Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật xử lý nước thải nhiễm mặn

ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH TIỀN GIANG TRƯỜNG ĐHCN TP HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN KHCNQLMT ĐỀ TÀI CẤP TỈNH BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CÔNG NGHỆ PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT XỬ LÝ NƯỚC THẢI NHIỄM MẶN Mã số ĐTCN 022018 Chủ nhiệm đề tài PGS TS LÊ HÙNG ANH Tiền Giang, tháng 10 năm 2020 i MỤC LỤC Danh mục kí hiệu, chữ viết tắt iv Danh mục các bảng v Danh mục các hình vii MỞ ĐẦU 1 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1 1 Tổng quan về nước thải nhiễm mặn và phương pháp xử lý 4.

ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH TIỀN GIANG TRƯỜNG ĐHCN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN KHCN&QLMT ĐỀ TÀI CẤP TỈNH BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CÔNG NGHỆ PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT XỬ LÝ NƯỚC THẢI NHIỄM MẶN Mã số: ĐTCN 02/2018 Chủ nhiệm đề tài: PGS TS LÊ HÙNG ANH Tiền Giang, tháng 10 năm 2020 MỤC LỤC Danh mục kí hiệu, chữ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình vii MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan nước thải nhiễm mặn phương pháp xử lý 1.1.1 Nước thải nhiễm mặn nguồn phát sinh 1.1.2 Tổng quan xử lý nước thải nhiễm mặn 1.2 Tổng quan thực trạng nước thải nhiễm mặn tỉnh Tiền Giang 1.3 Tổng quan đăc tính sinh học vi sinh vật chịu mặn 14 1.4 Thực trạng ứng dụng vi sinh vật chịu mặn xử lý nước thải nhiễm mặn ở nước giới 15 1.5 Thực trạng ứng dụng vi sinh vật chịu mặn xử lý nước thải nhiễm mặn ở Việt Nam 20 Chương CỨU 2.1 NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN 24 Nội dung 1: Nghiên cứu tổng quan 25 2.1.1 Nội dung nghiên cứu 25 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 25 2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2 Nội dung 2: Khảo sát, đánh giá, lựa chọn mẫu nước thải để phân lập vi sinh vật 25 2.2.1 Nội dung nghiên cứu 25 2.2.2 Phạm vi nghiên cứu 25 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu 26 i 2.3 Nội dung 3: Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả chịu mặn 30 2.3.1 Nội dung nghiên cứu 30 2.3.2 Phạm vi nghiên cứu 30 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu 30 2.4 Nội dung Đánh giá khả xử lý nước thải nhiễm mặn chủng vi sinh vật tuyển chọn 32 2.4.1 Nội dung nghiên cứu 32 2.4.2 Phạm vi nghiên cứu 32 2.4.3 Phương pháp nghiên cứu 34 2.5 Nội dung 5: Tối ưu hóa quy trình ni cấy thu nhận sinh khối 37 2.5.1 Nội dung nghiên cứu 37 2.5.2 Phạm vi nghiên cứu 38 2.5.3 Phương pháp nghiên cứu 38 2.6 Nội dung 6: Tạo chế phẩm vi sinh 41 2.6.1 Nội dung nghiên cứu 41 2.6.2 Phạm vi nghiên cứu 42 2.6.3 Phương pháp nghiên cứu 43 Chương 3.1 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 Nội dung 1: Nghiên cứu tổng quan 46 3.2 Nội dung 2: Khảo sát, đánh giá, lựa chọn mẫu nước thải để phân lập vi sinh vật 46 3.2.1 Chất lượng nước từ hệ thống xử lý nước thải tập trung cảng cá Vàm Láng 46 3.2.2 Chất lượng nước từ hệ thống xử lý nước thải công ty chế biến thủy sản Minh Thắng 46 