Phân lập, tuyển chọn dòng Bacillus thuringiensis từ ấu trùng sâu khoang (Spodoptera litura) và sâu tơ (Plutella xylostella) nhiễm bệnh.pdf

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG NGUYEN TAT THANH KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYẾN CHỌN DÒNG Bacillus thuringiensis TỪ Ẳu TRÙNG SÂU KHOANG (Spocloptera litura) VÀ SÂU Tơ (Plutella xylo Stella) NHIỄM BỆNH Sinh viên thực : Nguyền Thị Kiều Khanh Chuyên ngành TP.HCM, tháng năm 2018 : Công nghệ Sinh học Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN DỊNG Bacillus thuringiensis TỪ ẤU TRÙNG SÂU KHOANG (Spodoptera litura) VÀ SÂU Tơ (Plutella xyloStella) NHIỄM BỆNH Sinh viên thực Nguyễn Illi Kiều Khanh Mã số sinh viên 1411529627 Lớp 14DSH01 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Giáo viên hướng dần ThS Nguyễn Thị Nhã TP.HCM, tháng năm 2018 LỜI CẢM ƠN Đe hồn thành khóa luận tốt nghiệp Đại học này, cố gắng làm việc chăm thân, tơi cịn nhận hướng dần, ủng hộ, giúp đờ nhiều người Tôi xin chân thành cảm ơn: Giảng viên hướng dần ThS Nguyễn Thị Nhã, Công nghệ Sinh học Môi trường, trường Đại học Nguyền Tất Thành, hướng dần truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình thực đe tài quan tâm, động viên giúp đỡ sống Ban lãnh đạo Khoa thầy cô Khoa, trường Đại học Nguyễn Tất Thành, giảng dạy, trang bị kiến thức cho tơi thời gian qua Tập phịng Sinh học Phân tử Thực vật nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè ln bên tơi động viên, chia sẻ khó khăn, tạo điều kiện tốt giúp tơi q trình học tập thực khóa luận Nguyễn Thị Kiều Khanh Khoa Cơng nghệ Sinh học Môi trường Trường Đại học Nguyễn Tất Thành II MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii TÓM TẮT V SUMMARY vi DANH MỤC CÁC CHỪ VIẾT TẨT vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii DANH MỤC CÁC BẢNG ix ĐẬT VÁN ĐÈ CHƯƠNG TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu vi khuan Bacillus thuringiensis (Bt) 1.1.1 Sơ lược lịch sử khám phá Bt 1.1.2 Cơ chế hoạt động protein tinh the diệt sâu (ICP) 1.1.2.1 Sự phân hủy hoạt hóa ICP 1.1.2.2 Sự liên kết độc tố hoạt động thụ the đặc biệt 1.1.2.3 Sự hình thành lồ phân giải tế bào ruột côn trùng 1.1.3 Phân loại genđộc tố Bt 1.2 Giới thiệu sâu khoang 1.2.1 Vị trí phân loại 1.2.2 Vòng đời tập quán sống sâu khoang 1.2.3 Tác hại sâu khoang 1.3 Giới thiệu sâu tơ 1.3.1 Vị trí phân loại 1.3.2 Vòng đời tập quán sống sâu tơ 1.3.3 Tác hại sâu tơ 10 1.4 Giới thiệu số phương pháp sử dụng nghiên cứu 10 1.4.1 Nguyên tắc phương pháp PCR 12 1.5 Tinh hình nghiên cứu nước Bacillus thuringiensis 13 1.5.1 Tinh hình nghiên cứu nước 13 1.5.2 Tinh hình nghiên cứu ngồi nước 13 iii CHƯƠNG NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúư 15 2.1 Thời gian địa điếm nghiên cứu 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 Vật liệu nghiên cứu 15 2.4 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất 16 2.5 Phương pháp nghiên cứu 17 2.5.1 Phương pháp phân lập 18 2.5.2 Phương pháp sàng lọc 18 2.5.2.1 Nhuộm Gram vi khuân 18 2.5.2.2 Phương pháp PCR 19 2.5.2.3 Phương pháp điện di 20 2.5.3 Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu non sâu cánh vảy theo phương pháp Thiery Frachon 20 2.5.3.1 Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ 20 2.5.3.2 Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu khoang 20 2.5.3.3 Đánh giá hiệu lực trừ sâu tơ sâu khoang theo công thức Abbott 21 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Ket thu thập, phân lập xác định đặc điếm hình thái cùa vi khuấn gây bệnh sâu khoang sâu tơ 22 3.1.1 Kết thu thập 22 3.1.2 Kết phân lập 22 3.1.3 Đặc điếm hình thái vi khuẩn 