Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm từ rừng quốc gia cúc phương (ninh bình) sinh tổng hợp acetyl(xylan) esterase và bước đầu tinh sạch enzyme này

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mờ Hà Nội LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn PGS TS Lê Mai Hương cho em hội làm việc học tập phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Viêt Nam Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Đồ Hữu Nghị tận tình bão, dạy dồ, hướng dần em đê em có thê hồn thành tốt khóa luận Em xin chân thành cảm ơn cán nhân viên phòng yêu quý, tận tình giúp đờ em, tạo điều kiện thuận lợi cho em trình thực tập phòng Sinh học thực nghiệm Em xin chân thành cảm ơn thầy, cô khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mờ Hà Nội tận tình giảng dạy giúp đỡ em thời gian học tập trường Cuối em kính chúc quý thầy cô cô anh chị phịng Sinh học thực nghiệm ln dồi sức khõe, đạt nhiều thành công nghiệp nghiên cứu khoa học truyền đạt tri thức cho hệ sinh viên trẻ Hà Nội, ngày 21 tháng năm 2015 Sinh viên thực Hà Thị Như Quỳnh Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mờ Hà Nội MỤC LỤC MỚ ĐÀU CHƯƠNG I: TÔNG QUAN 1.1 Giới thiệu nấm đảm (Basidiomycota) nấm túi (Ascomycota) 1.1.1 Nấm đám (Basidiomycota) 1.1.2 Nấm túi (Ascomycota) ' 1.2 Cấu trúc đặc điếm xylan pectin enzyme carbohydrate esterase thúy phân xylan 1.2.1 Cấu trúc đặc điếm xylan 1.2.2 Cấu trúc đặc điểm pectin 1.2.3 Các enzyiĩ|^hịy^t^^^,^y|b^J^; N.ộ| CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14 2.1 Nguyên liệu 14 2.1.1 Chúng nấm 14 2.1.2 Các loại môi trường 14 2.1.3 Máy móc, thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 15 2.1.4 Hóa chất 15 2.2 Phương pháp 16 2.2.1 2.2.2S Phân lập nấm 16 àng lọc chung nấm có khả sinh enzyme acetyl(xylan) esterase 16 2.2.3 Môi trường sàng lọc, cảm ứng sinh tống hợp enzyme 17 2.2.4 Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho sinh tống hợp enzyme 17 Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 Viện Đại học Mờ Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 2.2.5 Động học lên men sinh tống hợp enzyme 18 2.2.6 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 18 2.2.7 Tách chiết tinh enzyme 18 CHƯƠNG III: KẾT QUÀ VÀ THÀO LUẬN 20 3.1 Kết phân lập 20 3.2 Kết sàng lọc lựa chọn chủng nấm sinh enzyme cao 20 3.3 Cơ chất điều kiện thích hợp lên men sinh tổng hợp enzyme bời nấm Alternaria sp SP66 23 3.3.1 Cơ chất cảm ứng sinh tổng hợp acetyl(xylan) esterase 23 3.3.2 Điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp cho lên men sinh tông hợp enzyme bời chủng nám Alternaria sp SP66 25 3.4 Ket (bước đau) tinh acetyl(xylan) esterase .27 KÉT LUẬN VÀ KiĩihNGHện V.iệxi Đại.họ.c.Mo:.Hà N.