễm phèn ven biển từ Bắc vào Nam.
Nghiên cứu về thành phần hóa học của bình bát cho thấy vỏ thân chứa tanin, hợp chất alkaloid và phenolic, trong khi lá chứa alkaloid, acid amin, carbohydrate, steroid, glycoside và tanin Rễ và hạt của cây này cũng chứa acetogenin, alkaloid và flavonoid Một số hợp chất acetogenin như annoreticuin, bullatacin, squamosine và rolliniastatin đã được phân lập và chứng minh có hoạt tính sinh học cao.
Nghiên cứu của Prijono cho thấy hoạt tính kháng côn trùng của cây họ Na (Annonaceae) trên loài Crocidolomia binotalis Z Cao chiết từ hạt của hai loại cây A glabra và A squamosa đạt tỉ lệ tử vong trên 90% ở nồng độ pha loãng 0.25% (w/v).
Nghiên cứu của Padmaja và cộng sự đã chỉ ra khả năng kháng côn trùng mạnh mẽ của cây bình bát Cao chiết hạt bình bát được pha loãng và tạo thành lớp film trên đĩa, sau đó cho con trưởng thành của loài mọt hại khoai Cylas formicarius vào, và theo dõi tỷ lệ tử vong sau 48 giờ Kết quả cho thấy, ở nồng độ 1%, tỷ lệ tử vong đạt 60% sau 5 ngày, trong khi các nồng độ thấp hơn chỉ thể hiện hoạt tính ở mức trung bình Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng phát hiện ba hợp chất acetogenin từ chiết xuất hạt bình bát có khả năng ức chế sự sinh trưởng và gây chết ấu trùng của các loài côn trùng như Callosobruchus chinensis và Plutella xylostella.
1.2.4 Mãng cầu xiêm ( Annona muricata L.)
Mãng cầu xiêm, thuộc họ Na (Annonaceae), là cây thân gỗ có chiều cao từ 5 đến 8 mét, với vỏ nâu và nhiều lỗ bì nhỏ Lá cây mọc so le, hình trái xoan ngọn giáo, có mũi nhọn và hương thơm, với 7-9 cặp gân phụ Hoa của cây mọc đơn độc ở thân hoặc nhánh già, có 3 lá đài nhỏ màu xanh và 6 cánh hoa, trong đó 3 cánh hoa ngoài màu xanh vàng và 3 cánh hoa trong màu vàng Quả của mãng cầu xiêm là quả mọng kép lớn, hình trứng, dài từ 25 đến 30 cm, có màu lục hoặc vàng, với bề mặt phủ nhiều mũi nhọn và chứa nhiều hạt màu nâu đen Cây có nguồn gốc từ Trung Mỹ và hiện nay được trồng phổ biến ở nhiều nước Đông Nam Á như Việt Nam, Thái Lan và Malaysia.
Tổng quan về côn trùng
Côn trùng, thuộc ngành động vật không xương sống, có bộ xương ngoài bằng kitin và cấu trúc cơ thể gồm ba phần, ba cặp chân, mắt kép và một cặp râu Đây là nhóm động vật đa dạng nhất trên Trái Đất, với hơn một triệu loài đã được mô tả, chiếm hơn một nửa số sinh vật sống Cấu tạo cơ thể côn trùng có sự phân đốt dị hình, với một số thay đổi ở đôi phần phụ, bao gồm chân và các cấu trúc khác như râu và hàm miệng Các phần phụ có thể có nguồn gốc từ đốt nguyên thủy hoặc không, như cánh và mang khí quản, tạo nên sự đa dạng trong hình dáng và cấu trúc cơ thể Để phân loại côn trùng, người ta thường dựa vào các đặc điểm hình thái như kích thước, hình dạng, màu sắc, kiểu râu đầu, cấu trúc miệng, và đặc điểm chân, cùng với các yếu tố sinh học và sinh thái học như kiểu biến thái, phương thức sinh sản và môi trường sống.
Nghiên cứu này tập trung vào việc tiến hành các thử nghiệm sinh học trên ấu trùng của hai bộ côn trùng, bao gồm bộ Cánh cứng (Coleoptera) và bộ Cánh vảy (Lepidoptera) Hai bộ này là một phần trong số tám bộ côn trùng có liên quan đến các loài dịch hại trong sản xuất nông nghiệp.
Bộ Cánh cứng là nhóm động vật lớn nhất với khoảng 250,000 loài, bao gồm cả loài có ích và có hại, phân bố rộng rãi Đặc điểm nổi bật của chúng là kích thước cơ thể đa dạng, từ những loài nhỏ bé chỉ 0.5 mm như côn trùng trong họ Corylophidae đến những loài lớn như bọ hung và xén tóc có kích thước lên đến 155 mm Chúng có đôi cánh cứng đặc trưng và vỏ cơ thể cũng thường hóa cứng Miệng kiểu gặm nhai, mắt kép có hình dạng tròn, oval hoặc hình quả thận, và thường không có mắt đơn Râu đầu có từ 10 đến 11 đốt với nhiều biến dạng khác nhau Mảnh lưng ngực trước rộng, chân có từ 3 đến 5 đốt, trong khi cánh trước được cấu tạo từ chất sừng hoặc da cứng bảo vệ cơ thể như một lớp mai Cánh sau được tạo thành từ chất màng, và bụng chia thành 10 đốt nhưng thường chỉ thấy 5-7 đốt.
Côn trùng bộ Cánh cứng là nhóm động vật biến thái hoàn toàn, với một số họ có hiện tượng biến thái phức tạp Sâu non có kiểu miệng nhai và hình thái cơ thể đa dạng, chia thành ba dạng: chân chạy, bọ hung và không chân Nhộng chủ yếu là nhộng trần, nhiều loài làm nhộng trong đất và được bao bọc bằng kén đất hoặc tàn dư thực vật Trứng thường có hình tròn hoặc bầu dục, với bề mặt vỏ trứng không có hoa văn Con trưởng thành thường đẻ trứng trong đất, trong vỏ thân cây, trong mô lá hoặc trong nước.
Tập tính sinh hoạt và cư trú của các loài côn trùng thay đổi theo từng giai đoạn phát triển, với sâu non sống trong đất gây hại cho rễ cây, trong khi giai đoạn trưởng thành có thể cắn hại lá hoặc thân cành như họ ánh kim và họ bọ hung Một số loài sâu non đục thân, trưởng thành gặm lá và vỏ cành, trong khi các loài khác có thể cắn khuyết lá, đục ruỗng thân hoặc đục khoét lá Ngoài ra, còn có những loài chuyên săn bắt côn trùng khác, sống ký sinh, hoặc ăn chất mục nát và xác chết của động thực vật Một số loài thậm chí còn chuyên ăn bào tử nấm hoặc cộng sinh trong các ổ côn trùng khác.
Bộ Cánh vảy, là bộ lớn thứ hai trong lớp côn trùng, bao gồm khoảng 140,000 loài ngài và bướm Chúng có cơ thể, cánh và chân được phủ bởi những lông vảy nhỏ như bụi phấn, do đó còn được gọi là bộ Cánh phấn Miệng của chúng có vòi hút, trong khi hàm trên thường thoái hóa chỉ còn lại một ít dấu vết hoặc không còn, và môi dưới cũng không tồn tại Râu môi dưới phát triển với 3 đốt, trong khi râu hàm dưới rất nhỏ hoặc không có Một số loài có miệng hoàn toàn thoái hóa, chỉ còn lại râu môi dưới.
Có 2 - 3 mắt đơn hoặc không có Râu đầu có đủ các hình dạng [58, 62]
Ngực trước nhỏ và mảnh, trong khi lưng ngực giữa phát triển và nhô lên Hai bên lưng ngực giữa có một đôi phiến chân cánh Chân dài và mảnh, với đốt chậu lớn hơn, đốt chuyển nhỏ, và đốt đùi ngắn hơn đốt chày, trong khi đốt chày có cựa và bàn chân có 5 đốt Côn trùng có hai đôi cánh với chất màng phủ lông vảy, tạo ra màu sắc và các đường vân ngang khác nhau, bao gồm vân mép ngoài, vân phụ mép ngoài, vân ngoài, vân giữa và vân trong Cánh còn có các đốm chấm với hình dạng không đồng nhất như hình bầu dục, hình tròn và hình quả thận Hệ thống mạch cánh của côn trùng bộ cánh vảy bao gồm mạch dọc và mạch ngang, với sự phân nhánh và sắp xếp khác nhau tùy thuộc vào từng họ.
Côn trùng bộ Cánh vảy là nhóm động vật biến thái hoàn toàn với sự đa dạng về hình thái và phương thức sinh sống Sâu non của chúng có nhiều chân và miệng kiểu gậm nhai với hàm trên phát triển mạnh mẽ Râu đầu ngắn, nằm gần hàm trên, và mỗi bên đầu có 6 mắt bên Ngực được chia thành 3 đốt, mỗi đốt mang một đôi chân, trong khi bụng có từ 2 đốt trở lên.
- 5 đôi chân ở vị trí ứng với các đốt bụng thứ 3, 4, 5, 6, 10 Riêng đôi chân ở đốt thứ 10 thường gọi là chân mông hoặc chân giả [62, 63]
Sâu non sống trên bề mặt cây, cuốn lá, đục thân và đục quả, chủ yếu ăn cây cỏ tươi và sản phẩm thực vật như hạt ngũ cốc Khi đã đủ sức, sâu non sẽ dệt kén hoặc làm bao lá, kén nôi trong thân cây hoặc trong đất để hóa nhộng Con trưởng thành đẻ trứng thành cụm, ổ hoặc rải rác, với một số loài có khả năng bảo vệ trứng bằng cách đẻ vào kẽ bẹ lá hoặc dùng lông để che phủ ổ trứng.