3.3 Nội dung 3: Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả chịu mặn 49 ii 3.3.1 Kết phân lập 49 3.3.2 Kết khảo sát khả chịu mặn 53 3.3.3 Kết định danh tuyển chọn 55 3.4 Nội dung Đánh giá khả xử lý nước thải nhiễm mặn chủng vi sinh vật tuyển chọn 60 3.4.1 Tăng sinh khối chủng vi sinh vật chịu mặn cao 60 3.4.2 Đánh giá khả xử lý nước thải nhiễm mặn chủng vi sinh vật tuyển chọn 61 3.5 Nội dung 5: Tối ưu hóa quy trình ni cấy thu nhận sinh khối 76 3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng thời gian ni cấy lên q trình phát triển vi sinh vật 76 3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ, pH nồng độ muối lên phát triển vi sinh vật 80 3.6 Nội dung 6: Tạo chế phẩm vi sinh 104 3.6.1 Sản xuất giống: 104 3.6.2 Lên men thu nhận sinh khối 105 3.6.3 Kiểm tra chất lượng chế phẩm sau thu nhận 105 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 109 4.1 Kết luận 109 4.2 Kiến nghị 111 TÀI LIỆU THAM KHẢO 113 iii Danh mục kí hiệu, chữ viết tắt BOD : Biological oxygen demand (nhu cầu oxy sinh học) CNVS : Công nghệ vi sinh COD : Chemical oxygen demand (nhu cầu oxy hóa học) H% : Hiệu suất KCN : Khu công nghiệp MALDI-TOF : Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight N : Nito P : Phospho RO : Reverse osmosis (thẩm thấu ngược) SBR : Sequencing batch reactor (bể phản ứng theo mẻ) TDS : Total dissolved solids (Tổng chất rắn hòa tan) TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam TNHH : Trách nhiệm hữu hạn TSS : Total Suspended Solids (Tổng chất rắn không tan) VSV : Vi Sinh Vật OD : Optica Density iv Danh mục bảng Bảng Trang Bảng 2.1 Vị trí ký hiệu mẫu nước thu nhận phân lập vi khuẩn chịu mặn 28 Bảng 2.2 Chỉ tiêu phương pháp phân tích tính chất mẫu nước phân lập vi khuẩn chịu mặn 29 Bảng 2.4 Thành phần đường protein môi trường khảo sát 41 Bảng 3.1 Thông số chất lượng nước hệ thống xử lý cảng cá Vàm Láng 47 Bảng 3.2 Kết thông số chất lượng nước thải hệ thống xử lý nước Công ty Minh Thắng 48 Bảng 3.3 Kết phân lập vi sinh vật từ mẫu nước nhiễm mặn 50 Bảng 3.4 Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn phân lập 50 Bảng 3.5 Kết khảo sát khả chịu mặn chủng 54 Bảng 3.6 Kết định danh 10 chủng phương pháp MALDI-TOF 57 Bảng 3.7 Kết tăng sinh 10 chủng vi khuẩn chịu mặn chọn sau 48 61 Bảng 3.8 Kết đánh giá chất lượng nước thải 62 Bảng 3.9 Kết COD sau 96 xử lý ở tỷ lệ giống khác 10 chủng vi sinh vật chịu mặn chọn 64 Bảng 3.10 Khảo sát khả xử lý nước thải 10 chủng chịu mặn riêng lẻ 67 Bảng 3.11 Kết xử lý COD phối hợp VSV mẫu nước thải 70 Bảng 3.12 Hiệu suất xử lý nước thải COD nước thải đầu xử lý hỗn hợp chủng vi sinh vật 10 chủng tuyển chọn kết hợp với hỗn hợp vi sinh vật có sẵn bùn hoạt tính ban đầu 72 v Bảng 3.13 So sánh hiệu suất xử lý nước thải nhiễm mặn nghiệm thức phối hợp bùn hoạt tính với nghiệm thức xử lý riêng lẻ (%) 73 Bảng 3.14 Khả xử lý nước thải nhiễm mặn số chế phẩm có thị trường 75 Bảng 3.15 Kết khảo sát thời gian tăng trưởng tối ưu theo OD 77 Bảng 3.16 Kết khảo sát thời gian tăng trưởng tối ưu theo mật độ tế bào (*106 tế bào/ml) 79 Bảng 3.17 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ tới thời gian tăng trưởng 83 Bảng 3.18 Ảnh hưởng nhiệt độ đến tốc độ tăng trưởng 85 Bảng 3.19 Kết khảo sát ảnh hưởng pH tới thời gian tăng trưởng 86 Bảng 3.20 So sánh tốc độ tăng trưởng theo pH 89 Bảng 3.21 Kết khảo sát ảnh hưởng độ mặn tới thời gian tăng trưởng 91 Bảng 3.22 So sánh tốc độ tăng trưởng theo độ mặn 95 Bảng 3.23 Kết đo OD chủng môi trường khảo sát 97 Bảng 3.24 So sánh tốc độ tăng trưởng chủng môi trường khảo sát 102 Bảng 3.25 Mật độ tế bào chủng vi sinh vật sau nuôi cấy cấp 104 Bảng 3.26 Kết xử lý chế phẩm ở độ pha loãng 106 Bảng 3.27 Kết định danh chủng vi khuẩn chế phẩm phương pháp MALDI-TOF sau bảo quản tháng 107 vi Danh mục hình Hình Trang Hình 2.1 Tóm tắt nội dung nghiên cứu đề tài 24 Hình 2.2 Vị trí hố gom nước hệ thống xử lý nước thải cảng cá Vàm Láng 27 Hình 2.3 Hệ thống xử lý nước thải Cơng ty chế biến thủy sản Minh Thắng 27 Hình 2.4 Các chế phẩm sinh học sử dụng nghiên cứu 33 Hình 2.5 Buồng đếm Neubauer 34 Hình 2.6 Mơ hình bể SBR 36 Hình 2.7 Cơ chế hoạt động phương pháp đo OD 39 Hình 2.8 Quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh xử lý nước thải nhiễm mặn 45 Hình 3.1 Khuẩn lạc số chủng vi khuẩn chịu mặn phân lập môi trường BMS 53 Hình 3.2 Kết khảo sát khả chịu mặn chủng phân lập 53 Hình 3.3 Khảo sát khả chịu muối số chủng 55 Hình 3.4 Kết quan sát 10 chủng tuyển chọn kính hiển vi 59 Hình 3.5 Biểu đồ khảo sát tỉ lệ giống 10 chủng vi sinh vật chịu mặn lựa chọn 65 Hình 3.6 Hiệu suất xử lý nước thải chủng riêng lẻ 10 chủng chịu mặn lựa chọn 68 Hình 3.7 Hiệu suất xử lý 10 chủng ở COD đầu vào 400 mg/L 68 Hình 3.8 Hiệu suất xử lý hỗn hợp giống 70 Hình 3.9 Hiệu suất xử lý nước thải chủng đơn lẻ kết hợp với hệ vi sinh vật có sẵn bùn nước thải 73 vii Hình 3.10 Kết so sánh nghiệm thức xử lý riêng lẻ bổ sung bùn hoạt tính 74 Hình 3.11 Hiệu suất so sánh chế phẩm thị trường 76 Hình 3.12 Kết khảo sát thời gian tăng trưởng tối ưu theo OD 77 Hình 3.13 Kết khảo sát thời gian tăng trưởng tối ưu theo mật độ tế bào 79 Hình 3.14 Kết OD mật độ tế bào thời điểm tối ưu 36 80 Hình 3.15 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ tới thời gian tăng trưởng82 Hình 3.16 Ảnh hưởng nhiệt độ đến tốc độ tăng trưởng 85 Hình 3.17 Kết khảo sát ảnh hưởng pH tới thời gian tăng trưởng 89 Hình 3.18 So sánh tốc độ tăng trưởng theo pH 90 Hình 3.19 Kết khảo sát ảnh hưởng độ mặn tới thời gian tăng trưởng93 Hình 3.20 So sánh tốc độ tăng trưởng theo độ mặn 94 Hình 3.21 Sự phát triển chủng vi khuẩn môi trường khác 100 Hình 3.22 Tốc độ tăng trưởng chủng mơi trường ni cấy 102 Hình 3.23 Chế phẩm sinh học sau hoàn thiện 105 Hình 3.24 Kết xử lý chế phẩm ở độ pha loãng 106 viii MỞ ĐẦU Theo thống kê từ Hiệp hội chế biến xuất thủy sản Việt Nam VASEP, năm 2019, tổng sản lượng sản xuất thủy sản tồn quốc đạt 8,15 triệu tấn, đó, 45% khai thác chế biến, 55% nuôi trồng Thống kê đến tháng năm 2020, nước có 630 doanh nghiệp chế biến xuất thủy sản đạt chứng nhận an toàn thực phẩm với 300 nhà máy tập trung Đồng Sơng Cửu Long có sản lượng triệu tấn/năm [5] Cùng với phát triển trên, ngành chế biến thủy hải sản đưa vào môi trường lượng nước thải lớn với