ộj 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mờ Hà Nội DANH MỤC CHŨ VIẾT TẢT CS: Cộng VSV: Vi sinh vật Mw: Trọng lượng phân tứ (molecular weight) km: Hằng số xúc tác(michaelis constant) pì: Điểm đắng điện(Isoelectrics point) Vnrax:Vận tốc phán ứng cực đại (maximal Velocity) Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mờ Hà Nội DANH MỤC BẢNG Bàng 1: Đặc tính số acetyl(xylan) esterase từ nguồn vi sinh vật (bao gồm enzyme tái tổ hợp) 13 Báng 2: Hoạt tính sinh acetyl(xylan) esterase (AE) cùa chúng nấm nghiên cứu 21 Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mờ Hà Nội DANH MỤC HÌNH Hình : Các dạng quà thể nấm túi Ascomycota Hình 2: cấu trúc xylan enzym thủy phân xylan Hình 3: Các phần acetyl hóa feruloyl cấu trúc pectin Hình 4: Chủng nấm SP66 phân lập từ rừng quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình) phát triển môi trường thạch 22 Hình 5: Trình tự nucleotide chủng nấm SP66 23 Hình 6: Bước đau tinh protein biếu hoạt tính acetyl(xylan) esterase từ mơi trường ni cấy nấm Alternaria sp SP66 sắc kí trao đoi anion DEAE Sepharose 27 Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mờ Hà Nội DANH MỤC BIÊU ĐÒ Biểu đồ 1: Hoạt tính sinh acetyl(xylan) esterase cùa chủng nấm Altemaria sp SP66 điều kiện môi trường bô sung chất khác 24 Biếu đồ 2: Hoạt tính sinh acetyl(xylan) esterase chủng Alternaria sp SP66 mơi trường ni cấy lịng chất rơm giá trị nhiệt độ khác 25 Biêu đồ 3: Hoạt tính sinh acetyl(xylan) esterase cùa chùng Alternaría sp SP66 mơi trường ni cấy lóng chất rơm giá trị pH khác 26 Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 MỎ ĐẦU Đặt vấn đề Hiện trái đất, năm thực vật sàn sinh lượng sinh khối khống lồ ước tính đạt tới bốn mươi tỹ Tất cà hoạt động người loài động vật cần đến thực vật Chúng nguồn lương thực để nuôi sống người động vật đồng thời nguồn cung cấp nguyên, nhiên vật liệu cho ngành cơng nghiệp Đe thay đổi tính chất cùa vật liệu đầu vào cho phù hợp với sản phấm mong đợi người ta phái tìm cách thay đổi cấu trúccúa thành tế bào thực vật Tuy nhiên thành tế bào thực vật lại có cấu tạo vừng cellulose, hemicellulose lignin đế phá húy phần tồn chúng người ta thường sử dụng phương pháp hóa - lý xử lý nhiệt độ cao, áp suất cao, hóa chất mạnh axit mạnh hay kiềm mạnh Do chi phí để sàn xuất sàn phấm giấy thường cao gây ảnh hướng nghiêm trọng đến mơi trường sinh thái Chính mà u cầu đặt phải thay bàng phương pháp an tồn mơi trường Và giái pháp cho vấn đề loậi enzym thủy phân pởlyrher sinh học kê Nhưng để phân giài hiệu polymer bền này, enzyme phân giải mạch chính, cần có enzyme thúy phân liên kết ester thuộc nhóm carbohydrateesterase (CE) như: acetyl(xylan) esterase; cinnamoyl esterase; feruloyl esterase; carboxyl esterase; S-formylglutathione hydrolase; N-acetylglucosamine 6-phosphate deacetylase; N-acetylglucosamine 6-phosphate deacetylase Trong tham gia vào q trình chuyến hóa lignocellulose chủ yếu có /2-coumaryl/feruloyl esterase acetyl(xylan) esterase, hoạt động mạch nhánh cấu trúc polysaccharide thành tế bào đê phân cat liên kết cầu nối chuồi xylan xylan với lignin; chúng đóng vai trị quan trọng giai đoạn đầu trình phân hủy lignocellulose (Williamson & cs., 1998, Wong 2006) Theo sở liệu CAZy (http://www.cazy.org; Cantarelá cs., 2009), carbohydrate esterase enzyme xúc tác đề-acetyl hóa liên kết O- hay N- cùa saccharide vị trí thế, ester hay amid, đơn vị đường đóng vai trị alcohol hay amin Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 Một enzyme quan tâm enzyme acetyl(xylan) esterase bời vai trò chúng ứng dụng công nghệ sản xuất giấy bột giấy, dệt