1.3.3 Đặc điểm hình thái và gây hại của loài Alphitobius diaperinus, Opisina arenosella, Diaphania indica a) Alphitobius diaperinus
Alphitobius diaperinus, một loài ấu trùng thuộc họ Tenebrionidae, có nguồn gốc từ Châu Phi, thường gây hại cho nông sản, đặc biệt là củ và ngũ cốc.
Con trưởng thành có kích thước nhỏ, dài khoảng 5.5 - 8 mm, với màu sắc chủ yếu là nâu hoặc đen Đầu của nó nhỏ và có phần thụt vào phía dưới mép trước của lưng ngực Râu đầu dài trung bình, hình sợi chỉ hoặc dùi đục Bàn chân trước có 5 đốt, trong khi bàn chân sau có 4 đốt, và mép sau của đốt bụng thứ nhất không bị chia cắt bởi đốt chân sâu.
Trứng có kích thước khoảng 1.5 mm, màu sắc từ trắng kem đến nâu vàng, có hình dáng thon và đầu hơi tròn Ấu trùng có cơ thể phân mảnh, chiều dài từ 7 đến 11 mm, với da cứng màu vàng nâu và bụng thuôn về phía sau Nhộng có chiều dài từ 6 đến 8 mm, màu trắng kem, với các chân xếp dọc theo cơ thể.
Con trưởng thành và sâu non thường ăn chất mùn, sống trong đất hoặc gỗ mục, tiêu thụ các chất mục của cây Chúng có khả năng đục khoét hạt ngũ cốc và các sản phẩm nông nghiệp trong kho, gây hại cho hạt giống và cây non Con trưởng thành hoạt động chủ yếu vào ban đêm, có hành vi giả chết và tiết ra mùi phòng ngự để bảo vệ bản thân.
Sâu đầu đen (Opisina arenosella) là ấu trùng thuộc họ Oecophoridae, phổ biến ở nhiều khu vực Đông Á Loài này được xem là dịch hại nghiêm trọng đối với cây dừa, gây thiệt hại lớn và làm giảm năng suất cây trồng Sâu đầu đen tồn tại trên cây ở mọi giai đoạn phát triển, từ ấu trùng đến bướm đêm, và chủ yếu sử dụng lá cây làm nguồn dinh dưỡng chính.
Trứng sâu đầu đen có hình cầu, màu trắng đục và chuyển sang màu hồng khi sắp nở, giai đoạn trứng kéo dài từ 4 đến 5 ngày Ấu trùng có màu sắc biến đổi từ vàng nhạt đến hồng nhạt với các sọc nâu dọc theo sống lưng, thường trải qua 5 tuổi, nhưng trong điều kiện phòng thí nghiệm có thể phát triển qua 8 giai đoạn trong 46 ngày Kích thước ấu trùng thay đổi từ dưới 4,0 mm ở giai đoạn 1 và 3 ngày tuổi, từ 4,0 đến 11,0 mm ở giai đoạn 4 đến 6 ngày tuổi, và lớn hơn 11,0 mm ở giai đoạn 7 và 8 ngày tuổi Sau khi hóa nhộng trên lá, nhộng có màu nâu nhạt và chuyển sang nâu sẫm khi sắp nở, giai đoạn này kéo dài khoảng 8 ngày Cuối cùng, chúng phát triển thành bướm đêm màu trắng xám, với con cái có râu dài hơn và ba đốm mờ trên cánh trước, trong khi con đực có lông tua rua ở đỉnh và mép cánh sau.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
Mục tiêu của đề tài
Hiện nay, lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học và dư lượng thuốc trong thực vật, nguồn nước, không khí đang gây ra những hậu quả nghiêm trọng cho sức khỏe con người và môi trường Do đó, việc tìm kiếm giải pháp nông nghiệp an toàn và hiệu quả trở thành yêu cầu cấp thiết Con người đang chuyển hướng sang phát triển nông nghiệp bền vững, đặc biệt là nông nghiệp hữu cơ, nhằm giảm thiểu tác động xấu của hóa chất Sử dụng các yếu tố sinh học không chỉ hiệu quả mà còn dễ phân hủy trong tự nhiên, không gây hại cho sức khỏe con người, đang trở thành xu hướng mới Thuốc bảo vệ thực vật sinh học được ưu tiên hàng đầu vì không để lại dư lượng trên nông sản, vấn đề này đang được người tiêu dùng đặc biệt quan tâm Với mục tiêu này, đề tài sẽ tiến hành nghiên cứu các nội dung liên quan.
Khảo sát khả năng kháng côn trùng của các chiết xuất thảo mộc
Khảo sát tính hiệp đồng khi kết hợp các chiết xuất thảo mộc
Xây dựng công thức chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học từ cao chiết
Đánh giá khả năng phòng trừ sâu bệnh trong điều kiện thực tế ngoài đồng ruộng
Nguyên vật liệu
2.2.1 Xử lý nguyên liệu thô
Nguyên liệu được thu hái từ nhiều địa điểm khác nhau, bao gồm cúc áo hoa vàng từ huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long vào tháng 10/2020; bình bát và hạt mãng cầu xiêm từ Bến Tre vào tháng 2/2021; bồ hòn từ miền Trung và Tây Nguyên vào tháng 11/2020; và ớt từ các nhà vườn ở Đà Lạt vào tháng 3/2021.
Các nguyên liệu sau khi thu hoạch (ngoại trừ bồ hòn, hạt bình bát và hạt mãng cầu xiêm) sẽ được phơi khô sơ bộ ngoài trời, sau đó được sấy thông gió ở nhiệt độ 50 độ C.
60 °C đến khi đạt độ ẩm thấp hơn 12% và được bảo quản trong túi kín có chứa gói hút ẩm
Hoạt chất thương mại Aza 30%, polysorbate 80 (Tween 80), propylene glycol (PG), tinh dầu sả java, dầu neem, alcohol ethoxylate, ethanol 96°.
Chiết xuất dược liệu
Nguyên liệu được nghiền nhỏ trước khi chiết xuất, trong đó nguyên liệu dạng quả và hạt chỉ cần phá vỡ sơ bộ Ethanol 96° được sử dụng làm dung môi chiết Quá trình chiết diễn ra hai lần, mỗi lần kéo dài 45 phút ở nhiệt độ 60 °C, với tỷ lệ dung môi lần đầu là 1:7 (w/w) và lần thứ hai là 1:5 (w/w), cùng với tốc độ khuấy 400 vòng/phút.
Hiệu suất chiết được tính theo công thức (%) 1 (1 1 ) 100
Trong đó: H (%): hiệu suất chiết m1: khối lượng cao chiết thu được m: khối lượng nguyên liệu h1: độ ẩm cao chiết h: độ ẩm nguyên liệu
Khảo sát hoạt tính kháng côn trùng
Ấu trùng Alphitobius diaperinus từ 10 - 20 ngày tuổi được cung cấp bởi trại nuôi sâu giống ở huyện Hóc Môn để tiến hành các thử nghiệm sinh học
2.4.1 Xác định tính độc tiếp xúc
Phương pháp khảo sát tính độc tiếp xúc của các mẫu cao chiết được thực hiện theo phương pháp của Supawan và cộng sự, với một số điều chỉnh phù hợp Cao chiết được hòa tan trong hỗn hợp 2 mL ethanol 96° và 5 mL dung dịch Tween 80 0,1% Sau đó, 2 mL dung dịch thử được cho vào chai phun sương, và 20 cá thể ấu trùng được đặt trong đĩa petri ở nhiệt độ 30 ± 1 °C, tiến hành phun mẫu thử lên cá thể Mỗi lần thao tác xịt 2 - 3 lần với khoảng cách 15 - 20 phút để tránh cá thể bị ngạt nước Dung môi pha mẫu được sử dụng làm đối chứng âm, và số lượng ấu trùng tử vong được xác định sau 24 giờ Độ hiệu quả (hay tỷ lệ tử vong) của mẫu thử được tính theo công thức Abbott.
Trong đó: H: độ hiệu quả
C: số lượng cá thể sống trước khi phun T: Số lượng cá thể sống sau khi phun
2.4.2 Xác định khả năng kháng ăn
Khả năng kháng ăn của các mẫu cao chiết được nghiên cứu theo phương pháp của Maqsood và cộng sự với một số điều chỉnh Mẫu cao chiết được hòa tan trong ethanol 96° với nồng độ đủ để gây chết toàn bộ cá thể trong thử nghiệm độc tính tiếp xúc Lá được cắt thành hình vuông 4 cm x 4 cm, nhúng vào mẫu thử, để khô tự nhiên và đặt vào giữa đĩa petri Sau đó, 20 cá thể ấu trùng được thả lên đĩa và kết quả được quan sát sau 24 giờ.
2.4.3 Khảo sát tính hiệp đồng của các cao chiết
Việc kết hợp nhiều chất trừ sâu không chỉ tăng hiệu lực mà còn giảm số lần phun và chi phí, đồng thời tiêu diệt nhiều loại dịch hại cùng lúc Qua khảo sát tính độc tiếp xúc và khả năng kháng ăn, các cao chiết tiềm năng sẽ được lựa chọn để đánh giá khả năng tương tác Các thí nghiệm sẽ được thực hiện tại nồng độ LC50 của từng cao chiết, pha thành hỗn hợp với các tỉ lệ 1:50 và 1:50:2.