đặc tính độ mặn cao, gây nhiễm nghiêm trọng nguồn nước Hiện nay, công nghệ sinh học quan tâm rộng rãi xử lý nước thải mà bật tiềm ứng dụng vi khuẩn chịu mặn xử lý nước thải nhiễm mặn Một số nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật chịu mặn thực nhằm mục đích khác ứng dụng lĩnh vực nuôi trồng thủy sản mà chưa ứng dụng nhiều lĩnh vực xử lý môi trường Đây xem hội thuận lợi để đề tài thực theo đơn đặt hàng Sở Khoa học công nghệ Tiền Giang, nhằm đáp ứng kịp thời nhu cầu cần thiết cung cấp sản phẩm sinh học thân thiện với môi trường xử lý nước thải nói chung xử lý nước thải có độ mặn cao nói riêng ở khu vực Đồng sông Cửu Long Dựa vào nhu cầu trên, tiến hành thực đề tài “Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật xử lý nước thải nhiễm mặn” Mục tiêu nghiên cứu: * Mục tiêu chung: Tạo chế phẩm sinh học có ích ứng dụng xử lý nước thải có độ mặn cao * Mục tiêu cụ thể - Tuyển chọn chủng vi sinh vật ưa mặn/chịu mặn tốt ở nồng độ muối tối thiểu 3% So sánh tốc độ tăng trưởng chủng MT 2,5 1,5 0,5 MT1 MT2 MT3 MT4 1B1 1C2 MT5 2B1 MT6 3B3 4A1 MT7 MT8 MT9 4B6 Hình 3.22 Tốc độ tăng trưởng chủng môi trường nuôi cấy Bảng 3.24 So sánh tốc độ tăng trưởng chủng môi trường khảo sát Chủng MT1 MT2 MT3 1B1 1C2 2B1 3B3 4A1 4B6 tmax 5 OD0 0,245 0,230 0,452 0,263 0,530 0,539 ODmax 0,252 0,250 0,459 0,466 0,552 0,561 Tốc độ tăng trưởng 1,027 1,085 1,015 1,772 1,042 1,042 tmax 4 3 3 OD0 0,489 0,398 0,587 0,574 0,512 0,437 ODmax 0,839 0,723 0,915 0,806 0,847 0,900 Tốc độ tăng trưởng 1,715 1,815 1,559 1,405 1,656 2,061 tmax 3 OD0 0,215 0,225 0,436 0,426 0,215 0,426 ODmax 0,464 0,483 0,671 0,491 0,442 0,541 Tốc độ tăng trưởng 2,163 2,149 1,539 1,153 2,058 1,269 102 MT4 MT5 MT6 MT7 tmax 3 OD0 0,268 0,314 0,314 0,209 0,235 0,247 ODmax 0,338 0,340 0,422 0,273 0,309 0,317 Tốc độ tăng trưởng 1,262 1,083 1,344 1,309 1,316 1,284 tmax 5 4 OD0 0,242 0,254 0,562 0,243 0,599 0,538 ODmax 0,311 0,296 0,607 0,337 0,632 0,557 Tốc độ tăng trưởng 1,286 1,166 1,080 1,388 1,055 1,036 tmax 5 OD0 0,236 0,412 0,231 0,207 0,226 0,244 ODmax 0,543 0,558 0,297 0,351 0,297 0,325 Tốc độ tăng trưởng 2,301 1,355 1,286 1,700 1,312 1,330 tmax 5 5 5 OD0 0,4130 0,2270 0,2630 0,3180 0,4920 0,2950 ODmax 0,4615 0,3370 0,2865 0,3545 0,5370 0,3415 Tốc độ tăng trưởng 1,1174 1,4846 1,0894 1,1148 1,0915 1,1576 MT8 MT9 tmax 3 OD0 0,163 0,345 0,298 0,209 0,226 0,224 ODmax 0,255 0,424 0,392 0,269 0,317 0,370 Tốc độ tăng trưởng 1,569 1,229 1,314 1,288 1,400 1,650 tmax 4 OD0 0,258 0,271 0,512 0,318 0,618 0,554 ODmax 0,319 0,352 0,569 0,362 0,741 0,619 Tốc độ tăng trưởng 1,234 1,299 1,111 1,138 1,198 1,118 Chủng 1B1, 1C2 4B6 sinh trưởng phát tiển tốt môi trường Lastose-Pepton với thời gian sinh trưởng tối ưu từ 4-5 , chủng 4B6 phát triển 3-4 Chủng 2B1 4A1 sinh trưởng phát triển tốt môi trường Lastose-Pepton khoảng thời gian sinh trưởng tối ưu 3-4 103 Chủng 3B3 sinh trưởng phát triển tốt môi trường BMS LastoseCao men khoảng thời gian sinh trưởng tối ưu 4-5 Kết cho thấy môi trường môi trường hỗ trợ loại vi khuẩn mục tiêu cho tốc độ tăng trưởng mạnh đồng Kết phù hợp với kết so sánh mật độ tế bào