may, công nghệ sàn xuất thức ăn chăn nuôi, Tuy ứng dụng nhiều lĩnh vực sống, ứng dụng thực tiễn cùa enzyme có hạn che thiếu thơng tin đặc tính xúc tác, điều kiện tối ưu sinh tông hợp enzyme sử dụng quy mô lớn Thông qua đề tài nghiên cứu: "Phăn lập tuyển chọn chứng nấm từ rừng quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình) sinh tống họp acetyl(xylan) esterase bước đầu tinh enzyme này" hy vọng có the bước đau tuyền chọn chủng nấm có sinh tổng hợp enzyme acetyl(xylan) esterase, biết có vai trị liên quan đến chuyển hóa xylan, cơng cụ quan trọng nghiên cửu che cấu trúc thành tế bào thực vật có thề bước đầu thu nhận enzyme Mục tiêu đề tài • Phân lập định tên (bằng phương.pháp, hình thái sinh học phân tư) số chùng (nấm đàm, nấm túi) rừng quốc gia Cúc Phương • Đánh giá tuyền chọn chúng có khả sinh tống hợp enzyme acety](xylan)esterase • Bước đầu tinh protein enzyme có hoạt tính acetyl(xylan) esterase từ (một) chủng nam phân lập Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 CHƯƠNG I: TÓNG QUAN l.l Giới thiệu nấm đâm (Basidiomycota) nấm túi (Ascomycota) 1.1.1 Nấm đảm (Basidiomycota) • Đặc điểm Nấm đám (Basidiomycota) lớp nấm lớn, số hoại sinh, nhiều lồi ăn đa số kí sinh thực vật Lớp nấm phổ biến, chúng gồm nấm ăn, nấm cò giầy, đặc trưng bới cấu tạo đảm bào lử đảm Ờ nấm đám khuẩn ti có vách ngăn bào tử không di động Khuẩn ti nấm đám sinh phồng lên đặc trưng, gọi u nối, chúng đóng vai trò đặc biệt di truyền hạch nhân Hầu hết nấm đàm sống cạn Hệ sợi nấm phát triền,, sợi nấm có ch ngăn ngang chưa hồn chinh Sinh -A- ,.A /u Y4en_yiewmMc Mợ HaNftL sàn vơ tính băng đính bào tử, sinh sản hữu tính băng bào từ đám hình thành ngồi đăm Q trình sinh sàn hữu tính diễn sau: Các bào tử đàm, hình thái giống nhau, mặt sinh lý có khác nhau, nảy mầm cho loại sợi nấm sơ cấp khác tính (gọi sợi âm sợi dương) Mỗi tế bào sợi mang nhân đơn bội Khi tế bào đau sợi gặp kết hợp thành tế bào nhân phát triển thành sợi thứ cấp có đời sống kéo dài Đến lúc tế bào đầu sợi mọc ống nhở hướng phía gốc tế bào hai nhân phân chia thành 4, đong thời xuất vách ngăn, tách thành tế bào: tế bào đinh chứa nhân, tế bào ống tế bào chân gốc chứa nhân (2 tế bào sau hợp lại thành tế bào có nhân) Tế bào đinh phát triền thành đâm: nhân kết hợp với phân chia liên tiếp lần, lần đầu giản nhiễm, đổ cho nhân Te bào phình lo ra, phía mọc u nhỏ, mồi nhân chui vào u biến thành bào tử đâm mọc bên ngồi đám • Phân loại Dựa vào đặc điếm cùa nấm đám, số tác giã chia lóp nấm thành phân lớp Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 Dịch chiết thơ có hoạt tính acetyl(xylan) esterase thâm tích 2-3 lần với đệm Na-acetate (10 mM, pH 4.5) Sau nạp mầu lên cột trao đối anion DEAE Sepharose CL-6B (GE Healthcare) Các protein hoạt tính acetyl(xylan) esterase rửa giái với gradient muối NaCl từ 0-I.5M đệm Na-acetate 10 mM pH 4.5 Thu phân đoạn (4ml/phân đoạn) với tốc độ dòng 3ml/ph Các phân đoạn xác định hàm lượng protein hoạt tính enzyme với chất p-nitrophenyl acetate (mục 2.2.6) Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 19 CHUÔNG III: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập Các mẫu (nấm, lá, gỗ mục) thu thập từ Vườn