LC 2 LC , LC LC 50 1 : 50 2 , 2LC LC 50 1 : 50 2 , LC 50 1 :2LC 50 2 Khả năng tương tác giữa các mẫu thử được đánh giá theo 2 mô hình cơ bản: a) Mô hình tác động đồng thời lên cùng vị trí (mô hình 1)
Mô hình 1 giả thuyết rằng hai cao chiết tác động đồng thời lên cùng một vị trí receptor, từ đó làm tăng hoặc giảm độc tính của hỗn hợp sau khi phối trộn lên đối tượng thí nghiệm Giá trị kết quả kỳ vọng của mô hình 1 được tính theo công thức.
(2) Trong đó: EC x mix : tổng nồng độ của hỗn hợp gây x% tử vong (mg/mL) p i : phần khối lượng của cấu tử thứ i trong hỗn hợp x i
EC : nồng độ gây tử vong x% của cấu tử thứ i n: số cấu tử trong hỗn hợp b) Mô hình tác động lên hai vị trí riêng biệt (mô hình 2)
Mô hình này giả thuyết rằng các cao chiết ảnh hưởng đến các vị trí khác nhau trên một cá thể, dẫn đến sự thay đổi độc tính của hỗn hợp Mô hình 2 được coi là phương pháp giải quyết vấn đề dựa trên xác suất Giá trị kết quả kỳ vọng của mô hình 2 được tính theo một công thức cụ thể.
Trong đó: E c( ) mix : xác suất tử vong của hỗn hợp (%)
E c : xác xuất tử vong của cấu tử thứ i theo nồng độ riêng trong hỗn hợp (%) n: số cấu tử trong hỗn hợp
Sự chênh lệch giữa giá trị thực tế và giá trị kỳ vọng được thể hiện qua hệ số MDR (model deviation ratio), được tính theo công thức cụ thể.
MDR = Giá trị kỳ vọng/Giá trị thực nghiệm + Mô hình 2:
MDR = Giá trị thực nghiệm/Giá trị kỳ vọng
Khả năng tương tác giữa các cao chiết được đánh giá thông qua hệ số MDR với:
- MDR > 2: các cao chiết thể hiện tính hiệp đồng
- 0.5 < MDR < 2: các cao chiết cộng tính với nhau
- MDR < 0.5: các cao chiết thể hiện tính đối kháng
Xây dựng công thức chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học từ cao chiết
Các hoạt chất thường dễ bị phân huỷ do nhiều yếu tố vật lý và hóa học từ môi trường như ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ, pH và quá trình oxy hóa Sự phân huỷ này dẫn đến việc mất đi hoạt tính tự nhiên của chúng, làm giảm giá trị hiệu quả của các hoạt chất.
Việc sử dụng cao chiết dưới dạng chế phẩm giúp bảo vệ các hợp chất khỏi sự phân hủy và nâng cao hoạt tính của sản phẩm Nghiên cứu này đã phát triển chế phẩm dưới dạng nhũ tương đậm đặc (EC).
Trước khi tiến hành phối trộn, các cao chiết được xác định hàm lượng hoạt chất Bột Aza 30% được cung cấp bởi công ty Rynan, trong khi hàm lượng capsaicin trong cao chiết ớt được định lượng bởi Trung tâm Sâm và dược liệu Đối với chiết xuất hạt mãng cầu, hàm lượng acetogenin được xác định thông qua tổng hàm lượng lacton theo phương pháp Kedde Giá trị hàm lượng hoạt chất trong các cao chiết được thể hiện trong bảng.
Bảng 2.1: Hàm lượng hoạt chất trong cao chiết
Mẫu Hoạt chất Hàm lượng (%, w/w)
Cao chiết hạt mãng cầu xiêm Acetogenin 5.29
Chế phẩm NP được tạo ra bằng cách hòa tan hoàn toàn các cao chiết trong chất hoạt động bề mặt (50%, w/w) với tốc độ khuấy 400 rpm ở nhiệt độ 65 °C Sau đó, tinh dầu sả Java và dầu neem (25% w/w) được thêm vào và khuấy trong 15 phút Cuối cùng, hỗn hợp được làm lạnh về nhiệt độ phòng sau khi thêm nước vào hệ Thành phần của chế phẩm được trình bày trong Bảng 2.2.
Bảng 2.2: Thành phần các chất trong chế phẩm
STT Thành phần Tỉ lệ (%)
STT Thành phần Tỉ lệ (%)
Đánh giá khả năng phòng trừ nấm và sâu bệnh trong điều kiện thực tế ngoài đồng ruộng
Phương pháp được tiến hành dựa trên phương pháp của Bùi Lan Anh và cộng sự
Thí nghiệm được tiến hành với ba công thức: đối chứng âm, mẫu thử và một công thức thuốc có sẵn trên thị trường làm đối chứng dương Mỗi thí nghiệm được lặp lại ba lần và bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh, với diện tích mỗi ô thí nghiệm là 1 m² Các ô thí nghiệm được ngăn cách bằng các tấm nhựa để tránh hiện tượng phơi nhiễm chéo giữa các công thức.
1: thí nghiệm được phun với đối chứng âm 2: thí nghiệm được phun với mẫu thử 3: thí nghiệm được phun với đối chứng dương Hiệu quả phòng trừ được tính theo công thức (1)
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Chiết xuất các hoạt chất từ thảo mộc
Nguyên liệu sau khi xử lý được chiết xuất bằng ethanol 96° trong 45 phút ở nhiệt độ 60 °C, với tỉ lệ rắn/lỏng 1/7 (g/mL) cho lần chiết thứ nhất và 1/5 (g/mL) cho lần chiết thứ hai Kết quả cho thấy hạt bình bát có hiệu suất chiết cao nhất (15.7% w/w), nhờ chứa nhiều hợp chất cao phân tử như annonaceous acetogenins và acid amide béo So với các nghiên cứu toàn cầu, hiệu suất chiết của các loại cây như ớt (11.3%) và thanh hao hoa vàng (4.9%) tương đương hoặc thấp hơn Hiệu suất chiết cúc áo hoa vàng (12.1%) không chênh lệch lớn so với nghiên cứu trước đó (16.18%) Tuy nhiên, hạt bình bát, mãng cầu xiêm và bồ hòn có sự chênh lệch lớn về hiệu suất chiết, lần lượt là 15.7%, 6.9% và 10% so với các báo cáo trước đó (1.5%, 44.6% và 21.9%) Nguyên nhân có thể do quá trình sơ chế nguyên liệu chỉ làm vỡ sơ bộ, cùng với phương pháp chiết và tỉ lệ dung môi cũng ảnh hưởng đến kết quả trích ly.
Hình 3.1: Hiệu suất thu cao của các loại cây
Hoạt tính kháng côn trùng của các chiết xuất thảo mộc
Khi phun thuốc trừ sâu, các loại thuốc này gây tử vong cho sâu bệnh qua nhiều cơ chế khác nhau như độc tính tiếp xúc, khả năng kháng ăn dẫn đến chết đói, và độc tính đường ruột khi ăn phải Nghiên cứu này khảo sát độc tính của các loại cao chiết thông qua hai phương pháp: tính độc tiếp xúc và khả năng kháng ăn Ấu trùng Alphitobius diaperinus được chọn làm mẫu thí nghiệm do có hình dáng và đặc tính sinh học tương tự như loài sâu Tenebrio Molitor, loài sâu thường được sử dụng để rà soát thuốc trừ sâu sinh học.
Để thuốc bảo vệ thực vật phát huy tác dụng, chúng cần tiếp xúc với dịch bệnh Yếu tố đầu tiên khảo sát hoạt tính kháng côn trùng là khả năng gây độc tiếp xúc đối với sâu bệnh, tức là khả năng tác động trực tiếp lên cơ thể sinh vật qua lớp biểu bì Khả năng kháng sâu của các mẫu cao chiết được đánh giá dựa trên nồng độ gây chết 50% (LC50) và nồng độ gây chết 100% (LC100 thực tế) theo phương pháp độc tiếp xúc Giá trị LC50 và LC100 thực tế càng thấp chứng tỏ hoạt tính kháng sâu của mẫu thử càng mạnh Mẫu đối chứng là Shertin 5.0 EC (abamectin 50 g/L) được sử dụng để so sánh và đánh giá hiệu quả của các cao chiết.
Sau 24 giờ thử nghiệm, một con sâu được coi là chết khi không có dấu hiệu cử động dưới tác dụng của lực vừa đủ lên bụng Độc tính tiếp xúc của cao chiết cúc áo hoa vàng thể hiện qua đường cong đáp ứng liều lượng, cho thấy hoạt chất trong nó hấp thụ nhanh chóng vào cơ thể sinh vật, dẫn đến độc tính cao khi đạt nồng độ tích lũy Mặc dù nồng độ LC50 của chiết xuất này tương đối cao, nhưng liều lượng cần thiết để đạt tỷ lệ tử vong 90% lại khá thấp, gần bằng giá trị LC90 của các chiết xuất từ hạt mãng cầu xiêm và hạt bình bát Tuy nhiên, các đường cong có độ dốc cao từ các loại cây như ớt, thanh hao hoa vàng và bồ hòn cho thấy khoảng tăng nhanh đáp ứng theo nồng độ rộng hơn, với sự thay đổi nhỏ trên trục hoành dẫn đến thay đổi lớn về nồng độ Do đó, hoạt tính của cao chiết cúc áo được đánh giá cao hơn so với ba loại cây này.
Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng hạt mãng cầu xiêm và hạt bình bát có hoạt tính mạnh hơn nhiều so với các mẫu thử khác, với độ dốc đồ thị thể hiện rõ sự khác biệt này Nguyên nhân có thể do đồ thị của chúng lệch về phía bên trái trục hoành, cho thấy nồng độ đáp ứng cần thiết thấp hơn so với các loại cây khác Điều này được khẳng định qua việc so sánh với mẫu chứng dương trên thị trường, nơi đồ thị cũng lệch qua trái trục tung, minh chứng cho hoạt tính vượt trội của chúng.
Hình 3.2: Đường cong đáp ứng liều lượng của các chiết xuất
Hiệu quả kháng côn trùng của các cao chiết được xác định chính xác thông qua các giá trị LC50 và LC100, như thể hiện trong Bảng 3.1 và Hình 3.3.
Bảng 3.1: Giá trị LC 50 và LC 100 thực tế của cao chiết các loài cây và chế phẩm sinh học đối với loài Alphitobius diaperinus
Mẫu thử LC 50 (mg/mL) LC 100 thực tế (mg/mL)
Aza 30% Không thể hiện độc tính ở nồng độ 40 mg/mL - Ớt 12.7 0.4 30
Hình 3.3: Giá trị LC 50 của các cao chiết đối với loài Alphitobius diaperinus
EC Ớt Cúc áo hoa vàng Bình bát Bồ hòn Thanh hao hoa vàng Mãng cầu xiêm
Theo Hình 3.3, các loài cây khảo sát đều có hoạt tính độc tiếp xúc tốt đối với loài A diaperinus, trong đó cao chiết hạt bình bát đạt giá trị LC50 2.8 mg/mL, nhưng vẫn thấp hơn nhiều so với chế phẩm sinh học trên thị trường với LC50 chỉ 0.2 mg/mL Hạt cây mãng cầu xiêm, cùng chi với bình bát, cũng cho thấy hoạt tính kháng côn trùng tốt với LC50 3.4 mg/mL, chỉ kém hơn hạt bình bát 1.24 lần Các kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Prijono và các cộng sự trên thế giới.
Giá trị LC50 của cao chiết nước hạt bình bát đối với loài Crocidolomia binotalis là 2.625 mg/mL, trong khi cao chiết cồn từ lá mãng cầu xiêm có giá trị LC50 xấp xỉ 3 mg/mL, cho thấy hoạt tính kháng côn trùng của chúng tương đối tương đồng Hoạt tính này được cho là do các hợp chất acetogenins, có khả năng ức chế quá trình sản xuất năng lượng tế bào tương tự như cơ chế của rotenone, một chất độc tự nhiên đối với côn trùng và cá Ngoài ra, acetogenins còn gây độc cho ti thể bằng cách khóa chuỗi hô hấp tại phức hợp I, dẫn đến giảm mức ATP và ảnh hưởng đến chuỗi chuyền điện tử, từ đó kích thích quá trình chết tế bào theo chu trình (apoptosis), một hình thức chết tế bào được điều chỉnh bởi chương trình nội bào.
Cao chiết bồ hòn có hoạt tính tốt thứ ba, nhưng kém hơn so với cao chiết hạt bình bát, với giá trị LC50 là 7.2 mg/mL, gấp 2.6 lần Saponin thường được biết đến là chất gây ngán ăn cho côn trùng, nhưng một số nghiên cứu cũng chỉ ra tính độc tiếp xúc của chúng Nguyên nhân tử vong ở côn trùng được cho là do co giật, giảm lượng oxy tiêu thụ và suy giảm khả năng thăng bằng khi tiếp xúc với cao chiết Tuy nhiên, việc ứng dụng saponin trong thực tế gặp khó khăn do cấu trúc phân tử lớn và các gốc đường dễ bị phân huỷ trong điều kiện môi trường nhất định, dẫn đến mất hoạt tính.
Hai mẫu chiết xuất từ ớt và cúc áo hoa vàng cho thấy hoạt tính tương đồng với giá trị LC50 lần lượt là 12.7 mg/mL và 12.60 mg/mL, nhưng hoạt lực của chúng khá yếu so với cao chiết hạt bình bát Mặc dù vậy, giá trị này vẫn cao hơn nhiều so với các nghiên cứu quốc tế, như báo cáo của Arújo và cộng sự.
LC50 của cao chiết cúc áo hoa vàng là 0.011 mg/mL đối với ấu trùng muỗi Aedes aegypti, trong khi giá trị LC50 của chiết xuất ớt là 0.097 mg/mL đối với muỗi Culex quinquefasciatus, theo nghiên cứu của Aivazi Sự khác biệt này có thể được giải thích bởi cấu tạo cơ thể khác nhau giữa ấu trùng hai loài muỗi và bọ cánh cứng, với cả hai giá trị LC50 cho ấu trùng muỗi đều nhỏ hơn đáng kể Hoạt chất chính trong ớt, thuộc họ capsaicinoid, có khả năng gây rối loạn trao đổi chất, tổn thương màng tế bào và ảnh hưởng đến chức năng hệ thần kinh.
Hoạt tính sinh học của cúc áo hoa vàng chủ yếu đến từ các alkamides, đặc biệt là spilanthol, có khả năng gây kích thích tức thì tại dây thần kinh vùng cerci, sau đó dẫn đến sự ức chế hoàn toàn hoạt động của dây thần kinh này Các alkamide trong cúc áo hoa vàng được chứng minh là vô hại đối với hầu hết động vật có xương sống nhưng lại độc đối với động vật không có xương sống Điều này mở ra tiềm năng lớn cho việc ứng dụng cúc áo hoa vàng trong phát triển thuốc trừ sâu sinh học.
Thanh hao hoa vàng, mặc dù nổi bật với hàm lượng cao alkaloid và sesquiterpene, lại có hoạt tính sinh học kém nhất trong số các loài cây được nghiên cứu, với giá trị LC50 chỉ đạt 14.3 mg/mL, mặc dù nó được coi là an toàn khi sử dụng làm dược liệu.
Giá trị hoạt tính của cao chiết acetone đối với loài bọ Eurygaster integriceps trưởng thành thấp hơn nhiều so với giá trị LC50 là 322.24 mg/mL Điều này cho thấy rằng lớp vỏ và biểu bì của bọ trưởng thành dày hơn so với các loài ấu trùng, do đó cần một lượng hoạt chất lớn hơn để có thể thâm nhập và gây độc cho chúng.
Theo Hình 3.4, nồng độ tử vong hoàn toàn của hầu hết các loại cao chiết đều tương đương nhau, đạt 30 mg/mL, ngoại trừ cao chiết hạt bình bát với LC100 thực tế là 20 mg/mL Điều này chứng tỏ khả năng kháng côn trùng mạnh mẽ nhất thuộc về cao chiết thanh hao hoa vàng, với LC100 thực tế là 40 mg/mL Tuy nhiên, hoạt tính của các loại cao chiết này vẫn còn thấp hơn nhiều so với chế phẩm sinh học trên thị trường, khi nồng độ LC100 thực tế của chúng chỉ là 1 mg/mL.
Hình 3.4: Giá trị LC 100 thực tế của các cao chiết đối với loài Alphitobius diaperinus
Khả năng kháng ăn của sâu bệnh là khả năng làm giảm chất lượng thức ăn một cách đáng kể, do một số hoạt chất gây ra phản ứng phòng vệ Việc chỉ sử dụng độc tính tiếp xúc không đủ để đảm bảo hiệu quả của thuốc trong thực tế ngoài đồng ruộng Do đó, các mẫu thử sau khi thí nghiệm độc tiếp xúc sẽ được khảo sát khả năng kháng ăn ở nồng độ gây chết toàn bộ cá thể ấu trùng Đồng thời, nồng độ gây chết 50% cũng được đánh giá để so sánh khả năng kháng ăn với hỗn hợp ở nồng độ LC50.
EC Ớt Cúc áo hoa vàng Bình bát Bò hòn Thanh hao hoa vàng mãng cầu xiêm
Khả năng tương tác giữa các chiết xuất lên hoạt tính hỗn hợp
Sau khi khảo sát hoạt tính của từng loại cao chiết, một số loài cây phù hợp đã được chọn để thử nghiệm tính tương tác nhằm sử dụng nồng độ LC50 để tạo ra hỗn hợp có khả năng gây tử vong cao Hoạt tính của ớt và cúc áo hoa vàng tương đương, tuy cúc áo hoa vàng có độ lành tính tốt hơn nhưng ớt lại phổ biến hơn, dễ dàng tìm thấy ở các nhà vườn Tương tự, bình bát và mãng cầu xiêm có cùng họ, nhưng hạt bình bát có hiệu suất chiết và hoạt tính tốt hơn, trong khi hạt mãng cầu xiêm lại phổ biến hơn do dễ dàng thu thập từ phế phẩm làm mứt và sinh tố Cuối cùng, bồ hòn được chọn vì có hoạt tính độc tiếp xúc tốt và khả năng kháng ăn vẫn được duy trì ở nồng độ cao.
LC50 Chính vì vậy, ở thí nghiệm tiếp theo sẽ tiến hành thử nghiệm tương tác theo cặp giữa ba mẫu cao ớt, hạt mãng cầu xiêm và bồ hòn
Các thí nghiệm khảo sát tính tương tác được thực hiện tại nồng độ LC50 của từng cao chiết và được pha thành hỗn hợp ở các tỉ lệ 1 50 1 : 50 2
Khả năng tương tác giữa các mẫu thử được đánh giá dựa trên hai mô hình cơ bản: mô hình tác động đồng thời lên cùng vị trí và mô hình tác động lên hai vị trí riêng biệt Để đánh giá khả năng tương tác giữa các cao chiết, hệ số MDR được sử dụng.