25 3.2 Ket xác định gen protein phản ứng PCR 26 3.3 Ket diệt sâu non cánh vảy 29 3.3.1 Kết diệt sâu tơ 29 3.3.2 Ket diệt sâu khoang 33 KÉT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHAO 41 PHỤ LỤC 44 IV TÓM TẮT Sâu cánh vảy lồi gây thiệt hại nghiêm trọng đến ngành nơng nghiệp nước nước Đe tài: “Phân lập, tuyển chọn dòng Bacillus thuringiensis từ ấu trùng sâu khoang (Spodoptera litura) sâu to’ (Plutella xylostella) nhiễm bệnh” thực từ tháng năm 2017 đến tháng năm 2018 phịng thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật, khoa Công nghệ Sinh học Môi trường với mục tiêu chọn lọc dòng vi khuân có khả tiêu diệt sâu cao gây chết 80% sâu non tuoi sâu khoang sâu tơ Đe tài có bốn nội dung: Phân lập dòng Bacillus thurỉngiensis từ sâu tơ, sâu khoang bị bệnh; Sàng lọc dịng Bt thơng qua đặc điểm hình thái tế bào; Sàng lọc dòng Bt phương pháp PCR; Thử nghiệm khả diệt sâu tơ, sâu khoang dịng Bĩ Các thí nghiệm bố trí theo kiêu hồn tồn ngẫu nhiên Những kết đạt nghiên cứu: Từ mầu sâu khoang sâu tơ bị bệnh thu khu vực Cù Chi - Tp HCM khu vực Đức Trọng - Lâm Đồng, phân lập dạng vi khuẩn Qua sàng lọc quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào cho thấy, dạng khuẩn có khuẩn lạc trịn, màu trắng kem; khuẩn có hình que, Gram dương Tuy nhiên, khuẩn lạc dạng có viền nhăn, bề mặt sần sùi so với khuẩn lạc dạng bề mặt trơn, viền lan xung quanh, từ đó, phân thành dòng Bt Bt Phản ứng PCR xác định diện gen CrylA mã hóa protein tinh thể diệt sâu có dòng khuẩn Bt Từ kết thử hoạt tính diệt sâu sâu tơ tuổi 2, chọn dịng Bt có khả diệt sâu tơ cao, gây chết 96,67 % với sâu tuổi 90,00 % với sâu tuổi Từ kết thử hoạt tính diệt sâu sâu khoang tuối 1, 3, chọn dòng Bt có khả diệt sâu khoang cao, gây chết 80,00 % với sâu khoang tuổi V SUMMARY Lepidoptera is a species that cause serious damage to the agriculture of the country and abroad "Isolation and selection of Bacillus thuringiensis from Spodoptera litura and Plutella xylostella infected insect " was conducted from September 2017 to August 2018 at the Laboratory of Plant Molecular Biology in the Faculty of Biotechnology and Environmental, Nguyen Tat Thanh University, with the objective of selecting strains of bacteria to kill higher than 80 % insect larvae of Plutella xylostella or Spodoptera litura The subject has four parts: Isolating the Bacillus thuringiensis strain from infected Plutella xylostella and Spodoptera litura', Selecting Bt strains through cell morphology; Determining Bt strains by PCR reaction; Testing the ability of the Bt Strains to kill Plutella xylostella and Spodoptera litura The experiments were arranged in a completely random Results obtained of study: From two samples of the infected Plutella xylostella and Spodoptera litura collected in two areas of Cu Chi - Ho Chi Minh City and Duc Trong - Lam Dong, two strains of bacteria were isolated Both isolated strains had the round creamy white colony, the bacteria were gram-positive bacteria, rod, separating to strains Bt and Bt Electrophoresis results of the PCR product determined the genes encoded insecticidal crystal protein in both strains of Bt Through the results of insecticide activity on Plutella xylostella ages and 2, the strain Bt was selected to have capable of high kill Plutella xylostella, achieving mortality rate of 96.67 % in ages and 90.00 % in age Through the results of insecticide activity on Spodoptera litura ages 1, and 3, the strain Bt was selected to have capable of kill Spodoptera litura, achieving mortality rate of 80.00 % in ages vi DANH MỤC CÁC CHỦ VIẾT TẮT Bt : Vi khuân Bacillus thuringìensis