chủng vi khuẩn môi trường khác ở 3.6 Nội dung 6: Tạo chế phẩm vi sinh 3.6.1 Sản xuất giống: Kết kiểm tra giống trước lên men phương pháp đo OD quan sát kính hiển vi cho kết tốt: - Toàn chủng giống thuần, không tạp nhiễm - Mật độ vi khuẩn chủng giống sau nuôi cấy giống cấp trình bày bảng 3.25 Bảng 3.25 Mật độ tế bào chủng vi sinh vật sau nuôi cấy cấp STT Kí hiệu chủng Mật độ sau ni cấy cấp (tế bào/ml) Mật độ sau nuôi cấy cấp (tế bào/ml) 1B1 3,5 x 109 x 109 1C2 x 109 2,4 x 109 2B1 1,7 x 109 3,2 x 109 3B3 5,1 x 109 1,7 x 109 4A1 2,3 x 109 3,6 x 109 4B6 8,1 x 109 6,6 x 109 104 3.6.2 Lên men thu nhận sinh khối Sau lên men 10 L, kết kiểm tra toàn chủng giống kính hiển vi cho thấy chủng thuần, không tạp nhiễm Kết kiểm tra phương pháp đo OD cho thấy chủng đạt mật độ 109 tế bào/ml trước đơng khơ tĩnh phối trộn Sản phẩm chế phẩm hoàn chỉnh sau phối trộn đóng gói với định lượng 500 g hình 3.20 Hình 3.23 Chế phẩm sinh học sau hoàn thiện 3.6.3 Kiểm tra chất lượng chế phẩm sau thu nhận 3.6.3.1 Kiểm tra khả xử lý nước thải nhiễm mặn thực tế Hiệu chế phẩm ở độ pha loãng khác mẫu nước thải trực tiếp công ty Thành Công trình bày ở bảng 3.25 hình 3.24 cho thấy ở độ pha loãng, thời gian xử lý hiệu 72 Mẫu có hiệu suất xử lý tốt tương đương với mẫu đối chứng sử dụng chủng VSV môi trường nuôi cấy tối ưu CP10 Đây tỷ lệ pha loãng 10 g chế phẩm dạng rắn 100 ml nước cất Hiệu xử lý đạt 88,75% so với hiệu suất 91,22% đối chứng Với tỷ lệ pha loãng CP10, để xử lý m3 nước thải cần 100 L chế phẩm hòa tan, nghĩa cần 10 kg chế phẩm dạng rắn So với tỷ lệ CP50, hiệu 105 xử lý đạt 80,35% sau 72 Và cần sử dụng kg chế phẩm cho m3 nước thải cần xử lý Bảng 3.26 Kết xử lý chế phẩm độ pha loãng Thời gian Đối chứng 24h 48h 72h 96h COD 202,36 153,67 35,12 67,03 H% 49,41 61,58 91,22 83,24 COD 192,33 92,25 45,01 55,32 H% 51,92 76,94 88,75 86,17 COD 226,52 122,38 78,62 89,44 H% 43,37 69,01 80,35 77,64 COD 302,62 246,67 104,38 155,32 H% 24,33 38,33 73,91 61,17 COD 313,33 167,25 153,67 199,13 H% 21,67 58,19 61,53 50,22 CP 10 CP 50 CP 100 CP 500 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 24h Đối chứng 48h CP10 72h CP50 CP100 96h CP500 Hình 3.24 Kết xử lý chế phẩm độ pha loãng 106 3.6.3.2 Kiểm tra hệ VSV chế phẩm sau bảo quản tháng Sau đóng gói tháng, chế phẩm lấy mẫu để kiểm tra mật độ khả tồn chủng vi sinh vật mục tiêu ban đầu Kết định danh chủng vi khuẩn chế phẩm sau tháng thể bảng 3.27 Bảng 3.27 Kết định danh chủng vi khuẩn chế phẩm phương pháp MALDI-TOF sau bảo quản tháng STT Kết định danh Tỷ lệ tương đồng Kí hiệu ban đầu Bacillus cereus 2,63 4B6 Bacillus lichenniformis 2,29 2B1 Bacillus subtilis 2,26 4A1 Lactobacillus pentosus 1,73 3B3 Micrococcus luteus 2,42 1C2 Staphylococuss epidermidis 2,18 1B1 Ghi chú: giá trị tương đồng phương pháp MALDI-TOF 3.6.3.3 Kiểm tra mật độ VSV chế phẩm sau bảo quản tháng Kết kiểm tra mật độ Trung tâm cho thấy sau tháng bảo quản, mật độ VSV mục tiêu chế phẩm có giảm nhẹ nằm gần khoảng 109 tế bào/gram phù hợp với yêu cầu chất lượng đặt ban đầu Ngồi ra, 107 khơng phát Salmonella 25 g mẫu chế phẩm thử nghiệm lượng Escherichia coli ngưỡng cho phép (