- MDR > 2: các cao chiết thể hiện tính hiệp đồng
- 0.5 < MDR < 2: các cao chiết cộng tính với nhau
- MDR < 0.5: các cao chiết thể hiện tính đối kháng
3.3.1 Khả năng tương tác giữa ớt và hạt mãng cầu xiêm
Sự kết hợp giữa hai chiết xuất ớt (chiết xuất 1) và hạt mãng cầu xiêm (chiết xuất
2) ở các giá trị nồng độ quanh giá trị LC50 của từng cấu tử cho kết quả tương tác tốt và được thể hiện qua Hình 3.7
Hình 3.7: Tỉ lệ tử vong trung bình của hỗn hợp ớt : hạt mãng cầu (hmc) ở các tỉ lệ khảo sát
Theo Hình 3.7, tỉ lệ tử vong trung bình của các mẫu thử ở năm mức nồng độ khảo sát cho thấy hầu hết các cá thể đều chết Đặc biệt, hai giá trị nồng độ 1 và 50 1 : 50 2 đã ghi nhận kết quả tử vong cao.
Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ tử vong khi sử dụng 2 LC LC và ngược lại đạt trên 95%, chỉ ra sự tương tác mạnh mẽ giữa hai chiết xuất Qua hai mô hình đánh giá, khi nồng độ LC50 của từng chiết xuất tăng gấp đôi, hoạt tính của hỗn hợp gần đạt giá trị kỳ vọng Điều này phù hợp với thực tế đã được S.Josi và J.C Nieh đề cập Khi nồng độ cấu tử vượt quá LC50, hoạt tính của hỗn hợp bị chi phối chủ yếu bởi cấu tử đó, dẫn đến sự giảm khả năng tương tác giữa hai thành phần.
LC 2 LC , LC LC 50 1 : 50 2 đều thể hiện được tính hiệp đồng theo mô hình 1, và khi nồng độ LC50 của từng cấu tử giảm đi một nửa thì tính hiệp đồng giữa hai cấu tử thể hiện rõ ràng hơn, trong đó cặp chiết xuất ở tỉ lệ 50 1 : 1 50 2
LC 2 LC cho kết quả tương tác rất mạnh với giá trị MDR lên đến 6.31 Sự tương tác thể hiện rõ rệt khi nồng độ của từng chiết xuất giảm xuống vì khi đó hoạt tính của một trong hai chiết cao chiết sẽ bị giảm hoặc mất đi, qua đó làm nổi bật sự tương tác giữa 2 chiết xuất Tuy nhiên, từ Hình 3.9, khả năng tương tác của 2 cấu tử nếu xét theo mô hình 2 lại chỉ thể hiện được sự cộng tính hay gần như là hoạt tính gần bằng giá trị kỳ vọng ở các tỉ lệ
Hình 3.8: Tương tác giữa chiết xuất ớt và hạt mãng cầu xiêm lên hoạt tính hỗn hợp theo mô hình 1
Hình 3.9: Tương tác giữa chiết xuất của ớt và hạt mãng cầu xiêm lên hoạt tính hỗn hợp theo mô hình 2
3.3.2 Khả năng tương tác giữa ớt và bồ hòn
Cuộc khảo sát tiếp theo tập trung vào sự tương tác giữa chiết xuất ớt (chiết xuất 1) và bồ hòn (chiết xuất 2) Kết quả cho thấy sự kết hợp này mang lại hiệu quả tích cực, được thể hiện qua tỷ lệ tử vong trung bình như minh họa trong Hình 3.10.
Hình 3.10: Tỉ lệ tử vong trung bình của hỗn hợp ớt : bồ hòn (bh) ở các tỉ lệ khảo sát
Tỉ lệ tử vong trung bình của các chiết xuất ở các cặp tỉ lệ đều cho thấy phần trăm tử vong đạt trên 95%, cho thấy sự tương tác tích cực giữa hai chiết xuất Kết quả này được thể hiện qua hai mô hình cơ bản trong Hình 3.11 và Hình 3.12.
Hình 3.11: Tương tác giữa chiết xuất ớt và bồ hòn lên hoạt tính hỗn hợp theo mô hình
Hình 3.12: Tương tác giữa chiết xuất ớt và bồ hòn lên hoạt tính hỗn hợp theo mô hình
Hỗn hợp chiết xuất ớt và hạt mãng cầu xiêm cho thấy khả năng tương tác mạnh mẽ và tính hiệp đồng rõ rệt ở ba tỉ lệ đầu Tuy nhiên, đối với hai cặp tỉ lệ 2LC LC 50 1:50 2, kết quả có sự khác biệt đáng chú ý.
LC LC , chiết xuất ớt và bồ hòn cũng thể hiện khả năng tương tác mạnh với giá trị
MDR được ghi nhận lần lượt là 1.73 và 1.96 Kết quả từ mô hình 2 cho thấy sự tương đồng rõ rệt với mô hình của cặp chiết xuất ớt và hạt mãng cầu xiêm khi hỗn hợp được pha trộn theo tỷ lệ 1:50 và 2:50.
LC 2 LC cho khả năng tương tác tốt nhất với giá trị MDR lần lượt là 1.70 và 1.61
3.3.3 Khả năng tương tác giữa bồ hòn và hạt mãng cầu xiêm
Cặp chiết xuất cuối cùng được nghiên cứu là sự kết hợp giữa bồ hòn (chiết xuất 1) và hạt mãng cầu xiêm (chiết xuất 2) Kết quả cho thấy tỷ lệ tử vong trung bình ở các tỷ lệ khảo sát của hỗn hợp chiết xuất này được trình bày trong Hình 3.13.
Hình 3.13: Tỉ lệ tử vong trung bình của hỗn hợp bồ hòn (bh) : hạt mãng cầu (hmc) ở các tỉ lệ khảo sát
Theo Hình 3.13, giá trị tử vong trung bình của hỗn hợp rất thấp, với tỷ lệ tử vong trung bình khoảng 50% ở tỷ lệ LC 50 1:50 2 Trong khi đó, các tỷ lệ còn lại có giá trị tử vong nằm trong khoảng 20-25%.
Tỉ lệ tử vong trung bình của LC gần như bằng 0, cho thấy sự tương tác giữa bồ hòn và hạt mãng cầu xiêm là khá yếu Đánh giá sự tương tác giữa hai chiết xuất trong hỗn hợp được thể hiện rõ ràng.
Hình 3.14: Tương tác giữa chiết xuất bồ hòn và hạt mãng cầu xiêm lên hoạt tính hỗn hợp theo mô hình 1
Hình 3.15: Tương tác giữa chiết xuất bồ hòn và hạt mãng cầu xiêm lên hoạt tính hỗn hợp theo mô hình 2
Ngoại trừ hỗn hợp với tỷ lệ LC LC 50 1:50 2 không cho thấy tính đối kháng với giá trị MDR trong mô hình 1 và 2 (lần lượt là 0.5 và 0.6, lớn hơn 0.5), các tỷ lệ khác của hai chiết xuất này đều cho thấy tính đối kháng mạnh khi kết hợp với nhau.
3.3.4 Khả năng kháng ăn của cặp ớt:hạt mãng cầu và cặp ớt:bồ hòn
Sau khi khảo sát khả năng tương tác của các cặp chiết xuất, chúng tôi nhận thấy hai cặp tương tác ớt là hạt mãng cầu và ớt bồ hòn có khả năng tương tác mạnh mẽ Sự tương tác này thể hiện rõ nhất ở hai nồng độ 1:50 và 1:50:2.
LC 2 LC Chính vì vậy, khả năng kháng ăn của chúng sẽ được khảo sát ở hai nồng độ trên
Khả năng tương tác giữa cao chiết ớt, hạt mãng cầu xiêm với azadirachtin
Khi kết hợp cao chiết ớt và cao chiết hạt mãng cầu, hỗn hợp này thể hiện độc tính tiếp xúc mạnh với tỷ lệ tử vong trên 95%, nhưng khả năng gây ngán ăn lại kém Để tăng hiệu quả sử dụng, cần bổ sung thêm hoạt chất có khả năng gây ngán ăn Azadirachtin, một hoạt chất được biết đến với khả năng gây ngán ăn mạnh đối với côn trùng, đã được thêm vào hỗn hợp để kiểm tra khả năng tương tác và cải thiện hiệu quả kháng ăn của hỗn hợp này.
Kết quả đánh giá khả năng tương tác của azadirachtin với hỗn hợp cao chiết được thể hiện qua Bảng 3.2
Bảng 3.2: Tỷ lệ tử vong của hỗn hợp đối với loài Alphitobius diaperinus ở các tỉ lệ khác nhau
Tỉ lệ kết hợp Tỉ lệ tử vong (%)
Mẫu chứng (1/2LC50-ớt:LC50-hmc) 98.3 2.9 Mẫu 1 (1/2LC50-ớt:LC50-hmc:10 mg/mL Aza 30%) 98.8 2.5
Mẫu 2 (LC50-ớt:1/2LC50-hmc:10 mg/mL Aza 30%) 100 030
Mẫu 3 (LC50-ớt:LC50-hmc:10 mg/mL Aza 30%) 100 0.0
Mẫu 4 (2LC50-ớt:LC50-hmc:10 mg/mL Aza 30%) 100 0.0
Mẫu 5 (LC50-ớt:2LC50-hmc:10 mg/mL Aza 30%) 97.5 2.9
Việc bổ sung azadirachtin vào hỗn hợp không ảnh hưởng đến tỉ lệ tử vong, vẫn duy trì trên 95%, tương tự như kết quả ở mục 3.3.1 về khả năng tương tác của cao chiết ớt và cao chiết hạt mãng cầu xiêm Tuy nhiên, azadirachtin đã làm thay đổi đáng kể khả năng kháng ăn của hỗn hợp, như thể hiện qua Hình 3.17.