ĐHQG TPHCM: Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh ĐHSP TPHCM Đại học Su Phạm Thành phố Hồ Chí Minh ICP (Insecticidal Crystal Protein) protein tinh thê diệt sâu DIGE (Difference Gel Electrophoresis) khác biệt gel điện di PCR (Polymerase Chain Reaction) phản ứng khuếch đại gen MĐ Mật độ KL Khuân lạc IB Tế bào cv Hệ số biến thiên - Coefficient of Variation LSD Sự khác biệt có ý nghĩa - Least Significant Difference vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơ chế hoạt động củaICP Hình 1.2 Sâu khoang Hình 1.3 Vịng đời sâu khoang Hình 1.4 Sâu tơ Hình 1.5 Vịng đời sâu tơ 10 Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt q trìnhnghiên cứu 17 Hình 3.1 Mầu thu thập sâu bị nhiễm bệnh bên 22 Hình 3.2 Ketquả phân lập từ ấu trùng sâu khoang bị bệnh 23 Hình 3.3 Ketquả phân lập từ ấu trùng sâu tơ bị bệnh 23 Hình 3.4 Kếtquả điện di sản phẩm PCR sốkhuẩn lạc với cặp mồi Spe-a, Spe-b, Spe-C, Spe-d 24 Hình 3.5 Khuẩn lạc Bt phân lập mơi trường LB 24 Hình 3.6 Hình thái tế bào vi sinh vật quan sát kính hiến vi 26 Hình 3.7 Ket điện di dòng vi khuẩn Bt Bt moi CJI 26 Hình 3.8 Kết điện di 15khuẩn lạc dòng Bt mồispe-a 27 Hình 3.9 Ket điện di 15 khuẩn lạc dòng Bt mồispe-a 27 Hình 3.10 Ket điện di 15khuẩn lạc dịng Bt mồiSpe-C 28 Hình 3.11 Ket điện di 15 khuẩn lạc dòng Bt mồiSpe-C 28 Hình 3.12 Ket điện di cùa 15khuân lạc dòng Bt mồiSpe-b 28 Hình 3.13 Kết điện di 15 khuẩn lạc dòng Bt mồiSpe-b 29 Hình 3.14 Ket xử lý sâu tơ tuổi dịch khuẩn Bt sau72h 30 Hình 3.15 Ket xử lý sâu tơ tuổi dịch khuẩn Bt sau72h 31 Hình 3.16 Ket xử lý sâu tơ tuổi dịch khuẩn Bt sau72h 32 Hình 3.17 Ket xử lý sâu tơ tuổi dịch khuẩn Bt sau48h 33 Hình 3.18 Kết xử lý sâu khoang tuồi dịch khuẩn Bt sau 72h 34 Hình 3.19 Kết xử lý sâu khoang tuổi dịch khuẩn Bt sau 72h 35 Hình 3.20 Kết xử lý sâu khoang tuổi dịch khuẩn Bt sau 48h 36 Hình 3.21 Kết xử lý sâu khoang tuồi dịch khuẩn Bt sau 72h 37 Hình 3.22 Kết xử lý sâu khoang tuổi dịch khuẩn Bt sau 48h 38 Hình 3.23 Kết xử lý sâu khoang tuổi dịch khuẩn Bt sau48h 38 viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại gen Bt ICP Bảng 2.1 Các mồi dùng để xác định diện gen mã hóa protein tinh the phân lớp CrylA theo Jairo ceron (1995) .15 Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ sử dụng nghiên cứu 16 Bảng 2.3 Danh mục thiết bị dùng nghiên cứu 17 Bảng 2.4 Danh mục hóa chất sử dụng nghiên cứu 17 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR 19 Bảng 2.6 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 20 Bảng 3.1 Đặc điềm hình thái khuẩn lạc môi trường LB 25 Bảng 3.2 Đặc diem tế bào vi khuẩn quan sát kính hiến vi kết nhuộm Gram 25 Bảng 3.3 Kết quảdiệt sâu tơ tuổi dòng Bt 30 Bảng 3.4 Ket quảdiệt sâu tơ tuổi dòng Bt 30 Bảng 3.5 Ket quảdiệt sâu tơ tuối dòng Bt 31 Bảng 3.6 Ket diệt sâu tơ tuoi dòng ổ/ 32 Bảng 3.7 Kết diệt sâu khoang tuổi cùa dòng Bt 34 Bảng 3.8 Ket diệt sâu khoang tuoi dòng Bt 34 Bảng 3.9 Ket diệt sâu khoang tuổi cùa dòng Bt 35 Bảng 3.10 Kết diệt sâu khoang tuổi dòng Bt 36 Bảng 3.11 Ket diệt sâu khoang tuoi dòng Bt 37 Bảng 3.12 Ket diệt sâu khoang tuổi dòng Bt 38 IX ... thái Từ sở nêu trên, đề tài ? ?Phân lập, tuyển chọn dòng Bacillus thuringiensis từ ấu trùng sâu khoang (Spodoptera litura) sâu tơ (Plutella xylostella) nhìễni bệnh” tiến hành Mục tiêu đề tài Phân. .. nghiệp nước nước Đe tài: ? ?Phân lập, tuyển chọn dòng Bacillus thuringiensis từ ấu trùng sâu khoang (Spodoptera litura) sâu to’ (Plutella xylostella) nhiễm bệnh” thực từ tháng năm 2017 đến tháng... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN DỊNG Bacillus thuringiensis TỪ ẤU TRÙNG SÂU KHOANG (Spodoptera litura)