quốc gia Cúc Phương tiến hành phân lập môi trường thạch malt có bơ sung kháng sinh Sau đến ngày nuôi tú ổn nhiệt 30°C khuẩn lạc khác cấy chuyền sang đĩa petri chứa môi trường thạch malt riêng biệt tiếp tục cấy chuyển đến lần đề làm Dựa việc quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc hệ sợi, chủng nấm tập hợp thành sưu tập gồm 16 chúng, sưu tập dùng đề thứ sinh tổng tổng họp acetyl(xylan) esterase thí nghiệm 3.2 Kết sàng lọc lựa chọn chủng nấm sinh enzyme cao • Kết q sànglqc trêu ỊỊiơitrưìmgrắn: Hiư viện Viện t)ại học Mở Hà Nội Đế đánh giá xác hoạt tính cùa chúng nấm thứ nghiệm nhàm tìm chủng có hoạt tính tốt cho mục tiêu nghiên cứu sâu hơn, thực sàng lọc hoạt tính enzyme acetyl(xylan) esterase chúng nấm mơi trường ni cấy rắn có bổ sung nguồn lignocelluloses tự nhiên (mùn gỗ rơm) Việc thử hoạt tính enzyme chùng nấm thực sau 25 ngày nuôi cấy môi trường trên, hoạt tính cao cùa chủng nấm sau mồi ngày xác định so sánh với chùng nấm Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 20 Bâng 2: Hoạt tính sinh acetyl(xylan) esterase (AE) cũa chủng nấm nghiên cứu STT Tên chủng Hoạt độ enzyme (U/L) Nầm đảm (Basidiomycota) Tyrotnyces lacteus SH01 Poria versipora HL02 Trametes palisoti SH05 18,6 Marasmius maximus SH02 Polystictus didrichsenii SH12 24,8 SH03 11,4 Ganoderma austral G2 Nấm túi (Ascomycota) Bisporella citrine SH30 Thư viên Vièn Dai hoe vlỏ Hà Nơi Hexagonia apìaria SH01 Xylaria sp.SH02 6,2 Daldinia concentrica RyeOO 12 Xylariasp SH03 3,8 13 Daldinia SH 01 14 CP564 17,5 15 SP66 193,4 16 Kretzschmaria deusta SH03 10 11 Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 21 Hình 4: Chúng nấm SP66 phân lập từ rừng quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình) phát triển môi trường thạch Kết Bảng cho thấy, có số 16 chùng nấm phân lập biếu hoạt tính sinh enzyme acetyl(xylan) esterase, có chủng thuộc Ascomycota chùng thuộc Basidiomycota Đặc biệt, hoạt độ enzyme acetyl(xylan) esterase cùa chùng nấm SP66 (thuộc nhóm nấm Ascomycota) có giá trị cao 193,4U/L Hoạt độ tương đối cao quan sát hai chủng nấm thuộc Basidiomyota 1ÙSH05 SH12 với hoạt tính 18,6U/L 24,8U/L Nhìn chung, xét theo ti lệ (%) biểu hoạt tính enzyme acetyl(xylan) esterase lồi nấm nghiên cứu thuộc ngành Ascomycota (44,4%, số chủng) cao so với nấm thuộc ngành Basidiomycota (42,9%, số chủng nấm) Từ kết quà trên, lựa chọn chủng ký hiệu SP66 đế tiến hành khảo sát điều kiện tối ưu cho sinh trường, phát triển khả sinh enzyme acetyl(xylan) esterase Vì vậy, chùng SP66 định tên bang phương pháp sinh học phân tử kết hợp với phân loại bang hình thái (mục 2.2.1) Kct quảcho thấy trình tựmẫu nấm SP66 (Hình 5) tương đồng cao 99% với số loài chi Altemaria (Alternaria tenuissima JX523613, Alternaria compacta FR846405, Alternaria tomatophila HE803347, ) thuộc họ Pleosporaceae Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 22 > SP66 GCGGGCTGGACCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCT TGTCTTTTGGGGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGAC AAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATT ACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGC GAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTT TGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCG TCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCTTTG CTGGAGACTCGCCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCG CAGCACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCAATTAAGCCT TTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGC ATATCAATAAAGCGGAGGA Hình5: Trình tự nucleotide chúng nấm SP66 có độ dài 572 nucleotide tương đồng cao (99^ với số loài chị Ạiternan.ạ 3.3 Co' chất điều kiện thích họp lên men sinh tống họp enzyme nấm Alternaria sp SP66 Trong phần lớn trường hợp thành phần mơi trường, thời gian nuôi cấy, nhiệt độ pH yếu tố ảnh hưởng nhiều đến sinh tống hợp enzyme nấm Các yếu tố có thê điều chinh dê làm tăng sinh trường, suất hàm lượng chất có hoạt tính sinh học Dưới đây, kháo sát ảnh hướng số yếu tố đến khả sinh trưởng phát triển đến khả sinh tống hợp enzyme acetyl(xylan) esterase chùng nấm lựa chọn 3.3.1 Co’ chất căm ứng sinh tổng họp acetyl(xylan) esterase Đế khảo sát chất cảm ứng thích hợp cho sinh tồng hợp acetyl(xylan) esterase cùa chủng Alternaria sp SP66, tiến hành nuôi lắc môi trường sử dụng chất khác bao gồm: bã ngô (BN), mùn gồ (MG), rơm (RR), Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 23 oliu(Olv),triglyceride (Tri) đối chứng (ĐC), 25°C,200 vòng/phút, 27 ngày Kết quă thể biểu đồ sau: • • ,.T,Thự_yiên Viên Đai hoc Mợ Hà Nơi A, _ , _ Biêu 1: Hoạt tính sinh acetyl(xylan) esterase cua chúng nâm Alternariasp SP66 điều kiện môi trường bố sung chất khác nhau: bã ngô (BN), mùn gỗ (MG), rơm (RR), oliu (Olv), triglyceride (Tri) đối chứng (ĐC) Kết thử nghiệm môi trường nuôi cấy lỏng cho thấy, nguồn carbohydrate có ảnh hưởng khác đến sinh tơng hợp acetyl(xylan) esterase cùa chủng Nguồn cacbohydrate thô rơm, mùn gồ bã ngô cho thấy cảm ứng sinh enzyme mạnh Theo đó, hoạt độ acetyl(xylan) esterase tăng dần theo thời gian giá trị cao đạt tới 131,9U/Ltrong môi trường 2% rơm sau 12 ngày nuôi cấy lắc, hoạt độ acetyl(xylan) esterase cao xác định suốt trình sinh trưởng mùn gồ với hoạt tính ~125,4U/L sau giám dần.Đáng ý, chùng Altemaria sp SP66 gần không biếu hoạt tính enzyme mơi trường bổ sung 2% chất olive môi trường bổ sung chất triglyceride (phần ester có nhiều dầu thực vật) hoạt tính enzyme đo hoạt độ cao 73,2U/L Qua thí nghiệm, chúng tơi chọn môi trường chất rơm đế thực bước Hà Thị Như Quỳnh CNSH 11.04 24 nghiên cứu Vì mơi trường rơm, khả sinh tơng hợp enzyme acetyl(xylan) esterase chùng nấm Alteniaria sp SP66 tương đối cao rơm nguồn chất giàu lignocellulose dề kiếm, giá thành rẽ 3.3.2 Điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp cho lên men sinh tống họp enzynieboi chủng nấm Alternaria sp SP66 Nhiệt độ pH yếu tố quan trọng ành hưởng trực tiếp đến khả sinh trường phát triến đến khả sinh trưởng phát triển nấm, định hiệu suất q trình lên men • Nhiệt độ Đối với chủng nấm dải nhiệt độ thích hợp cho phát triển chúng thường nằm khoảng từ 28 - 35°c Đe đánh giá xác ánh hướng nhiệt độ đến sinh tống hợp enzyme acetyl(xylan) esterase chúng nấm Alternaria sp SP66, chúng tơi tiến hành thí nghiệm ni cấy chúng mơi trường lên men lỏng có bổ sung 2^j:qrn tạicá