Hình 3.17 trình bày khả năng kháng ăn của các hỗn hợp sau 24 giờ Các mẫu lá được thử nghiệm bao gồm: a) mẫu lá nhúng nước cất, b) mẫu lá nhúng hỗn hợp 1/2LC 50-ớt :LC 50-hmc :10 mg/mL Aza 30%, c) mẫu lá nhúng hỗn hợp LC 50-ớt :1/2LC 50-hmc :10 mg/mL Aza 30%, d) mẫu lá nhúng hỗn hợp LC 50-ớt :LC 50-hmc :10 mg/mL Aza 30%, e) mẫu lá nhúng hỗn hợp 2LC 50-ớt :LC 50-hmc :10 mg/mL Aza 30%, và f) mẫu lá nhúng hỗn hợp LC 50-ớt :2LC 50-hmc :10 mg/mL Aza 30%.
Kết quả từ Hình 3.17 cho thấy hỗn hợp có khả năng kháng ăn tốt với nồng độ azadirachtin 10 mg/mL, khi mẫu lá vẫn còn nguyên vẹn và chỉ co lại do mất nước sau 24 giờ thử nghiệm Bảng 3.3 và Hình 3.18 chỉ ra rằng azadirachtin gây ngán ăn mạnh nhất ở nồng độ 0.125 mg/mL; ở nồng độ thấp hơn (0.1 - 0.01 mg/mL), khả năng này chỉ đạt mức trung bình Việc giảm nồng độ azadirachtin không làm thay đổi đáng kể độc tính tiếp xúc của hỗn hợp, với tỉ lệ tử vong ở nồng độ thấp chỉ chênh lệch 10% so với nồng độ cao Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Nisbet và cộng sự cũng như Isman và cộng sự.
Bảng 3.3: Tỉ lệ tử vong của hỗn hợp đối với loài Alphitobius diaperinus ở các nồng độ
Tỉ lệ kết hợp Tỉ lệ tử vong (%)
Mẫu chứng (LC50-ớt:1/2LC50-hmc) 96.6 5.8 Mẫu 1 (LC50-ớt:1/2LC50-hmc:10 mg/mL Aza 30%) 100 0.0
Mẫu 2 (LC50-ớt:1/2LC50-hmc:5 mg/mL Aza 30%) 100 0.0
Mẫu 3 (LC50-ớt:1/2LC50-hmc:2.5 mg/mL Aza 30%) 97.5 2.9
Mẫu 4 (LC50-ớt:1/2LC50-hmc:1 mg/mL Aza 30%) 96.3 4.8
Mẫu 5 (LC50-ớt:1/2LC50-hmc:0.5 mg/mL Aza 30%) 97.5 2.9
Mẫu 6 (LC50-ớt:1/2LC50-hmc:0.25 mg/mL Aza 30%) 87.5 6.5
Mẫu 7 (LC50-ớt:1/2LC50-hmc:0.125 mg/mL Aza 30%) 86.3 6.3
Mẫu 8 (LC50-ớt:1/2LC50-hmc:0.1 mg/mL Aza 30%) 86.3 6.3
Mẫu 9 (LC50-ớt:1/2LC50-hmc:0.05 mg/mL Aza 30%) 86.3 9.5
Mẫu 10 (LC50-ớt:1/2LC50-hmc:0025 mg/mL Aza 30%) 87.5 9.6
Mẫu 11 (LC50-ớt:1/2LC50-hmc:0.01 mg/mL Aza 30%) 86.3 9.5 a) b) c) d) e) f) g) h) i) k) l) m)
Hình 3.18 trình bày hiệu quả kháng ăn của các mẫu lá sau 24 giờ khi được ngâm trong các nồng độ khác nhau của azadirachtin Các mẫu lá được chia thành nhiều nhóm, bao gồm: a) mẫu lá ngâm trong nước cất, b) mẫu lá ngâm hỗn hợp 1/2LC 50-ớt :LC 50-hmc với nồng độ 10 mg/mL Aza 30%, c) 5 mg/mL Aza 30%, d) 2.5 mg/mL Aza 30%, e) 1 mg/mL Aza 30%, f) 0.5 mg/mL Aza 30%, g) 0.25 mg/mL Aza 30%, h) 0.125 mg/mL Aza 30%, i) 0.1 mg/mL Aza 30%, k) 0.05 mg/mL Aza 30%, l) 0.025 mg/mL Aza 30%, và m) 0.01 mg/mL Aza 30%.
Xây dựng công thức chế phẩm từ các cao chiết
Việc sử dụng thuốc trừ sâu là phương pháp chính trong kiểm soát dịch bệnh và côn trùng hại cây trồng Các sản phẩm này không chỉ chứa hoạt chất chính mà còn có chất hoạt động bề mặt giúp hòa tan, ổn định và tăng cường hoạt tính sinh học Chất hoạt động bề mặt cải thiện khả năng bám dính trên côn trùng, phủ lá cây và giảm rửa trôi thuốc Trong nghiên cứu này, polysorbate 80 và propylene glycol được dùng để hòa tan cao chiết, cùng với ethoxylate alcohol để tăng độ bám dính và khả năng thấm ướt Nghiên cứu cho thấy dầu neem và tinh dầu sả có khả năng ức chế sự sinh trưởng của một số loài côn trùng và có tác dụng xua đuổi chúng Do đó, dầu neem và tinh dầu sả Java được chọn để bổ sung vào công thức nhằm tăng cường hoạt tính sản phẩm.
Công thức chế phẩm được thiết kế với tỷ lệ cố định của các chất hoạt động bề mặt, tinh dầu và dầu neem, đảm bảo duy trì tính hiệu quả như trong công thức ban đầu.
Nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cao chiết đến hoạt tính sản phẩm thông qua thử nghiệm tỷ lệ tử vọng và khả năng kháng ăn trên sâu Alphitobius diaperinus Kết quả cho thấy nồng độ thích hợp đã được lựa chọn để xây dựng công thức chế phẩm hiệu quả.
3.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ Aza 30% đến hoạt tính của chế phẩm Ảnh hưởng của nồng độ Aza 30% đến độc tính tiếp xúc của chế phẩm sau khi pha loãng 300 - 500 lần (mức độ pha loãng thường sử dụng đối với các sản phẩn trên thị trường) được trình bày qua Bảng 3.5
Bảng 3.5: Tỉ lệ tử vong của chế phẩm đối với loài Alphitobius diaperinus ở các nồng độ Aza 30% khác nhau
Nồng độ pha loãng (mL chế phẩm/mL nước) Tỉ lệ tử vong (%)
Mẫu 1 (1% bột Aza 30%) 28.3 2.9 13.3 2.9 1.7 2.9 Mẫu 2 (2% bột Aza 30%) 41.7 2.9 20.0 0.0 13.3 2.9 Mẫu 3 (4% bột Aza 30%) 50.0 0.0 33.3 7.6 20.0 5.0 Mẫu 4 (6% bột Aza 30%) 61.7 2.9 48.3 2.9 36.7 5.8 Mẫu 5 (8% bột Aza 30%) 75.0 0.0 56.7 2.9 48.3 2.9 Mẫu 6 (10% bột Aza 30%) 83.3 2.9 68.3 2.9 60.0 0.0
Kết quả từ Bảng 3.5 cho thấy rằng khi nồng độ azadirachtin trong mẫu thử tăng lên, tỷ lệ tử vong của ấu trùng cũng tăng theo Cụ thể, tỷ lệ tử vong đạt 28.3% ở mẫu chứa 1% Aza 30% và tăng lên 83.3% ở mẫu chứa 10% Aza 30% tại nồng độ pha loãng 1/300 (mL chế phẩm/mL nước) Ngoài ra, tỷ lệ tử vong cũng có xu hướng tăng dần ở các nồng độ pha loãng 400 lần và 500 lần tương ứng.
Hệ nhũ tương chứa azadirachtin cho thấy hoạt tính độc tính vượt trội so với azadirachtin dạng tự do, đặc biệt ở nồng độ 40 mg/mL Aza 30% vẫn chưa thể hiện độc tính Điều này cho thấy hệ nhũ tương cải thiện khả năng thẩm thấu qua lớp biểu bì của côn trùng, từ đó tăng cường độc tính sản phẩm Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của MadMound và cộng sự về độc tính của chế phẩm NeemAza T 5% và Neemix 4.5% đối với ấu trùng Bactrocera zonata, với tỷ lệ tử vong tương ứng là 12 - 92% và 28 - 88% khi pha loãng từ 50 - 200 lần.
Một nghiên cứu của Choupanian và cộng sự đã chỉ ra rằng việc sử dụng hệ nhũ tương nano có thể cải thiện hiệu quả của azadirachtin trong việc chống lại hai loài sâu hại Sitophilus oryzae (L.) và Tribolium castaneum (Herbst) Chế phẩm này cũng cho thấy khả năng kháng ăn đáng kể.
Hình 3.19: Khả năng kháng ăn của chế phẩm ở các nồng độ Aza 30% khác nhau
Mẫu 1 - mẫu thử chứa 1% Aza 30% Mẫu 4 - mẫu thử chứa 6% Aza 30% Mẫu 2 - mẫu thử chứa 2% Aza 30% Mẫu 5 - mẫu thử chứa 8% Aza 30% Mẫu 3 - mẫu thử chứa 4% Aza 30% Mẫu 6 - mẫu thử chứa 10% Aza 30% 1/300, 1/400, 1/500 lần lượt là nồng độ pha loãng (mL chế phẩm/mL nước) 300,
Chế phẩm cho thấy khả năng kháng ăn tốt ở nồng độ 6%, 8% và 10% (w/w) Aza 30% khi pha loãng từ 300 đến 500 lần, tương tự như kết quả ở mục 3.4 với nồng độ Aza 30% sau khi pha loãng trong khoảng 0.05 - 0.5 mg/mL Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu trước đó.
Su và cộng sự đã tiến hành khảo sát khả năng kháng ăn của các chế phẩm chứa Azadirachtin, bao gồm Azad EC 4.5, Azatin WP 4.5 và Neemix EC 4.5, trên hai loài muỗi Culex tarsalis và Culex quinquefasciatus.
3.5.2 Ảnh hưởng của nồng độ cao chiết ớt đến hoạt tính của chế phẩm
Kết quả ảnh hưởng của nồng độ cao chiết ớt đến độc tính tiếp xúc của chế phẩm được trình bày qua Bảng 3.6
Bảng 3.6: Tỉ lệ tử vong của chế phẩm đối với loài Alphitobius diaperinus ở các nồng độ cao chiết ớt khác nhau
Nồng độ pha loãng (mL chế phẩm/mL nước) Tỉ lệ tử vong (%)
Nồng độ cao chiết ớt trong chế phẩm
Mẫu 1 (1% cao chiết) 27.5 2.7 23.3 3.6 16.7 4.1 Mẫu 2 (2% cao chiết) 40.0 3.2 29.2 2.0 20.0 4.5 Mẫu 3 (4% cao chiết) 52.5 2.7 36.7 2.6 26.7 2.6 Mẫu 4 (6% cao chiết) 60.0 3.2 41.7 4.1 31.7 2.6 Mẫu 5 (8% cao chiết) 65.8 3.8 51.7 4.1 41.7 4.1 Mẫu 6 (10% cao chiết) 75.0 3.2 57.5 6.9 47.5 2.7
Hình 3.20: Khả năng kháng ăn của chế phẩm đối với loài Alphitobius diaperinus ở các nồng độ cao chiết ớt khác nhau Chú thích:
Mẫu 1 - mẫu thử chứa 1% cao chiết Mẫu 4 - mẫu thử chứa 6% cao chi ết Mẫu 2 - mẫu thử chứa 2% cao chiết Mẫu 5 - mẫu thử chứa 8% cao chiết Mẫu 3 - mẫu thử chứa 4% cao chiết Mẫu 6 - mẫu thử chứa 10% cao chiết 1/300, 1/400, 1/500 lần lượt là nồng độ pha loãng (mL chế phẩm/mL nước) 300,
Kết quả từ Bảng 3.6 cho thấy rằng khi nồng độ cao chiết ớt trong mẫu thử tăng từ 1 - 10%, tỷ lệ tử vong của ấu trùng tăng dần ở các nồng độ pha loãng 300, 400 và 500 lần Trong hệ nhũ tương, nồng độ cần thiết của cao chiết ớt để gây tử vong 50% ấu trùng chỉ khoảng 0.2 - 0.25 mg/mL, thấp hơn 50 lần so với cao chiết thô Việc sử dụng cao chiết dưới dạng chế phẩm giúp vận chuyển hoạt chất hiệu quả hơn đến các mục tiêu trong cơ thể côn trùng, từ đó tăng cường hoạt tính sinh học của sản phẩm Tuy nhiên, khả năng kháng ăn của các mẫu chế phẩm chứa cao chiết ớt lại thể hiện kết quả kém, tương tự như ở mục 3.2.2, khi mà mẫu cao chiết ớt không gây ra sự ngừng ăn ở côn trùng.
3.5.3 Ảnh hưởng của nồng độ cao chiết hạt mãng cầu đến hoạt tính của chế phẩm Ảnh hưởng của nồng độ cao chiết hạt mãng cầu đến độc tính tiếp xúc của chế phẩm được thể hiện qua Bảng 3.7
Bảng 3.7: Tỉ lệ tử vong của chế phẩm đối với loài Alphitobius diaperinus ở các nồng độ cao chiết hạt mãng cầu khác nhau
Nồng độ pha loãng (mL chế phẩm/mL nước) Tỉ lệ tử vong (%)
Nồng độ cao chiết hạt mãng cầu trong chế phẩm
Mẫu 1 (1% cao chiết) 36.7 5.2 26.7 2.6 24.2 3.8 Mẫu 2 (2% cao chiết) 48.3 2.6 35.8 2.0 31.7 4.1 Mẫu 3 (4% cao chiết) 57.5 6.1 46.7 5.2 36.7 4.1 Mẫu 4 (6% cao chiết) 65.0 6.3 53.3 5.2 45.0 6.3 Mẫu 5 (8% cao chiết) 71.7 4.1 63.3 4.1 48.3 4.1 Mẫu 6 (10% cao chiết) 88.3 9.3 71.7 4.1 53.3 2.6
Hình 3.21: Khả năng kháng ăn của chế phẩm đối với loài Alphitobius diaperinus ở các nồng độ cao chiết hạt mãng cầu khác nhau Chú thích:
Mẫu 1 - mẫu thử chứa 1% cao chiết Mẫu 4 - mẫu thử chứa 6% cao chiết
Mẫu 2 - mẫu thử chứa 2% cao chiết Mẫu 5 - mẫu thử chứa 8% cao chiết
Mẫu 3 - mẫu thử chứa 4% cao chiết Mẫu 6 - mẫu thử chứa 10% cao chiết
1/300, 1/400, 1/500 lần lượt là nồng độ pha loãng (mL chế phẩm/mL nước) 300,
Kết quả từ Bảng 3.7 chỉ ra rằng khi nồng độ cao chiết hạt mãng cầu tăng từ 1% lên 10%, tỷ lệ tử vong của loài A.diaperinus cũng tăng theo ở các nồng độ pha loãng 1/300, 1/400 và 1/500 Điều này tương tự với ảnh hưởng của nồng độ azadirachtin và cao chiết ớt, khi sử dụng ở nồng độ thấp có mức độ tử vong cao hơn so với dạng cao chiết thô Hơn nữa, khả năng kháng ăn của chế phẩm chứa cao chiết hạt mãng cầu tương đối kém, tương tự như mẫu chứa cao chiết ớt, phù hợp với các nghiên cứu trước đó về khả năng kháng ăn của hai loại cao chiết này.
Việc lựa chọn nồng độ cao cho các chiết xuất để phối trộn cần đảm bảo rằng hỗn hợp, sau khi pha loãng với nước 300-500 lần, vẫn duy trì khả năng kháng ăn và hiệu quả tương đương với các hoạt chất khi sử dụng độc lập Công thức chế phẩm được trình bày trong Bảng 3.8.
Bảng 3.8: Thành phần các chất trong chế phẩm NP
Cao chiết hạt mãng cầu 6 Polysorbate 80 (tween 80) 32 Propylene glycol (PG) 8 Ethoxylate alcohol 10 Tinh dầu sả Java 16
Hiệu quả trừ sâu của chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học
Chế phẩm từ công thức đã được phát triển có màu đỏ sẫm, trong suốt và đồng nhất Hoạt tính sinh học của chế phẩm này đã được đánh giá qua các thử nghiệm trong phòng thí nghiệm, bán thực địa và thực địa.
3.6.1 Hiệu quả trừ sâu đối với ấu trùng Alphitobius diaperinus Độ hiệu quả của chế phẩm được thể hiện qua Hình 3.23 và Hình 3.24 Kết quả từ Hình 3.23 cho thấy rằng, chế phẩm NP đáp ứng liều lượng tốt hơn với mức độ tử vong đạt 100% ở cả ba tỉ lệ pha loãng (1/300, 1/400 và 1/500) khi so sánh với đáp ứng liều lượng của từng cao chiết đơn lẻ Bên cạnh đó, Hình 3.24 cũng thể hiện rằng khi các cao chiết được sử dụng kết hợp với nhau thì mức độ tử vong tăng lên đáng kể ở cả ba nồng độ pha loãng Khi pha loãng sản phẩm 500 lần, hoạt tính sản phẩm có sự thay đổi rõ rệt so với ban đầu (với tỉ lệ gây tử vong của hỗn hợp là 100%, trong khi, các mẫu thử khác chỉ đạt khoảng 30 - 40%) Kết quả này tương tự với kết quả khảo sát tương tác của hỗn hợp cao chiết ớt và hạt mãng cầu Đồng thời, khả năng kháng ăn của hỗn hợp vẫn được duy trì ở mức độ tốt khi so sánh với mẫu chứa 6% Aza 30% ở tỉ lệ pha loãng 500 lần (Hình 3.25) a) Đường cong đáp ứng của chế phẩm NP so với Aza 30% b) Đường cong đáp ứng của chế phẩm
NP so với cao chiết ớt c) Đường cong đáp ứng của chế phẩm NP so với cao chiết hạt mãng cầu
Hình 3.23: Đường đáp ứng liều lượng của các mẫu thử Chú thích:
Hình 3.24: Đồ thị so sánh hiệu quả của các mẫu thử
Nồng độ pha loãng (mL chế phẩm/mL nước)
Chế phẩm NP Mẫu chứa 6% azadirachtin Mẫu chứa 6% cao chiết ớt
Mẫu chứa 6% cao chiết hạt mãng cầu xiêm
Mẫu 1 - mẫu chứa 1% hoạt chất Mẫu 4 - mẫu chứa 6% hoạt chất
Mẫu 2 - mẫu chứa 2% hoạt chất Mẫu 5 - mẫu chứa 8% hoạt chất
Mẫu 3 - mẫu chứa 4% hoạt chất Mẫu 6 - mẫu chứa 10% hoạt chất a) b) c) d)
Hình 3.25 trình bày khả năng kháng ăn của các mẫu thử ở nồng độ pha loãng 1/500 Cụ thể, mẫu lá được nhúng trong dung dịch chế phẩm NP, mẫu lá nhúng dung dịch chứa 6% Aza 30%, mẫu lá nhúng dung dịch chứa 6% cao chiết ớt, và mẫu lá nhúng dung dịch chứa 6% cao chiết hạt mãng cầu xiêm.
Sản phẩm được bảo quản trong 28 ngày ở các nhiệt độ khác nhau như nhiệt độ phòng, 45 °C và 0 °C đã được đánh giá lại hiệu quả qua thử nghiệm độc tiếp xúc Kết quả cho thấy hoạt tính của chế phẩm hầu như không thay đổi, với tỷ lệ tử vong khoảng 98 - 100%, chứng tỏ sản phẩm có độ ổn định và độ bền nhiệt tốt, đặc biệt khi bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Nồng độ pha loãng (mL chế phẩm/mL nước) t=0 t ngày t( ngày b) Chế phẩm bảo quản ở nhiệt độ 45 2 °C c) Chế phẩm bảo quản ở nhiệt độ 0 2 °C
Hình 3.26: Hiệu quả của chế phẩm khi bảo quản ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau
3.6.2 Hiệu quả trừ sâu trong điều kiện bán thực địa và thực địa
Mặc dù chế phẩm NP cho thấy hiệu quả tốt đối với ấu trùng A diaperinus, nhưng khi áp dụng trên các loại sâu trong thực tế, hiệu quả có thể không đạt như mong đợi do tác động của môi trường và khả năng sinh trưởng mạnh mẽ của sâu trong tự nhiên Để đánh giá chính xác hơn khả năng diệt côn trùng của sản phẩm, nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm trên sâu đầu đen, loài sâu gây hại cho cây dừa.
Trong những năm qua, Bến Tre đã đối mặt với tình trạng sâu đầu đen (Opisina arenosella) xâm hại nghiêm trọng trên diện rộng tại các khu vực trồng dừa Loài sâu này là ấu trùng của một loại bướm đêm, phổ biến ở nhiều khu vực thuộc Đông Nam Á.
Nồng độ pha loãng (mL chế phẩm/mL nước) t=0 t ngày t( ngày
Tỉ lệ tử vo ng (%)
Nồng độ pha loãng (mL chế phẩm/mL nước) t=0 t ngày t( ngày
Sâu hại cây bằng cách phá hủy biểu bì lá dưới, tạo tơ bao quanh cơ thể và kết dính phân cùng mảnh vụn, tạo thành nơi trú ẩn giống như đường hầm Chúng tấn công từ dưới lên trên, làm cho lá khô héo và sau đó tấn công vỏ trái, dẫn đến cái chết của cây.
Hiện nay, người dân chủ yếu sử dụng thuốc Atimax 50WG và Reasgant 3.6EC để diệt trừ sâu đầu đen Tuy nhiên, thành phần abamectin trong các loại thuốc này được đánh giá là hợp chất độc hại thuộc nhóm II theo tiêu chuẩn của WHO, với độc tính cấp đường uống LD50 = 11 mg/Kg Việc sử dụng thuốc này có thể ảnh hưởng tiêu cực đến sự sinh trưởng của cây, dẫn đến tình trạng lá cây bị xơ xác.
Hình 3.27: Sâu đầu đen (Opisina arenosella)
Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã tiến hành đánh giá sơ bộ hiệu quả của chế phẩm thông qua thử nghiệm độc tính tiếp xúc và khả năng kháng ăn Để so sánh, thuốc trừ sâu Reasgant 3.6EC, chứa hoạt chất abamectin với nồng độ 36 g/L, được sử dụng làm mẫu đối chứng dương.
Bảng 3.9: Tỉ lệ tử vong của chế phẩm NP và Reasgant 3.6EC đối với sâu đầu đen
Nồng độ pha loãng (mL chế phẩm/mL nước)
Chế phẩm NP 100 0.0 100 0.0 100 0.0 Reasgant 3.6EC 100 0.0 100 0.0 100 0.0
Kết quả từ Bảng 3.9 cho thấy chế phẩm khảo sát có hoạt tính độc tiếp xúc tốt hơn so với thuốc trên thị trường Hiệu quả kháng ăn của sản phẩm cũng duy trì ở mức cao, với mẫu lá vẫn nguyên vẹn sau 24 giờ ở nồng độ 1/300 Ngược lại, mẫu đối chứng với nồng độ pha loãng 2000 - 2500 lần vẫn ghi nhận sâu tử vong do độc tiếp xúc Ngoài ra, khả năng kháng ăn ở các nồng độ 1/400 và 1/500 cũng cho thấy hoạt tính tương đối tốt, phù hợp với kết quả khảo sát trên loài Alphitobius diaperinus.
Hình 3.28 minh họa hiệu quả kháng ăn của chế phẩm NP và thuốc Reasgant 3.6EC Các mẫu lá được thử nghiệm bao gồm: a) lá nhúng nước cất, b) lá nhúng dung dịch Reasgant 3.6EC pha loãng ở nồng độ 1/300, c) lá nhúng dung dịch Reasgant 3.6EC pha loãng ở nồng độ 1/400, d) lá nhúng dung dịch Reasgant 3.6EC pha loãng ở nồng độ 1/500, e) lá nhúng dung dịch chế phẩm NP pha loãng ở nồng độ 1/300, f) lá nhúng dung dịch chế phẩm NP pha loãng ở nồng độ 1/400, và g) lá nhúng dung dịch chế phẩm NP pha loãng ở nồng độ 1/500.
Khi so sánh hiệu quả của chế phẩm NP với chế phẩm chứa azadirachtin 2%, kết quả cho thấy chế phẩm NP đã cải thiện rõ rệt sau khi kết hợp với hỗn hợp chiết xuất ớt và hạt mãng cầu Cụ thể, ở nồng độ 1/500, chế phẩm NP đạt tỷ lệ gây tử vong 100%, trong khi chế phẩm azadirachtin 2% chỉ đạt khoảng 67%.
Bảng 3.10: Tỉ lệ tử vong của chế phẩm chứa azadirachtin 2% đối với sâu đầu đen
Nồng độ pha loãng (mL chế phẩm/mL nước)
Chế phẩm chứa azadirachtin 2% 100 0.0 93.3 11.5 66.7 10.4 b) Hiệu quả của chế phẩm trong điều kiện bán thực địa và thực địa
Thí nghiệm bán thực địa được thực hiện trên 10 lá dừa có kích thước 20 cm, chứa sâu trong tổ Độ hiệu quả của chế phẩm được tính toán theo phương pháp nêu trong mục 2.4.1 và kết quả được trình bày ở Bảng 3.11.
Bảng 3.11: Hiệu lực phòng trừ sâu đầu đen trong điều kiện bán thực địa
TT Số sâu/10 lá dừa Mẫu thử Hiệu quả trừ sâu
Hiệu quả trừ sâu trung bình (%)
TT Số sâu/10 lá dừa Mẫu thử Hiệu quả trừ sâu
Hiệu quả trừ sâu trung bình (%)
Kết quả thử nghiệm trên đĩa petri cho thấy chế phẩm có khả năng trừ sâu hiệu quả, nhưng khi thử nghiệm trong điều kiện thực tế, hiệu quả chỉ đạt mức trung bình đối với chế phẩm NP và Reasgane 3.6EC, và kém đối với chế phẩm azadirachtin 2% Nguyên nhân là do sâu nằm trong tổ được hình thành từ các sản phẩm bài tiết của sâu đầu đen, làm cho tổ này hấp phụ các hoạt chất trong chế phẩm Do đó, khi phun thuốc lên lá, các chất này bị giữ lại bên ngoài tổ, khiến cho các hoạt chất không thẩm thấu qua, dẫn đến giảm hiệu quả của chế phẩm.
Bảng 3.12: Hiệu lực phòng trừ sâu ở điều kiện thực địa ngoài vườn rau
Mẫu thử Hiệu quả trừ sâu (%)
Sau 1 ngày Sau 3 ngày Sau 5 ngày Sau 7 ngày
Chế phẩm NP 19.8 5.4 59.1 10.1 84.4 3.9 87.7 2.2 Reasgant 3.6EC 26.1 6.7 71.5 5.7 94.4 9.6 94.4 9.6
Trong thử nghiệm khả năng trừ sâu của chế phẩm trên sâu xanh hại rau (Diaphania indica), với thể tích phun 500 mL/m², các mẫu thử nghiệm được phun một lần vào ngày đầu tiên và hiệu quả được quan sát sau 7 ngày Kết quả cho thấy chế phẩm ở nồng độ pha loãng 1/500 có thể tiêu diệt trên 85% tổng số sâu, tương đương với khả năng trừ sâu của thuốc Reasgant 3.6EC, đạt trên 90% hiệu quả sau 7 ngày khi phun với nồng độ 1/2000 Hơn nữa, rau phục hồi tốt và phát triển bình thường sau khi phun Điều này cho thấy chế phẩm có tiềm năng ứng dụng thực tế và có thể thay thế các sản phẩm trừ sâu gây ảnh hưởng đến con người và môi trường.
